專利名稱：一種檢測鴨群體中屠體性狀的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及檢測鴨群體中屠體性狀的方法及試劑
品.O
背景技術(shù)：
屠體性狀一直都是畜牧業(yè)生產(chǎn)中重要的經(jīng)濟性狀，也是肉鴨品種選育中的重要指 標。長期以來，肉鴨屠體產(chǎn)量得到了顯著的增加，主要歸功于遺傳選育。而隨著家禽生產(chǎn)性 狀相關(guān)的遺傳學(xué)研究的深入，大量的性狀已經(jīng)定位到染色體上較小的區(qū)間，為候選基因的 研究以及后續(xù)遺傳標記輔助育種的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。SNP(Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)主要是指在基因組 DNA序列上發(fā)生的單個核苷酸堿基的變異，包括(1)轉(zhuǎn)換(Transition)，是指同型堿基(嘌 呤與嘌呤，或嘧啶與嘧啶)之間發(fā)生的變化，如G/A，T/C;(2)、顛換(Transversion)，是指 嘌呤與嘧啶之間發(fā)生的變化，如A/T，A/C，G/T，G/C ； (3)插入或缺失突變(Insertion and Deletion, InDel)。在基因組中含有大量的SNP，禽類基因組大約100個堿基存在一個SNP， 由于其分布廣泛，同時適合大量快速篩查和基因分型分析，SNP標記已廣泛的應(yīng)用于基因定 位、序列進化分析等研究，對在農(nóng)業(yè)動物中進行的分子標記輔助育種選擇也有巨大的促進 作用。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(Insulin-like Growth Factor bindingprotein 7，IGFBP7)是IGFBP超家族的一個成員，該基因家族的一個特點是編碼蛋白質(zhì)的N末端具有 高度的相似性。IGFBP7能結(jié)合IGF-I、IGF-II和胰島素，但親和力相對較低[Oh Y5Nagalla SR, Yamanaka Y, Kim H-S, Wilson EM, Rosenfeld RG. Synthesis andcharacterization of insulin-like growth factor-binding protein(IGFBP-7). J Biol Chem(1996)271 30322-30325]，同時在衰老和腫瘤抑制中也發(fā)揮著功能[Sprenger CC，Damon SE，Hwa V, Rosenfeld RG, Plymate SR.Insulin-like growth factor binding protein-related protein 1(IGFBP-rP 1) is a potential tumor suppressor protein for prostate cancer. CancerRes (1999) 59 =2370-2375]。已知，IGF等激素對機體的生長起著極其重要的 調(diào)控作用，因此，將IGFBP7基因作為候選基因研究其與生長性狀(屠體性狀)的關(guān)系對肉 鴨的育種有很大的價值和意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測鴨群體屠體性狀的方法以及用于該屠體性狀 檢測的試劑盒。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)鴨的IGFBP7基因的該單倍型或其中任一 SNP作為標簽與屠體性狀具 有顯著相關(guān)的特性，可以作為鴨的遺傳標記。進而，本發(fā)明提供一種檢測鴨群體屠體性狀的方法，其是通過檢測鴨IGFBP7基因 的自 5，端第 11、97、114、216、221、367、371、390、392、400、和/或403-404位的核苷酸，來確定鴨群體的屠體性狀。所述的鴨IGFBP7基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1或2所示。如 果待測鴨為具有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的純合體，其單倍型基因型為HlHl ；如果待 測鴨為具有SEQ ID Nol和2所示核苷酸序列的雜合體，其單倍型基因型為H1H2 ；如果待測 鴨為具有SEQ IDNo. 2所示核苷酸序列的純合體，其單倍型基因型為H2H2。在心重和腹脂重中；H2H2基因型群體性狀均值大于HlHl和HlHl基因型群體性狀 均值，H2H2型為優(yōu)勢基因型；而在其他不同的屠宰分割性狀性狀中，則HlHl基因型群體性 狀均值均大于H1H2和H2H2基因型群體性狀均值，HlHl型為優(yōu)勢基因型。因而所述基因型 可作為鴨群體屠體性狀育種的輔助選擇標記。上述SNP位點可以通過擴增該段序列直接進行測序檢測，或者用特異探針檢測。 本發(fā)明進一步包括用于鴨IGFBP7基因的自5，端第11、97、114、216、221、367、371、390、392、 400、403-404位的核苷酸鑒定的探針或引物。在本發(fā)明實施例中，優(yōu)選的鑒定引物的核苷酸序列如SEQ IDNo. 3和4所示。用該引物鑒定的方法是以待測鴨的基因組DNA為模板，用所述引物進行PCR擴 增，得到的PCR產(chǎn)物即為序列表的序列1或序列表的序列2所示的DNA片段。序列1和 序列2所示DNA片段存在10個核苷酸的差異和1個插入缺失突變，序列1所示DNA片段 自 5，端第 11、97、114、216、221、367、371、390、392、400、403-404 位核苷酸組成的單倍型為 CGTTGCGCCA (缺失CA)，序列2相應(yīng)單倍型為TACGATATTT (插入CA)。以上所述的方法，待測鴨具體可為CAU北京鴨資源家系的個體，更具體可為CAU北 京鴨資源家系的F2代個體。以上所述的方法，屠體性狀具體可為屠宰前活重、屠體重、半凈膛、全凈膛、腿重、 肝重、肌胃重和翅重、腿肌重、脛蹼重、頭重和心重。本發(fā)明還包括含有上述探針或引物的試劑盒。當該試劑盒包含上述引物時，其還 可以包括以下試劑中的一種或多種PCR緩沖液、Mg2+、DNA聚合酶、dNTPs。本發(fā)明提供的方法和試劑盒可進行輔助育種，快速準確的輔助篩選，具有早期篩 選、節(jié)省時間、成本低廉、準確性高的優(yōu)點。


圖1為PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜示意圖；M IOObp Marker ； 1-6泳道CAU北京鴨資 源家系的6個不同個體；CK 空白對照。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。CAU北京鴨資源家系由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)李寧教授課題組建立的用于定位研究 影響鴨重要經(jīng)濟性狀QTL、尋找克隆主效基因的F2雜交實驗群體，親本分別為北京鴨 IV系(肉用型)和V系(蛋用型)；資源群體參考文獻Yinhua Huang, Yonghui Zhao, Chris S. Haley, Shengqiang Hu, Jinping Hao, Changxin Wu and Ning Li. [A Genetic andCytogenetic Map for the Duck (Anas platyrhynchos)]. Genetics 173 :287_296(May
42006)。實施例1由于鴨的全基因組序列未測，根據(jù)QTL初步定位結(jié)果，通過比較基因組學(xué)分析，獲 得已測序的鳥類——雞染色體上的同源區(qū)域，分析這一區(qū)域的基因信息可以找到一些基因 作為影響鴨屠體性狀的候選基因進行深入研究，再通過文獻檢索分析，我們選擇了能結(jié)合 IGF和胰島素的IGFBP7基因作為候選基因。根據(jù)已公布的雞IGFBP7基因序列(NC_006091)，比對得到鴨IGFBP7基因序列，并 對其結(jié)構(gòu)進行分析。針對序列設(shè)計引物(正向引物5' -ACTAAAACAGAGGTGGTCCTTC-3‘； 反向引物5 ‘ -GAAAAGGAGCGAGTGTTAGAAC-3 ‘)，對CAU北京鴨資源家系Fl代個體進行測 序分析，查找SNP。我們發(fā)現(xiàn)在第四外顯子及相鄰的第三、四內(nèi)含子部分序列富含SNP，且組 成了一致的單倍型。利用試劑盒檢測資源群體F2代個體，進行基因型判定，并與屠體性狀 進行關(guān)聯(lián)分析，分析其作為標記輔助育種的價值。一、IGFBP7基因在F2代個體中的序列分析實驗材料CAU北京鴨資源家系F2代個體，224個樣本。1、基因組DNA的提取鴨7周齡時翅靜脈采血，抗凝處理后裂解，經(jīng)蛋白酶K消化后，用酚仿抽提，TE溶 解-20°C保存。2、利用試劑盒進行PCR擴增反應(yīng)該試劑盒包括PCR擴增的一對引物，正向引物序列為序列表中的序列3，反向引 物序列為序列表中的序列4 ；其他PCR擴增試劑。PCR反應(yīng)體系(20 μ 1)模板2 μ 1 (40ng步驟1提取的基因組DNA)，擴增緩沖液 (10Xbuffer) 2 μ 1，IOmM dNTP 1 μ 1，正向引物 0. 3pm/ul，反向引物 0. 3pm/ul, DNA 聚合酶 (TaqE，高保真)0. 2 μ 1，加水補至20 μ 1。PCR 反應(yīng)條件94°C、3min 預(yù)變性；94°C、30sec，60°C、30sec，72°C、30sec，35 循環(huán)； 72°C、7min 延伸。PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠(見圖1)，CAU北京鴨資源家系F2代個體均得到一 條清晰的PCR擴增產(chǎn)物，大小約500bp (實際為497bp)，回收目的DNA片段。3、測序分析分別將各樣本PCR產(chǎn)物純化回收片段進行測序。結(jié)果表明(表1)，此段序列區(qū) 間存在15個SNP和1個插入缺失突變(InDel)，其中最小等位基因頻率(Minor Allele Frequency, MAF)大于0. 01的SNP有10個，和1個InDel (加粗、斜體顯示)。表1鴨IGFBP7基因測序獲得的SNP信息 同時這11個SNP在F2代個體中組成了一致的單倍型，Hl :CGTTGCGCCA (缺失CA)； H2 :TACGATATTT (插入CA)。單倍型基因型頻率和單倍型頻率見表2，可見，HlHl和H1H2為 兩種主要的單倍型基因型。表2IGFBP7單倍型組成的基因型頻率和單倍型頻率 二、關(guān)聯(lián)分析采用SAS(9.0版)統(tǒng)計分析軟件包的PR0C_GLM(廣義線性模型)過程進行統(tǒng)計分 析，對供試鴨群體的基因型和屠體性狀進行方差統(tǒng)計分析。
統(tǒng)計分析模型Yijkl = μ +G^Sj+H^F^e,^Yijkl為個體的表型性狀(屠體)觀察值；μ為群體均值；Gi為基因型對表型性狀的效應(yīng)值；Sj為性別對表型性狀的效應(yīng)值；Hk為不同批次對表型性狀的效應(yīng)值；F1為家系對表型性狀的效應(yīng)值；eigkl為對應(yīng)于觀察值的隨機殘差效應(yīng)。分析結(jié)果見表2。表2IGFBP7基因不同單倍型組成的基因型與鴨群體屠體性狀的最小二乘均數(shù) 注上標a、b表示差異顯著(P < 0. 05)產(chǎn)β表示差異極顯著(P < 0. 01)其中在屠宰前活重、屠體重、半凈膛、全凈膛、腿重、肝重、肌胃重和翅重中，HlHl型 對H1H2型達到差異顯著(P <0.05)；在腿肌重、脛蹼重和頭重中，HlHl型對H1H2型達到差 異極顯著(P <0.01)；在心重中，H2H2型對HlHl和H1H2型都達到差異極顯著(P < 0. 01)。同時分析結(jié)果表明在心重和腹脂重中；H2H2基因型群體性狀均值大于HlHl和 HlHl基因型群體性狀均值，H2H2型為優(yōu)勢基因型；而在其他不同的屠宰分割性狀性狀中， 則HlHl基因型群體性狀均值均大于H1H2和H2H2基因型群體性狀均值，HlHl型為優(yōu)勢基因 型。這些SNP位點組成的單倍型，或者挑選其中任一 SNP做標簽，可以作為一個遺傳標記， 應(yīng)用于鴨屠體性狀的分子遺傳標記輔助選擇，提高肉鴨的選種速度和育種準確性。
權(quán)利要求
一種檢測鴨群體屠體性狀的方法，其通過檢測待測鴨IGFBP7基因的自5’端第11、97、114、216、221、367、371、390、392、400、和/或403 404位的核苷酸，來確定鴨群體的屠體性狀。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述IGFBP7基因的核苷酸序列如SEQID No. 1或2所示。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，如果待測鴨為具有SEQID No. 1所示核 苷酸序列的純合體，其單倍型基因型為HlHl ；如果待測鴨為具有SEQ ID Nol和2所示核苷 酸序列的雜合體，其單倍型基因型為H1H2;如果待測鴨為具有SEQ ID No. 2所示核苷酸序 列的純合體，其單倍型基因型為H2H2。
4.用于鑒定鴨IGFBP7 基因的自 5，端第 11、97、114、216、221、367、371、390、392、400 或 403-404位的核苷酸的探針。
5.用于鑒定鴨IGFBP7 基因的自 5，端第 11、97、114、216、221、367、371、390、392、400 或 403-404位的核苷酸的引物。
6.如權(quán)利要求5所述的引物，其為Pf :ACTAAAACAGAGGTGGTCCTTCPr :GAAAAGGAGCGAGTGTTAGAAC。
7.含有權(quán)利要求4所述探針或含有權(quán)利要求5或6所述引物的試劑盒。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，但該試劑盒包含權(quán)利要求5所述的引物 時，其還包括以下試劑中的一種或多種PCR緩沖液、Mg2+、DNA聚合酶、dNTPs。
9.權(quán)利要求4所述的探針、權(quán)利要求5或6所述的引物或權(quán)利要求7或8所述試劑盒 在鴨選育中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測鴨群體中屠體性狀的方法及試劑盒。本發(fā)明提供的檢測鴨群體中屠體性狀的方法是檢測鴨IGFBP7基因的SNP所組成的單倍型，判定待測鴨樣本的單倍型基因型，以確定其屠體性狀。本發(fā)明所提供的試劑盒，包括特異擴增IGFBP7基因的PCR擴增引物及其他PCR擴增試劑。本發(fā)明方法及試劑盒操作簡單快捷，結(jié)果穩(wěn)定可靠，用于輔助育種篩選，具有早期篩選、節(jié)省時間、成本低廉、準確性高的優(yōu)點，在肉鴨育種實踐中將有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/68GK101892316SQ201010234950
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者吳非, 李寧, 黃銀花 申請人:李寧