專利名稱：與鴨6周齡體重性狀連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記、其試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及與鴨6周齡體重性狀連鎖的微衛(wèi)星標(biāo) 記、其檢測試劑盒及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星又稱為簡單序列重復(fù)(Sample Sequence R印eats，SSR)，一般以1-6個堿 基為核心序列，首尾相連組成的串聯(lián)重復(fù)序列。這種序列存在于幾乎所有真核生物的基因 組中，基因的間隔區(qū)和內(nèi)含子以及外顯子和調(diào)控區(qū)均有微衛(wèi)星的分布。不同物種中，微衛(wèi)星 序列的含量各不相同，真核生物平均每50-150kb就存在一個微衛(wèi)星位點，人類基因組中每 間隔6kb存在一個微衛(wèi)星位點，鳥類基因組中則每間隔20-39kb存在一個微衛(wèi)星位點。并 且各種微衛(wèi)星序列的豐度在不同物種中也各不相同。例如，在人類及哺乳類動物基因組中， 最豐富的微衛(wèi)星序列是(AC)n;而在植物基因組中則以(AT)n最多。在真核生物基因組中， 二核苷酸微衛(wèi)星序列最為豐富，三核苷酸微衛(wèi)星的序列含量比二核苷酸微衛(wèi)星序列大約低 10倍，而四核苷酸微衛(wèi)星的微衛(wèi)星序列則相對較少。與其它分子標(biāo)記相比，微衛(wèi)星標(biāo)記具有以下特點(1).廣泛隨機(jī)分布于真核生物 基因組中，外顯子和內(nèi)含子皆有分布；(2).可根據(jù)微衛(wèi)星兩側(cè)的保守性側(cè)翼序列設(shè)計引 物，通過PCR擴(kuò)增檢測其多態(tài)性；(3).高度多態(tài)，信息含量高；(4).進(jìn)化上分離時間短的 物種間微衛(wèi)星側(cè)翼序列保守性較高，如Reed等用雞的特異性微衛(wèi)星引物擴(kuò)增火雞基因組， 54%的引物具有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(5).共顯性遺傳；(6).微衛(wèi)星的序列一般較短，即使是部分 降解的DNA也可能有足夠用來擴(kuò)增的微衛(wèi)星序列，這一點更優(yōu)于RAPD和更長目的基因序列 的VNTR，因而在古DNA的研究及法醫(yī)學(xué)鑒定中具有重要的應(yīng)用價值；(J).隨著毛細(xì)管電泳 技術(shù)及相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，全自動化的大規(guī)模基因型分析已成為可能。自1974年Skirmer等首先發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星以來該標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于生物進(jìn)化、遺傳 學(xué)鑒定、種質(zhì)資源分析及遺傳圖譜的構(gòu)建、功能基因和數(shù)量性狀的定位等研究。目前，尋找 微衛(wèi)星位點的方法主要有以下三種(1).基因組文庫法目前用于微衛(wèi)星研究的基因組文 庫分為三類小插入片段文庫、大插入片段文庫及染色體特異文庫。小插入片段文庫由于 便于后續(xù)微衛(wèi)星結(jié)構(gòu)的研究，得到廣泛應(yīng)用。小片段插入文庫中的插入片段大小一般為 200-600bp，具體做法是用幾種限制性內(nèi)切酶消化總DNA，然后用瓊脂糖凝膠分離酶切片 段，回收200-600bp的片段，再與相應(yīng)的載體連接并轉(zhuǎn)化特異菌系，應(yīng)用標(biāo)記了放射性元素 的核心重復(fù)序列探針，通過放射性雜交篩選含有目標(biāo)重復(fù)序列的陽性克隆，最后測定陽性 克隆的序列克隆微衛(wèi)星位點。(2).比較基因組學(xué)研究方法隨著人類基因組計劃測序工作 的完成及其它重要經(jīng)濟(jì)性狀動植物基因組計劃地開展，生物學(xué)家將對模式生物的分子遺傳 學(xué)基礎(chǔ)有更深刻地認(rèn)識和了解，如何利用模式生物的大量生物信息、借助于比較基因組學(xué) 的研究方法進(jìn)行其它物種動植物的分子遺傳學(xué)研究將是本世紀(jì)生物學(xué)的重要研究內(nèi)容，微 衛(wèi)星標(biāo)記的分離也不例外，豬、牛、雞等重要經(jīng)濟(jì)動物大量微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選為相近物種及 多種物種通用微衛(wèi)星標(biāo)記的分離提供了可能。該方法應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記較多的物種進(jìn)行相近物種的PCR擴(kuò)增，從中篩選出一些具有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物、擴(kuò)增片段大小與原物種接近的多 態(tài)位點，而對于擴(kuò)增片段大小與原物種有差異的物種通過測序后分析是否是多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo) 記。該方法的優(yōu)點是可篩選出一些通用于某些物種進(jìn)化研究及構(gòu)建比較遺傳圖譜的多態(tài)微 衛(wèi)星標(biāo)記。體重是鴨質(zhì)量性狀中重要的一項，它能夠反應(yīng)禽類的生長發(fā)育狀況，對養(yǎng)殖至關(guān) 重要。對鴨體重這一性狀的微衛(wèi)星標(biāo)記，能夠為輔助育種提供有效參數(shù)，提高育種效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與鴨6周齡體重(W6)性狀連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記、其檢測試 劑盒及應(yīng)用。本發(fā)明通過設(shè)計微衛(wèi)星引物并熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物，利用PCR擴(kuò)增得到不同長 度的微衛(wèi)星片段，在ABI測序儀GS-RUN-360-P0P4default module下電泳，電泳結(jié)果用 GenesScan3. 7和Genemapper分析擴(kuò)增片段大小，利用Crimap2. 4軟件構(gòu)件基因遺傳連鎖圖 譜。在構(gòu)建的基因遺傳圖片的基礎(chǔ)上，用Haley回歸區(qū)間定為法對重要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行QTL 定位，定位采用模型為y = μ +P (Q | M) [CalA+CdlD] +e其中μ為群體平均數(shù)；P(Q|M)為已知標(biāo)記基因型時，QTL標(biāo)記基因型的概率；Cal為群體中第i個個體在給定座位的加性組分的回歸系數(shù)；A為QTL的加性效應(yīng)；Cdl為群體中第i個個體在給定座位的顯性組分的回歸系數(shù)；D為QTL的顯性效應(yīng)；e為殘差效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由引物SEQ ID No. 2&3標(biāo)志的微衛(wèi)星標(biāo)記與6周齡體重(W6)性狀相連 鎖。進(jìn)而，本發(fā)明提供用于鴨6周齡體重(W6)篩選的微衛(wèi)星標(biāo)記，其中優(yōu)勢等位基因為SEQ ID No. 1所示的微衛(wèi)星標(biāo)記。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于擴(kuò)增上述微衛(wèi)星標(biāo)記的引物。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中 所述引物序列為Pf:TGGTGCGATGAGCTGAGAT,Pr GCTTTAGTTTTTCAATTAGGTG 進(jìn)一步，本發(fā)明還提供含有上述引物的試劑盒。該試劑盒還進(jìn)一步包括以下試劑 中的一種或多種PCR緩沖液、Mg2+、DNA聚合酶、dNTPs。本發(fā)明微衛(wèi)星標(biāo)記及試劑盒可用于鴨的輔助育種，快速準(zhǔn)確的輔助篩選，具有早 期篩選、節(jié)省時間、成本低廉、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。隨機(jī)采自北京金星鴨業(yè)中心的15個鴨群體(A-O)的各40個鴨個體血樣，群體包 括2個北京鴨保種群體M和N，2個從英國櫻桃谷公司引進(jìn)的櫻桃谷鴨品系(C、D)，11個北 京鴨人工選育品系(A、B、E-L、0)實施例1微衛(wèi)星標(biāo)記與體重性狀的關(guān)聯(lián)1、引物信息5，端標(biāo)記有HEX或FAM亞磷酸酰胺熒光基團(tuán)的引物表1 2.禽血的采取及處理鴨廠采集到15個家系共約650個個體的純種北京鴨血液樣品，翅靜脈采血，每一 個體采取0. 5ml血樣，加入0. 2ml抗凝劑，充分混勻。常溫帶回實驗室后，以1 9比例加 入禽血裂解液，常溫裂解抗凝血48小時后_20°C保存?zhèn)溆谩?..鴨基因組DNA的提取(1)取0. 4ml裂解血(Iml血液加9ml禽血裂解液)放入1. 5ml離心管中，視情況 補(bǔ)加TE稀釋；(2)加入蛋白酶k至終濃度200 μ g/ml，混勻，55°C水浴消化24_36小時，視情況補(bǔ) 加蛋白酶K，繼續(xù)消化；(3)加入等體積Tris飽和酚，輕搖lOmim，12000rpm離心IOmin ；(4)將上清轉(zhuǎn)移至新離心管中；(5)用等體積的酚氯仿(1 1)和氯仿各抽提一次；(6)上層水相加入1/10體積乙酸鈉(pH5. 2)和2倍體積無水乙醇沉淀DNA，室溫 沉淀Imin左右至致密的絮狀DNA出現(xiàn)；(7)用干凈的Tip槍頭把DNA挑出放入新離心管，用70%的乙醇洗滌DNA沉淀兩 次，真空抽干后加入100-200 μ 1 TE (ΡΗ8. 0)溶解DNA ；(8)0. 7%的瓊脂糖電泳初步檢測濃度和純度，將各樣品DNA濃度稀釋至20nG/ μ I。4. PCR 擴(kuò)增對于上面提及的各對微衛(wèi)星熒光引物分別進(jìn)行PCR反應(yīng)條件(退火溫度Tm)的確 定，個別引物過去所摸索的條件并不理想，所以需要重新進(jìn)行梯度PCR反應(yīng)確定一個合適 的退火溫度。條件確定后再進(jìn)行大規(guī)模鴨群體PCR掃描。PCR 反應(yīng)體系(15 μ 1)上游引物(IOmM)0. 5 μ 1下游引物(IOmM)0. 5 μ 1dNTP(IOmM)1. 2μ 1
10XPCR Buffer1. 5μ 1Taq 酶0. 3 μ 1模板(20ng/μ 1)2. 0 μ 1dd H2O9· 0 μ 1反應(yīng)條件開始，94°C預(yù)變性5min ；中間，94°C 30S，58. 1°C 30S，72°C 35S，共 35 個循環(huán)；最后， 72 0C延伸7min，4V保存。反應(yīng)于96孔板中進(jìn)行，應(yīng)做陰性對照。5.用試劑盒進(jìn)行基因型分析該試劑盒包括PCR擴(kuò)增引物一對(SEQ ID No. 2&3)，PCR擴(kuò)增酶，限制性內(nèi)切酶 HaeIII和RsaI及其緩沖液。根據(jù)標(biāo)記在引物5’端熒光的差異、擴(kuò)增片段的大小以及盡量避免引物間的配對， 將引物對放在一個組中，PCR產(chǎn)物按引物名稱根據(jù)片段大小及所加熒光標(biāo)記顏色差別進(jìn)行 的組合。用滅菌的去離子水稀釋PCR產(chǎn)物3-10倍，取1 μ 1稀釋產(chǎn)物，加入10 μ 1去離子 甲酰胺，0. 15 μ lGenescan-350R0XTM 或 Genescan_500R0XTM，充分振蕩混勻后在 3100 測序 儀 GS-RUN-36-P0P4default Module 下(D 系統(tǒng))電泳 36-44 分鐘。應(yīng)用 Genescan 3. 7 及 Genemapper 1. 1軟件分析PCR擴(kuò)增片段大小，人工校正后用Genepop 3. 4、Cervus 2. 0軟 件分析各個家系各個位點基因型相關(guān)信息。擴(kuò)增序列的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其中5，起40 256區(qū)域為核心區(qū)。表2基因型分析結(jié)果
片段大小 NO. OHet EHet PIC_Repeat_
121-388 6 062 053 05 (TTTCCCTCTTTC)n
表中“No., OHet, Ehet, PIC”分別表示“位點等位基因數(shù)，實際雜合度、理論雜合度和信 息含量”6.子代性狀篩選對每一批預(yù)選留子代詳細(xì)記錄6周齡體重。篩選6周齡體重大的鴨傳種。結(jié)果表 明，在篩選后的北京鴨后代群體在基因組水平得到了改善，優(yōu)勢等位基因頻率得到了不同 程度的提高。結(jié)果如下表
群體內(nèi)優(yōu)勢優(yōu)勢等位基因頻率群體內(nèi)等位基因數(shù)等位基因(bp) 篩選前 篩選后 篩選前篩選后
2310.9330.960 64
權(quán)利要求
與鴨6周齡體重性狀連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記，其為以下引物的擴(kuò)增產(chǎn)物PfTGGTGCGATGAGCTGAGAT，PrGCTTTAGTTTTTCAATTAGGTG。
2.如權(quán)利要求1所述的微衛(wèi)星標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
3.用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述微衛(wèi)星標(biāo)記的引物。
4.如權(quán)利要求2所述的引物，其為 Pf TGGTGCGATGAGCTGAGAT,Pr :GCTTTAGTTTTTCAATTAGGTGo
5.含有權(quán)利要求3或4所述引物的試劑盒。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其還包括以下試劑中的一種或多種PCR緩沖液、Mg2+、 DNA 聚合酶、dNTPs。
7.權(quán)利要求1或2所述微衛(wèi)星標(biāo)記、權(quán)利要求3或4所述引物或權(quán)利要求5或6所述 試劑盒在鴨選育中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了與鴨6周齡體重性狀連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記、其檢測試劑盒及應(yīng)用，本發(fā)明微衛(wèi)星標(biāo)記，是引物對SEQ ID No.2&3的擴(kuò)增產(chǎn)物，其優(yōu)勢基因型如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明微衛(wèi)星標(biāo)記及試劑盒可用于鴨的輔助育種，快速準(zhǔn)確的輔助篩選，具有早期篩選、節(jié)省時間、成本低廉、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點。
文檔編號C12N15/11GK101921750SQ20101023496
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者吳非, 李寧, 黃銀花 申請人:李寧