專利名稱：一種干酪乳桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種干酪乳桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
國際營養(yǎng)學(xué)界給“益生菌”的定義是指一類有益人類健康的腸道生理細(xì)菌，還常 被描述為“良性”或“健康”的細(xì)菌。它包括保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙岐桿菌、嗜酸 乳桿菌、唾液乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌等細(xì)菌。應(yīng)用于人體的益生菌產(chǎn)品有益生菌發(fā)酵的乳制 品、肉制品、果蔬制品等，醫(yī)藥保健行業(yè)。乳酸菌是益生菌中的主要一類，具有抗腫瘤、緩解 乳糖不耐癥、增強(qiáng)免疫力、降低膽固醇、調(diào)整腸道菌群等生理作用。乳酸菌主要用于發(fā)酵肉 制品、發(fā)酵水產(chǎn)品等發(fā)酵食品的生產(chǎn)中，抑制了腐敗菌和致病菌的生長及毒素的產(chǎn)生，使發(fā) 酵食品的保存期大大延長，有利于儲(chǔ)藏和流通，食用安全性更好，營養(yǎng)成分更豐富。微囊藻毒素(MCs)是由富營養(yǎng)化水體中的銅綠微囊藻、水華魚腥藻、念珠藻等藍(lán) 藻產(chǎn)生的一種環(huán)狀七肽物質(zhì)。微囊藻毒素以動(dòng)物肝臟為作用靶器官，能夠特異性地抑制蛋 白磷酸酶活性從而誘發(fā)癌癥等一系列病變。由于毒性強(qiáng)、在食物鏈中波及范圍廣以及具有 鮮明的地域特征，微囊藻毒素日益成為危害人類健康的重要?dú)⑹?。目前，干預(yù)MCs的手段可 分為物理防治、化學(xué)防治以及生物防治。其中，微生物處理法中部分益生菌對(duì)MCs的干預(yù)作 用因其安全性(GRAS)而成為真正能夠?qū)崿F(xiàn)在清除MCs過程中與水源、食品“零距離”接觸的 生物防治劑。同時(shí)，由于益生菌定殖人體腸道后在抑制有害微生物生長、提高人體免疫力、 協(xié)助消化和營養(yǎng)吸收等諸多方面發(fā)揮的長期功效，使得益生菌作為體內(nèi)MCs “清道夫”的價(jià) 值更加突出。近年來，國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，食用活性乳酸菌食品具有減少人體血清中膽固醇 的能力，這個(gè)結(jié)論已被大量的體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。1974年，Marm和Spoerry發(fā)現(xiàn)，非 洲Masai人大量飲用由乳桿菌發(fā)酵的乳制品，其體內(nèi)血清膽固醇含量普遍較低。1977年， Gilliland對(duì)腸道乳桿菌的降膽固醇作用進(jìn)行了研究，提出了乳酸菌在生長過程中通過降 解膽鹽促進(jìn)膽固醇的分解代謝，從而降低膽固醇含量的觀點(diǎn)。盡管乳酸菌降低培養(yǎng)基中膽 固醇含量、減少人和動(dòng)物血清膽固醇含量的益生作用得到了大量的證實(shí)，但具體的機(jī)理至 今尚無定論。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株干酪乳桿菌BBE10-212 (Zacio^ciBw1S casei BBE-212)，已 于2010年6月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2010163， 地址中國武漢武漢大學(xué)，其分類學(xué)命名為干酪乳桿菌BBE10-212 (Zacto如以7ΛΛ5 casei BBE-212)；其16SrDNA序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO: 1所示，以其16SrDNA全序列為基 礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹如說明書附圖1所示。本發(fā)明提供了一種所述干酪乳桿菌的應(yīng)用，將培養(yǎng)好的干酪乳桿菌用于清除藻毒
ο
為解決上述技術(shù)問題，將培養(yǎng)好的干酪乳桿菌調(diào)整菌濃的比例至IO8CFU Hir1-IO1c1CFUmr1之間，接種至藻毒素濃度范圍為IOOyg L^1-IOOOyg L—1之間的溶液中，置 于37°C搖床(150r mirT1)避光培養(yǎng)。 所述干酪乳桿菌為從泡菜、臘腸等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選，其保藏條件如下從生長 良好的平板上取2-3環(huán)益生菌移入MRS培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)20h，取0. 7mL移入盛有 0. 3mL無菌甘油的甘油管中，放_(tái)70°C冰箱保存。所述MRS培養(yǎng)基為葡萄糖20g ΙΛ蛋白胨10 g L—1，牛肉膏IOg L—1，酵母浸出 汁SgL—1，無水乙酸鈉5g L—1，磷酸二氫鉀2g L—1，檸檬酸三銨2g L-1，MgSO4 · 7Η20 0. 2g L-1， MnSO4 · H2O 0. 05g Λ Tween-801 mL Λ pH 5. 5。所述干酪乳桿菌培養(yǎng)條件為將甘油管保藏的益生菌接入MRS液體培養(yǎng)基，在 37°C靜置培養(yǎng)20h至對(duì)數(shù)中后期，以2%接種量取-70°C甘油貯存液接種于MRS培養(yǎng)基中， 37 °C靜置培養(yǎng)20h。在微囊藻毒素濃度為1000 μ g Γ1的條件下，IO9CFU mL—1的菌體與之共培養(yǎng)24h 后，降解率高達(dá)到20% (圖2)。在微囊藻毒素濃度為100 μ g L—1的條件下，菌濃為IO9CFU mL-1的菌體與之共培養(yǎng)24h后，降解率最高達(dá)到82%。在微囊藻毒素起始濃度為500 μ g Γ1 的條件下，菌濃為IO9CFU mL—1的菌體與之共培養(yǎng)24h后，降解率最高達(dá)到52%。本發(fā)明還提供了一種所述干酪乳桿菌的應(yīng)用，是用于清除膽固醇。為解決上述技術(shù)問題，將活化好的干酪乳桿菌調(diào)菌懸液濃度為3X IO9CFU mL—1。按 2%的接種量接種到含100 μ g mL—1膽固醇的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)24h。本發(fā)明自泡菜、臘腸中篩選出一株干酪乳桿菌(Lactobacillus casei) BBE10-212，該菌株既具有較高的藻毒素清除效率，又可高效地清除膽固醇。將該菌株用于 保健食品領(lǐng)域，具有可抑制有害微生物生長、提高人體免疫力、協(xié)助營養(yǎng)消化等諸多方面的 功效。


圖1 于酪乳桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹圖2 干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)BBE10-212對(duì)高濃度藻毒素的清除
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 干酪乳桿菌篩選方法從泡菜、臘腸等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中取一定樣品加入到30mL MRS培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)， 37°C培養(yǎng)20h。將培養(yǎng)液梯度稀釋，涂布于添加0.02%溴甲酚紫的MRS平板，37°C培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)48h。挑取使溴甲酚紫變色圈明顯的的單菌落。反復(fù)進(jìn)行平板劃線分離，重復(fù)三次得到 純化的單菌落，供下一步鑒定用。鑒定主要通過1)菌落特征觀察用肉眼直接觀察，挑選菌落直徑在l_3mm之間， 圓形降起，表面光滑或稍粗糙，乳白、灰白或暗黃色等符合乳酸菌菌落特征的菌株。2)個(gè)體 形態(tài)觀察用光學(xué)顯微鏡革蘭氏染色觀察。挑選革蘭氏陽性、無芽孢菌株。將滿足鑒定條件 的菌株挑出甘油管保藏。以2%接種量取-70°C甘油貯存液接種于MRS培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)。取37°C靜置培養(yǎng)20h (對(duì)數(shù)中后 期)的發(fā)酵液，離心IOmin (3200 X g，4°C)收集菌體，再用磷酸鹽緩沖 液(pH 7. 0)洗滌離心2次，調(diào)整菌濃在IO9CFU mL—1左右。將獲得的菌體重懸于含MC-LR濃 度為1000 μ gL—1的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，置于37°C搖床(150r mirT1)避光培養(yǎng)。培 養(yǎng)24h后取樣，離心IOmin (12000 X g，4°C )，取上清液用HPLC檢測(cè)MC-LR殘存濃度。通過HPLC檢測(cè)，篩選到一株具有較強(qiáng)藻毒素清除能力的菌株，通過16SrDNA序列 分析(見核苷酸序列表中SEQ ID NO :1所示)可知該菌株為干酪乳桿菌，于2010年6月28 日保藏于菌種保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2010163。實(shí)施例2 MC-LR 初始濃度為 100 μ gL—1以2%接種量取-70°C甘油貯存液接種于MRS培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)。取37°C靜 置培養(yǎng)20h (對(duì)數(shù)中后期)的發(fā)酵液，離心IOmin (3200 X g，4°C)收集菌體，再用磷酸鹽緩沖 液(pH 7. 0)洗滌離心2次，調(diào)整菌濃在IO9CFU mL—1左右。將獲得的菌體重懸于含MC-LR濃 度為IOOyg Γ1的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，置于37°C搖床(150r mirT1)避光培養(yǎng)。培 養(yǎng)24h后取樣，離心IOmin (12000 X g，4°C )，取上清液用HPLC檢測(cè)MC-LR殘存濃度。計(jì)算 獲得菌株對(duì)MC-LR的清除率為82%。所述微囊藻毒素的檢測(cè)采用高效液相的方法色譜柱AgilentZORBAX Eclipse XDB-C18 (4. 6 X 150mm, 5. 0 μ m)流動(dòng)相乙腈H2O(0. 05% TFA) =40 60 (ν/ν)進(jìn)樣量20μ 1 ；流速lmL/min ；柱溫40°C檢測(cè)器DAD238nm ；MC-LR 保留時(shí)間3· 48min實(shí)施例3 MC-LR 初始濃度為 500 μ gL—1以2%接種量取-70°C甘油貯存液接種于MRS培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)。取37°C靜 置培養(yǎng)20h (對(duì)數(shù)中后期)的發(fā)酵液，離心IOmin (3200 X g，4°C)收集菌體，再用磷酸鹽緩 沖液(pH 7.0)洗滌離心2次，調(diào)整菌濃在IO9CFU mL—1左右。將獲得的菌體重懸于含MC-LR 濃度為500 μ gL—1的磷酸鹽緩沖液(pH 7. 0)中，置于37°C搖床(150r mirT1)避光培養(yǎng)。培 養(yǎng)24h后取樣，離心IOmin (12000 X g，4°C )，取上清液用HPLC檢測(cè)MC-LR殘存濃度。計(jì)算 獲得菌株對(duì)MC-LR的清除率為52%。實(shí)施例4 MC-LR 初始濃度為 1000 μ g Γ1以2%接種量取-70°C甘油貯存液接種于MRS培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)。取37°C靜 置培養(yǎng)20h (對(duì)數(shù)中后期)的發(fā)酵液，離心IOmin (3200 X g，4°C)收集菌體，再用磷酸鹽緩沖 液(pH 7.0)洗滌離心2次，調(diào)整菌濃在IO9CFU m L—1左右。將獲得的菌體重懸于含MC-LR 濃度為IOOOyg Γ1的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，置于37°C搖床(150r mirT1)避光培養(yǎng)。 培養(yǎng)24h后取樣，離心IOmin (12000 X g，4°C )，取上清液用HPLC檢測(cè)MC-LR殘存濃度。計(jì) 算獲得菌株對(duì)MC-LR的清除率為20%。實(shí)施例5 干酪乳桿菌降解膽固醇應(yīng)用(一)含膽固醇MRS液體培養(yǎng)基先用無水乙醇配制濃度為IOg Γ1的膽固醇溶液，用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾除菌后，加入到含0. 30%牛膽酸鈉的滅菌MRS中，使膽固醇最終濃度為IOOmg L—1。( 二)發(fā)酵液的制備在MRS中連傳3代，第3代培養(yǎng)物5000r mirT1離心lOmin，棄上清液，用滅菌生理 鹽水離心洗菌3遍，調(diào)菌懸液濃度為3 X IO9CFU mL—1。按2%的接種量接種到含膽固醇的MRS 液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)24h。同時(shí)保留未接菌的含膽固醇MRS培養(yǎng)基，5°C保存，作為 空白對(duì)照。(三)鄰苯二甲醛工作液的配制50mg鄰苯二甲醛溶于IOOmL冰醋酸中，攪拌至完全溶解，制成0. 5g Γ1的工作液。 該溶液須使用當(dāng)天配制。(四)膽固醇含量測(cè)定發(fā)酵液5000r mirT1離心lOmin，保留發(fā)酵上清。沉淀菌體用與原發(fā)酵液等量的 生理鹽水離心洗滌3遍，洗滌液保留。發(fā)酵上清液和菌體洗滌液中膽固醇含量均用改良的 O-phthalaldehyde 法進(jìn)行測(cè)定。具體方法如下移取0. 5mL樣品于一潔凈試管中，加入3mL 95%的乙醇和2mL 50 %的KOH。振蕩混勻，60 V水浴中皂化IOmin。冷卻至室溫后，加入5mL正己烷，完全混 勻，萃取lmin。再加入3mL蒸餾水混勻，室溫下靜置15min。待各項(xiàng)分離后，從己烷層準(zhǔn)確 吸取2. 5mL至另一干凈試管中。60°C水浴揮干正己烷，加入4mL新配制的鄰苯二甲醛工作 液，室溫下顯色lOmin。再加入2mL濃硫酸，立即完全混勻，室溫靜置lOmin。在90min內(nèi)測(cè) 定550nm處的吸光值。膽固醇脫除率可由以下公式得出脫除率=(1-發(fā)酵上清液吸光值/未接菌培養(yǎng)基吸光值)X 100%計(jì)算得到菌降解膽固醇的脫除率為55. 19%實(shí)施例6 干酪乳桿菌高產(chǎn)膽鹽水解酶(一 )茚三酮顯色液 將茚三酮按1 %的比例溶解于0. 5M檸檬酸緩沖液(pH5. 5)中，取0. 5mL上述混合 液加入1. 2mL甘油和0. 2mL 0. 5M的檸檬酸緩沖液(pH5. 5)。( 二)酶活測(cè)定方法以2%接種量取-70°C甘油貯存液接種于MRS培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)。取37°C靜 置培養(yǎng)20h (對(duì)數(shù)中后期)的發(fā)酵液，離心IOmin (10000 X g，4°C)收集菌體，再用0. IM磷酸 鹽緩沖液(pH 6. 5)洗滌離心2次，調(diào)整菌濃在600nm下吸光度為1。取5mL上述細(xì)胞懸濁液， 超聲破碎3min(工作時(shí)間間歇時(shí)間=1 3)，隨即離心10min(10，000Xg，4°C)去除細(xì)胞 碎片，得到無細(xì)胞提取物(cell free extract，CFE)。取0. ImL上清液加入1. 8mL 0. IM磷 酸鹽緩沖液(pH 6. 5)和0. ImL結(jié)合膽鹽(200mM)中混合，并置于37°C孵育30min，取0. 5mL 上述反應(yīng)液加入0. 5mL三氯乙酸(15%，w/t)終止反應(yīng)，混合均勻，離心IOmin(10，000Xg， 4°C )取上清。將0. ImL上清液與1. 9mL茚三酮顯色液混合，震蕩混勻，沸水浴14min。冷卻 3min后測(cè)定570nm下的吸收值。測(cè)得膽鹽水解酶的比酶活為320. 18 μ mol (min mg) ―1 BSH比酶活(specific activity, SA)定義為單位時(shí)間內(nèi)、單位質(zhì)量的總蛋白中 的粗酶使結(jié)合型膽鹽水解產(chǎn)生氨基酸的物質(zhì)的量，單位ymolOiiin mgr1。
可以理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā) 明構(gòu)思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附的權(quán)利要求的保 護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)BBE10-212，保藏編號(hào) CCTCC M 2010163。
2.一種培養(yǎng)權(quán)利要求1所述干酪乳桿菌的方法，是在MRS培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)干酪乳桿菌。
3.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于優(yōu)選pH5.5;優(yōu)選培養(yǎng)溫度371。
4.權(quán)利要求1所述干酪乳桿菌的應(yīng)用，是將培養(yǎng)好的干酪乳桿菌用于微囊藻毒素的清除。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于藻毒素濃度范圍為IOOygL^1-IOOOyg L—1 的液體中，加入IO8CFU Iiir1-IO10CFU mL—1干酪乳桿菌。
6.權(quán)利要求1所述干酪乳桿菌的應(yīng)用，是將培養(yǎng)好的干酪乳桿菌用于膽固醇的降解。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)BBE10-212，保藏編號(hào)CCTCC M2010163。該菌株具有較高的藻毒素清除效率，同時(shí)該菌株又可高效地清除膽固醇。將該菌株用于保健食品領(lǐng)域，具有提高人體免疫力、協(xié)助營養(yǎng)消化等諸多方面的功效。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102108337SQ201010238658
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2010年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月28日
發(fā)明者吳重德, 堵國成, 張娟, 張茜, 畢潔, 王松, 董自星, 陳堅(jiān) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)