專利名稱：一種獲取古代動物遺傳信息的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種古代動物DNA的提取方法和獲取古代 動物遺傳信息的方法。
背景技術(shù)：
古DNA(ancient DNA, aDNA)是指從已經(jīng)死亡的古代動物的遺體和遺跡中得到的 DNA。過去的十數(shù)年間，針對古代動物的分子生物學(xué)發(fā)展迅猛，人們已經(jīng)利用動物遺骸進行 了大量的DNA提取及研究，并成功獲取了大量已滅絕動物的遺傳信息，揭示了這些滅絕動 物間的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)關(guān)系，也通過家養(yǎng)動物遺骸的遺傳信息分析獲知其馴化、分布和擴散等 信息，為人類的發(fā)展和遷徙提供了佐證?？偟膩碇v由于年代久遠，在內(nèi)外環(huán)境的影響下，古DNA具有數(shù)量少、片段短、受損 傷等特點。在保存狀態(tài)較好的情況下，每毫克古代樣品中約含2，000個長約IOObp的線粒體 DNA分子，比新鮮組織中的含量少六個數(shù)量級以上。而保存狀態(tài)一般的樣品中，古代DNA的 含量更低，僅為每毫克組織10-40個分子。古DNA已降解成短的片段，一般僅為約50-500bp 大小。動物死亡之后，DNA通常被細胞破裂釋放的核酸酶降解。特殊條件下，例如，干燥、低 溫或高鹽濃度環(huán)境中核酸酶會失活。這樣得以保存下來的遺傳物質(zhì)，還將在漫長的歷史埋 藏中經(jīng)歷緩慢的外界作用，包括溫度、濕度、紫外光等物理因素，酸、堿、金屬離子、化合物等 化學(xué)因素以及微生物侵蝕等，這些作用對古DNA造成的降解和損傷都將影響其提取和擴增 (表1)。其中堿基水解脫氨基導(dǎo)致的胞嘧啶脫氨基形成尿嘧啶、腺嘌呤脫氨基形成次黃嘌 呤是DNA損傷的主要形式。研究發(fā)現(xiàn)，DNA樣本中腺嘌呤脫氨基生成次黃嘌呤的速率僅為胞 嘧啶脫氨基速率的2-3%，因此胞嘧啶脫氨基形成尿嘧啶是DNA損傷的最主要形式。而可擴 增的古DNA大都源于線粒體DNA，線粒體DNA拷貝數(shù)高，片段較小(脊椎動物約16. 5kb)，結(jié) 構(gòu)致密(為共價、閉合的雙股螺旋)，受酶解及外界因素作用位點少而降解速度相對較慢， 因此在古代樣本中比核DNA片段更加完整和穩(wěn)定，常被選為古DNA研究的目標。古DNA研究中很關(guān)鍵的一個問題就是所獲得遺傳信息的可靠性。此可靠性是指， 用PCR方法從含古DNA的抽提液中擴增所得到的DNA序列是真正的目的DNA，而不是被污 染的外源DNA或受損傷的模板DNA。目前外源污染的威脅主要還是存在于對人類遺骸的研 究中，因為現(xiàn)代人類的DNA在實驗室及博物館都相當普遍且不能輕易與古代DNA區(qū)分開來。 而對動物遺骸進行研究時，在操作環(huán)境和實驗流程都能嚴格遵循前人成功經(jīng)驗標準的前提 下，其真實序列信息獲取的最大干擾則是受損傷模板的存在。表1古代DNA損傷類型一覽表(引自Paabo，et al.，2004)
4對DNA的影響 可能的解決辦法
損傷類型
作用機理
鏈斷裂
微生物作用、生物死后細胞核酸海的裂 解和其他的生化過程
氧化損傷
堿基損傷
脫氧核糖核苷酸的損傷
DNA鏈交聯(lián)
烷基化或DM互作以及DNA與其他生化 大分子作用
脫氨基作用(錯配損傷) 1)腺嘌呤adenine—次黃嘌呤
水解作用 hypoxanthine；
DNA量減少、片 段大小縮短和 污染物被擴增 阻礙PCR合成酶 作用，產(chǎn)生嵌合 序列(跳躍PCR)
核苷酸被修飾 而使擴增合成 出錯
Maillard 產(chǎn)物 或污染物被擴 增
影響擴增過程 中DNA的正確合
PCR擴增重疊的短片 段
多次獨立PCR擴增， 并分別進行多克隆測 序
多次獨立PCR擴增， 并分別進行多克隆測 序
PTB (N-phenylacyl thiazolium bromide) 處理
多次獨立PCR擴增， 并分別進行多克隆測
2)胞嘧啶cytosine—尿嘧啶uracil 成 序 _3)胸腺嘧啶guanine—黃嘌呤xanthine_保存在博物館和研究所里的絕大多數(shù)古代材料都已受到了不同程度的污染，去污 染是一個必不可少的步驟。常見方法有打磨樣品表面、用等離子體處理骨骼樣品、用化學(xué)試 劑去除樣品表面的雜質(zhì)DNA分子、紫外線照射去除污染DNA等，為確保污染的清除，經(jīng)常同 時使用多種去污染手段處理樣品。目前，人們也在積極尋找更為簡便高效的去除樣品污染 的方法，本發(fā)明中對此環(huán)節(jié)不作過多闡述。DNA的常見提取方法包括酚仿抽提法、硅粒法及由硅粒法衍生而來的硅離心柱法 (商業(yè)化試劑盒提取方法)等，在古DNA研究領(lǐng)域，異丙醇代替乙醇沉淀DNA的方法和硅離 心柱法已經(jīng)被證明能更有效地去除PCR反應(yīng)抑制物。由于堿基缺失和堿基修飾類的損傷都會終止PCR反應(yīng)，而由于堿基脫氨基造成的 錯配損傷，并不會終止模板的擴增，而是在擴增中引入錯誤的堿基。所以在所有損傷類型 中，錯配損傷型DNA模板的存在是獲得真實古代DNA序列的最主要障礙之一。目前，常見的古DNA遺傳信息真實性保證的方法主要側(cè)重于對樣品的前期處理， 由于古DNA在樣品中的含量極為稀少，在提取過程中如果不能有效去除樣品中含有的抑制 物和干擾物，所得DNA片斷的擴增效率往往將大打折扣，而一些去除污染的措施可能導(dǎo)致 提取效率的降低，從而無法獲得所需的古DNA目標序列，此外，在后續(xù)的擴增步驟中如果不 采取有力的措施排除受損傷DNA序列信息的干擾，也將無法獲得所需的遺傳信息。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種古代動物DNA的提取方法。本發(fā)明提供的古代動物DNA的提取方法，包括以下步驟1)將古代動物樣品置于裂解緩沖液中裂解，收集裂解液；2)向上述步驟1)中得到的裂解液中加入與所述裂解液等體積的助沉緩沖液進行 處理，離心得到上清液；所述助沉緩沖液的溶劑是水，溶質(zhì)是醋酸鉀和氯化鋰，其中醋酸鉀 的終濃度為1. 40-1. 45mol/L，氯化鋰的終濃度為4. 25-4. 30mol/L ；3)往上述步驟2)中得到的上清液加入異丙醇，離心，得到古代動物DNA沉淀；所 述異丙醇的體積是所述上清液體積的0. 6-1倍。步驟1)中，上述古代動物樣品為古代動物的骨骼或牙齒；所述古代動物樣品在置 于裂解緩沖液中裂解之前經(jīng)過粉碎步驟，所述粉碎步驟得到的粉末與所述裂解緩沖液的體 積比是1 2。上述粉碎具體可在液氮中粉碎。上述步驟1)中的裂解緩沖液可將組織裂解，從而使核酸得以釋放。所述裂解緩沖 液的溶劑是水，溶質(zhì)是三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris · Cl)、氯化鈉、乙二胺四乙酸(EDTA) 和十二燒基磺酸鈉(SDS)，終濃度分別為 100mmol/L Tris · Cl，100mmol/L NaCl, IOOmmol/ L EDTA(pH 8.0)，0.5% SDS(質(zhì)量百分比)。由于RNA非常不穩(wěn)定易于被降解，在古代樣品 中，殘留的核酸全部為DNA分子而不含有RNA分子。上述步驟1)中，裂解液是將所述裂解后的溶液經(jīng)過離心得到的上清液，所述離心 條件為12000g，離心時間為5分鐘。步驟1)中，為使裂解更加充分，可在加入裂解緩沖液后、離心之前用組織研磨器 將加入了裂解緩沖液的古動物樣品充分勻漿，再將勻漿置于震蕩搖床上震蕩。具體在震蕩 搖床上震蕩的溫度條件為50-60°C，優(yōu)選為55°C ；震蕩的時間為1. 5-2. 5小時，優(yōu)選為2小 時。上述步驟2)中助沉緩沖液可將樣品中的DNA分子所帶的負電荷中和，以利于下 一步的沉淀。其中，助沉緩沖液中醋酸鉀的濃度優(yōu)選為1.43mol/L，氯化鋰的濃度優(yōu)選為 4. 29mol/L。配制時，先行配制5mol/L醋酸鉀溶液和6mol/L氯化鋰，再將兩種溶液以體積 比2 5混合而成。步驟2)中的處理過程是在冰上進行的，在冰上靜置處理的時間為25-35分鐘，優(yōu) 選為30分鐘；所述離心條件為12000g，離心時間為15分鐘。上述步驟3)加入的異丙醇可與水任意比例互溶，從而奪取DNA分子周圍的水分， 令DNA分子聚集而發(fā)生沉淀，其中所述離心條件為12000g，離心時間為30分鐘。步驟3)中離心步驟之前還包括一靜置步驟，令DNA充分沉淀，所述靜置的時間為 100-150分鐘，優(yōu)選為120分鐘，靜置的溫度條件為-20°C。步驟3)中，所述異丙醇是經(jīng)_20°C預(yù)冷的。步驟3)中，所述異丙醇的體積具體是所述上清液體積的1倍。上述方法還包括步驟3)之后的洗滌步驟；所述洗滌是往上述步驟3)得到的DNA 沉淀中加入濃度為70% (70g/100ml)的乙醇水溶液，輕彈管壁后離心去上清；所述洗滌次數(shù)為1次或2次；所述離心條件為12000g，離心時間為1分鐘。DNA分子不溶于70%乙醇水溶液，而步驟2)中所用的助沉緩沖液中的鹽離子溶于 70%乙醇水溶液，因此加入70%乙醇水溶液洗滌的步驟可去除殘余的鹽離子。上述所有離心在4°C進行以減少高溫時DNA的溶解。本發(fā)明的另一目的在于提供一種包括古代動物DNA的提取方法和擴增策略的獲 取古代動物遺傳信息的方法。本發(fā)明提供的獲取古代動物遺傳信息的方法，是將上述提取方法中得到的DNA沉 淀中加入水得到DNA提取液，將所述DNA提取液進行PCR擴增測序，得到古代動物遺傳信 肩、ο上述PCR擴增測序包括以下步驟a)將提取所得的DNA提取液作為模板，進行PCR擴增，測序；b)將提取所得的DNA提取液作為模板，在常規(guī)PCR擴增反應(yīng)之前加入一個去除受 損傷模板的步驟，再進行去除受損傷模板后的PCR擴增，然后測序；c)將步驟a)和b)的兩個結(jié)果進行比對分析，得到古代動物遺傳信息。步驟b)中，所述去除受損傷模板的步驟是往所述PCR擴增反應(yīng)體系中加入尿嘧啶 糖苷酶(UNG酶)進行處理；所述尿嘧啶糖苷酶的用量是每25 μ IPCR擴增反應(yīng)體系中加入 IU的尿嘧啶糖苷酶；所述處理的溫度是37°C，處理的時間5min。其中尿嘧啶糖苷酶單位U定義37°C -50°C下，反應(yīng)1小時，可降解Img含dU堿基 的單鏈DNA的酶量為1單位(IU)。本發(fā)明的古代動物遺傳物質(zhì)的提取方法，采用的是室溫下延時沉淀法，主要是在 提取過程中提高提取效率、移除擴增抑制物和避免DNA再損傷，在之后的PCR擴增中避免受 損傷模板的干擾，從而獲得更真實可靠的古DNA序列信息。本發(fā)明的提取方法在提取過程中，需要使DNA的獲得量最大化，同時去除干擾擴 增的抑制物，還要避免對DNA的再損傷。判斷古DNA提取方法優(yōu)劣的標準除了評價其獲取 古DNA模板的效率和除雜質(zhì)的程度之外，還包括提取方法涉及的操作步驟的多寡。較少的 步驟，尤其是較少開啟試管的次數(shù)更有利于污染的控制。現(xiàn)在已經(jīng)可以通過添加DNA釋放 劑如BSA來在擴增階段解除PCR抑制物，所以我們更期望在使得提取量最大化的前提下找 到相對節(jié)省成本的方法。在平衡了這多方面考慮后，本發(fā)明提供的是一種改良的簡單有效 的提取方法，可在獲得最大提取量的同時降低成本。在本發(fā)明提取方法在具體操作時，每次實驗均設(shè)置兩個空白對照，用于檢測操作 環(huán)境中污染物的存在。古代DNA研究都必須有不同程度的重復(fù)以證明獲得的DNA的可靠性。 重復(fù)驗證是古代DNA研究中的最后一步，也是最重要的一步，在識別污染DNA的過程中起著 關(guān)鍵的作用。為了保證重復(fù)實驗，在提取材料的選擇和預(yù)備階段，應(yīng)預(yù)留足夠的古代材料以 備重復(fù)實驗所需。重復(fù)實驗的要求清楚地表明，DNA必須經(jīng)過一系列的檢驗后才能確定為 古代DNA，這是古代DNA研究和現(xiàn)代DNA研究重要不同之處。 在古動物DNA的擴增過程中，模板量很少的問題廣泛存在，如果PCR反應(yīng)由少量的 分子起始，則需要經(jīng)過多次獨立的擴增并進行多次克隆測序來驗證序列的真實性。如果擴 增起始于少量或是單個DNA鏈，那么在第一次擴增時的錯誤將導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的全部錯誤。如 果DNA有多處損傷，這種錯誤將導(dǎo)致研究結(jié)果出現(xiàn)巨大偏差。如果PCR起始于多于1，000
7個的模板分子，則不需要重復(fù)實驗去驗證核苷酸的錯配對結(jié)果的影響。要保證古DNA序列 的真實性，可以通過競爭PCR或?qū)崟r定量PCR技術(shù)來進行對模板分子的定量分析。本發(fā)明獲取古代動物遺傳信息的方法，在古動物DNA遺傳信息的獲得時，在模板 量獲得保障的前提下，為了確保所獲得的古DNA序列信息真實可靠，本發(fā)明采用了多次獨 立擴增后分別進行克隆測序和UNG處理去除受損傷模板后進行擴增測序相結(jié)合的策略，即 將樣本在使用UNG處理后擴增測序的基礎(chǔ)上，再抽樣做獨立擴增后的多克隆測序的實驗。單獨的獨立擴增多克隆測序的方法，可獲得最終的保守序列，可以避免古代樣本 中微量DNA模板的損失，但不保證所獲取序列真實性，如果最初擴增的模板僅為數(shù)個DNA分 子，那么PCR產(chǎn)物可能全部錯誤，此外，獨立擴增多克隆測序的方法還需要較多研究經(jīng)費投 入和較長的實驗周期。單獨采用尿嘧啶糖苷酶(UNG)去除受損傷模板后擴增測序的方法，雖然可以保證 序列的真實性和準確率，排除受損傷模板的干擾，但UNG在選擇性地把PCR產(chǎn)物DNA磷酸骨 架上的UTP降解下來的同時，會在該DNA上留下缺口，使該DNA在PCR高溫反應(yīng)中極易被破 壞，使得古代樣本中微量的DNA無法被擴增。值得一提的是，一些mtDNA序列片段也在核基因組上出現(xiàn)，即線粒體假基因 (NUMT)，它們會對擴增測序造成干擾，導(dǎo)致假陽性的結(jié)果。有時，我們可以在一個樣本提 取中得到多個mtDNA序列，或是在相近物種中發(fā)現(xiàn)同樣的mtDNA序列，這就說明有可能是 NUMT。識別NUMT的辦法之一是另外再設(shè)計一套引物(3’末端有所不同)，如果第一套引物 擴增的是NUMT，則新的一套引物還是擴增NUMT的幾率很小。另外一種識別方法是，相同或 非常相似的NUMT會在親緣關(guān)系相近的物種中出現(xiàn)，因為NUMT的進化速率很慢。假如，用不 同引物擴增得到高變區(qū)的重疊序列，這些重疊序列都是同樣的結(jié)果，則證明不是NUMT。本發(fā)明獲取古代動物遺傳信息的方法，采用獨立擴增多克隆測序和去除受損傷模 板后擴增測序相結(jié)合的方法可以在不影響獲取成功率的前提下，更有效地排除受損傷模板 的干擾，避免錯誤序列結(jié)果的獲得，并將經(jīng)費投入和實驗周期都減少至常規(guī)方法的一半。本發(fā)明的提取方法提取古代DNA具有簡單、省時、成本低和提取效率高的特點，適 用于大樣本量檢測工作的開展。所有的步驟都是在室溫操作，不會對古代DNA有進一步的 損傷。首先理論上蛋白質(zhì)在漫長的地質(zhì)化學(xué)作用中已經(jīng)被破壞，故本方法省略了蛋白酶 (如蛋白酶K)消化的步驟，無需進行加熱條件下長時間的蛋白酶消化，可避免古DNA的再損 傷。取而代之的是，本方法中加入了一步化學(xué)試劑助沉的程序，減少多余雜質(zhì)與核酸的共沉 淀，從而達到減少擴增干擾物的目的。此外，根據(jù)古代DNA含量少且片段化的特點，延長離 心沉淀DNA的時間至30min來最大限度地富集古DNA模板。本方法只需常規(guī)的緩沖液，因 此可以節(jié)約經(jīng)費投入和方便實驗的開展。


圖1為本發(fā)明方法提取的兩個古代樣本和一個提取空白對照及一個PCR空白對照 的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果(L代表IOObp ladder ；樣本TSl和TS2 ；EC代表提取空白對 照；PC代表PCR空白對照；圖中左側(cè)的D意為D-Ioop高變區(qū)179bp片段結(jié)果，右側(cè)的B意 為Cytb基因142bp片段結(jié)果)。圖2為室溫下延時沉淀提取法提取產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)擴增和克隆測序得到的78個克隆中的52個的多序列比對結(jié)果。圖2中，克隆序列的命名法為第一位代表樣本名(TSl，TS2，TS6，TS7)，第二位代 表擴增次數(shù)，第三位代表克隆號；真實序列(Endogenous)源于UNG處理后的擴增結(jié)果；堿 基位置的確定是基于Genbank中的兩個參考序列，其中序列AF486871作為Cytb基因序列 的參考；AF276927作為高變區(qū)D-Ioop基因序列的參考。圖中A，B和E的序列均源于Cytb 基因；圖中C和D的序列均源于高變區(qū)D-Ioop基因。比對中與真實序列一致的堿基位點用 “.”代替。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1、古代動物遺傳信息的獲得一、制備DNA提取液1、通過本發(fā)明提供的室溫下延時沉淀提取法獲得DNA提取液1)實驗準備①實驗室所有PCR擴增之前的過程(即制備DNA提取液的過程)都是在獨立的古DNA實驗 室進行，該實驗室絕不允許現(xiàn)代動物DNA或擴增后的DNA進入。所用儀器設(shè)備都是古DNA 操作專用的，且耐腐蝕的實驗儀器設(shè)備均定期用漂白水(有效成分為次氯酸鈉)的稀釋液 (1 8)去除殘余核酸的污染。實驗室內(nèi)所用到的水均為二次過濾超純水，一次經(jīng)超純水儀 (Mi llipore, USA)過濾，二次經(jīng)0. 22um的注射器用濾器過濾(Mi llipore, USA)。②試劑和樣品的準備a、DNA 裂解緩沖液溶劑是水，溶質(zhì)是 IOOmmol/L Tris · Cl, IOOmmol/L NaCl, IOOmmol/L EDTA pH 8. 0,0. 5% SDS (十二烷基磺酸鈉)，置于4°C條件下保存，待用；b、助沉緩沖液用5mol/L醋酸鉀溶液和6mol/L氯化鋰溶液以2 5體積比例混 合制備而成，置于4°C條件下保存，待用。其中，所有溶液和試劑均用二次過濾超純水配制。C、古代動物樣品本實驗中所用的樣品為古代豬牙齒、骨骼，采集自位于山西省襄 汾縣的陶寺遺址，14C測年表明該遺址年代為距今4400-3900年前。每頭個體僅有一個下頌 骨故而可確保10個古代豬牙樣本來自10個不同的個體。實驗中將10個古代豬牙樣品依 次編號為 TS1、TS2、TS3......TSlO0古代動物樣品一般由相關(guān)研究機構(gòu)或個人收藏，記載過古代豬牙齒、骨骼材料的 文獻是于長春，古代DNA技術(shù)的歷史與應(yīng)用，吉林師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2007 (3) 61-64 ；公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。2) DNA提取液的制備①將經(jīng)過去污染處理的古動物樣品(TSl-TSlO)在液氮中粉碎，得到粉碎的骨粉；②將步驟①中得到的骨粉，每個樣品取0. 5ml，加入ImlDNA裂解緩沖液中，再用組 織研磨器充分勻漿；③將步驟②中得到的勻漿約1.5ml置于震蕩搖床上，在55°C條件下震蕩2小時后，12000g離心5min,吸取上清液(即為裂解液)；④取上述步驟③中離心后的上清液約lml，加入等體積(即Iml)助沉緩沖液，在冰 上作用30min后，12000g離心15min,吸取上清液；⑤取上述步驟④中離心后的上清液1ml，加入等體積(即lml)的異丙醇，_20°C靜 置2h后，12000g離心30min,棄除上清液；⑥將上述步驟⑤中離心后的上清液去除，向得到的離心沉淀(12000g)中加入 lml70% (70g/100ml)乙醇，輕彈管壁令沉淀略分散，12000g離心lmin，去上清液，再次加入 Iml 70%乙醇，輕彈管壁后12000g離心lmin，去上清液，得到DNA沉淀；⑦用適量的超純水溶解步驟⑥得到的DNA沉淀，得到DNA提取液。至此，得到用本發(fā)明方法提取得到的編號為TSl-TSlO的10個DNA提取液。2、通過商業(yè)化試劑盒提取得到DNA提取液1)試劑準備蛋白酶K溶液20mg/ml，制備方法為取蛋白酶K粉末用滅菌后的50mmol/L Tris (pH8. 0)和1. 5mmol/L乙酸鈣溶解，_20°C保存?zhèn)溆谩Ｔ噭┖蠶IAampDNA Mini Kit, QIAGEN.試劑盒包括QIAamp Spin Columns, Collection tubes(2ml), Buffer ATL，Buffer AL, Buffer Affl, Buffer AW2，BufferAE02)消化用同樣的方法粉碎古代樣品后，按試劑盒說明書的比例加入試劑盒提供的 BufferATL，并加入終濃度lmg/ml的蛋白酶K溶液。3)提取按照試劑盒QIAamp DNA Mini Kit的說明書繼續(xù)進行提取，得到DNA提取液。至此，得到用商業(yè)化試劑盒提取得到的編號為TSl-TSlO的10個DNA提取液。二、獲取古代動物遺傳信息1、試劑的準備a、牛血清白蛋白(BSA，10mg/ml) :0. Ig牛血清白蛋白固體粉末加入IOml水中配 制。b、dNTP 取 IOOmmol/L 的 dTTP、dCTP、dGTP 和 dATP 各 1ml，加入 6ml ddH20 中，使 終濃度為1 Ommol/L。c> Ampli Taq Gold i式劑盒Applied Biosystems, Foster City, CA02、擴增將步驟一得到的商業(yè)化試劑盒提取得到的編號為TSl-TSlO的10個DNA提取液以 及用本發(fā)明方法提取得到的編號為TSl-TSlO的10個DNA提取液分別用下述兩種方法擴增 測序多次獨立擴增后分別克隆測序，與去除受損傷模板后擴增測序。其中擴增引物分別基于線粒體基因組中的高變區(qū)D-Ioop和保守區(qū)Cytb設(shè)計，如 下表1所示。表1、引物設(shè)計
10 1)多次獨立擴增后分別克隆測序的方法(未加UNG酶后擴增的方法)25ul的常規(guī) PCR反應(yīng)體系如下表2所示。 表2、25ul的PCR反應(yīng)體系
Items
/μ
ddH20 μ 7. 3
IOx PCR buffer II2. 5 2)去除受損傷模板后擴增測序的方法(加UNG酶后擴增的方法)25ul的常規(guī)PCR反應(yīng)體系與表2的區(qū)別在于加入0. 1μ 1 UNG酶(10U/μ 1)，相 應(yīng)減少0. 1 μ 1的ddH20，其余完全相同。降落PCR程序與表3的區(qū)別在于在PCR程序之前使UNG酶在37°C作用5min，然
11后95 °C預(yù)變性從5分鐘延長至10分鐘，其余完全相同。在反應(yīng)起始之前加入UNG酶在37°C作用5min，使UNG酶在最適溫度反應(yīng)去除DNA 中的受損傷模板，之后95°C作用IOmin變性UNG同時啟動AmpliTaq Gold。3、結(jié)果分析1)比較本發(fā)明提供的DNA提取方法和商業(yè)化試劑盒提取DNA方法本發(fā)明提供的提DNA方法所提取的產(chǎn)物(步驟一的步驟1得到的產(chǎn)物)經(jīng)步驟 二的步驟2的兩種方法1)和2)擴增后，結(jié)果表明，室溫下延時沉淀方法提取的產(chǎn)物經(jīng)兩 種擴增后，均可以獲得5個Cytb片段(TS1，TS2，TS3，TS6，TS9)和4個D-Ioop片段(TS1， TS2，TS6，TS7)，提取成功率為60%。(提取成功率是提取成功的總個數(shù)與提取的總數(shù)之比； TSl-TSlO這10個樣品均重復(fù)三次取樣)。試劑盒方法提取方法的產(chǎn)物(步驟一的步驟2得到的產(chǎn)物)經(jīng)兩種擴增(步驟二 的步驟2的兩種方法1)和2))后，均可以獲得5個Cytb片段(TS1,TS2, TS3，TS6，TS9)和 5 個 D-Ioop 片段(TS1，TS2，TS3，TS6，TS7)，提取成功率也為 60%。兩種方法均成功擴增出的產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳法檢測3ul擴增產(chǎn)物。如圖 1 (EC代表提取空白對照即將以水代替骨粉完成提取步驟得到的產(chǎn)物作為模板進行PCR擴 增得到的結(jié)果；PC代表PCR空白對照即以水代替DNA提取液為模板完成PCR擴增得到的結(jié) 果)所示，圖中TSl和TS2樣品經(jīng)本發(fā)明提供的DNA提取方法提取、并按照去除受損傷模板 后擴增測序的方法擴增的產(chǎn)物，其條帶較清晰，片段大小正確無誤，提取空白對照和PCR空 白對照均為零產(chǎn)物。樣品TS4、TS5、TS8、TS10用兩種方法(本發(fā)明提供的提取方法和商業(yè) 化試劑盒提取法)提取均未獲成功。該結(jié)果說明，本發(fā)明方法獲得古代DNA的方法，與當前應(yīng)用比較廣泛的商業(yè)化試 劑盒提供的硅離心柱提取法的提取成功率一樣，而實驗中需要的常規(guī)的化學(xué)藥品的費用約 是商業(yè)化試劑盒費用的1/10，且由于省略了蛋白酶K過夜消化步驟而將實驗周期縮短一 半。此外，UNG酶的處理在本研究中未見對古代DNA獲取的成功率造成影響。2)檢測獲得古動物遺傳信息的準確性一般錯配損傷的三種類型表現(xiàn)如下第一類為一致性的堿基取代型損傷，即多克 隆序列中，所有克隆序列在某位點都表現(xiàn)為擴增后的損傷堿基而完全掩蓋了序列自身的堿 基；第二類為部分一致性堿基取代，即多克隆序列中，部分克隆序列表現(xiàn)序列自身堿基，而 另一部分克隆序列表現(xiàn)為擴增后的損傷堿基；第三類為零星的堿基取代，即堿基取代沒有 多克隆序列間的一致性。本發(fā)明提供的提DNA方法所提取的產(chǎn)物(步驟一的步驟1得到的產(chǎn)物)經(jīng)上述 加UNG酶后擴增的方法擴增后，成功擴增的9個mtDNA片段(5個Cytb片段TS1，TS2，TS3， TS6，TS9和4個D-Ioop片段TSl，TS2，TS6，TS7)克隆測序后獲得共計78個克隆序列(其 中52個作為示例在圖2中給出，Cytb片段TS3和TS9的結(jié)果未在此顯示)，其中，只出現(xiàn)了 3個零星的堿基取代類損傷位點。Blastn比對表明9個片段序列均為豬源的目標序列。我 們判斷UNG處理后擴增獲得的序列為真實的古代DNA序列。獲得的高變區(qū)D-Ioop和Cytb 基因相應(yīng)序列的Genbank登陸號分別為FJ601540-FJ601543和FJ804769-FJ804773。圖2中，克隆序列的命名法為第一位代表樣本名(TSl，TS2，TS6，TS7)，第二位代 表擴增次數(shù)，第三位代表克隆號；真實序列(Endogenous)源于UNG處理后的擴增結(jié)果；堿基位置的確定是基于Genbank中的兩個參考序列，其中序列AF486871作為Cytb基因序列 的參考(其核苷酸序列如序列表中序列1所示)；AF276927作為高變區(qū)D-Ioop基因序列的 參考(其核苷酸序列如序列表中序列2所示)。圖中A，B和E的序列均源于Cytb基因；圖 中C和D的序列均源于高變區(qū)D-Ioop基因。比對中與真實序列一致的堿基位點用“.”代替。本發(fā)明提供的提DNA方法所提取的產(chǎn)物(步驟一的步驟1得到的產(chǎn)物)經(jīng)上述未 加UNG酶后擴增的方法擴增后，其所有克隆序列都全部被受損位點擴增后的堿基取代現(xiàn)象 出現(xiàn)概率高達44% (9個成功擴增出的片段中，4個片段存在一致性堿基取代型損傷)，而二 次或多次擴增后仍不能完全排除受損傷模板序列的干擾。如采用多于3次的獨立擴增后比 較多克隆序列的方法能夠鑒別出真實的古代DNA序列，會將研究經(jīng)費的投入和實驗的周期 提高和延長一倍以上。相較而言，本發(fā)明中源于6個古代樣本(TS1、TS2、TS3、TS6、TS7和TS9)中的9個 mtDNA片段，經(jīng)UNG酶排除受損傷DNA模板的干擾后的擴增產(chǎn)物只需一次克隆測序，且獲得 的結(jié)果可靠性100%。但由于古代樣品中DNA含量較少，UNG酶的加入會降低PCR產(chǎn)物的得 率，因此還應(yīng)抽樣進行多次獨立擴增后分別克隆測序。因為當一致取代型損傷出現(xiàn)時，擴增時的古代DNA模板分子通常不多于100個，所 以我們也將試劑盒提取的TS2和TS7的Cytb片段，經(jīng)常規(guī)一次擴增后獲得的產(chǎn)物進行多克 隆測序，以檢測一致取代型損傷的高頻出現(xiàn)與室溫下延時沉淀法提取量高低的關(guān)聯(lián)。結(jié)果 表明，與室溫下延時沉淀法相同，試劑盒提取法獲得DNA經(jīng)常規(guī)擴增也擴增到損傷DNA模 板。所以可能模板分子量少是與古代材料本身相關(guān)聯(lián)，而與室溫下延時沉淀方法提取效率 無關(guān)。綜上所述，本發(fā)明提供的提取DNA方法(步驟一的步驟1)和擴增測序策略(多次 獨立擴增后分別進行克隆測序和UNG處理去除受損傷模板后進行擴增測序相結(jié)合的策略， 將樣本在使用UNG處理后擴增測序的基礎(chǔ)上，再抽樣做獨立擴增后的多克隆測序，即步驟 二的步驟2的步驟1)和2)結(jié)合)由于能夠節(jié)約成本、縮短研究周期并獲得可靠的古代DNA 序列而適合大樣本量的古DNA的獲取和檢測分析。
1權(quán)利要求
一種古代動物DNA的提取方法，包括以下步驟1)將古代動物樣品置于裂解緩沖液中裂解，收集裂解液；2)向上述步驟1)中得到的裂解液中加入與所述裂解液等體積的助沉緩沖液進行處理，離心得到上清液；所述助沉緩沖液的溶劑是水，溶質(zhì)是醋酸鉀和氯化鋰，所述助沉緩沖液中醋酸鉀的濃度為1.40 1.45mol/L，氯化鋰的濃度為4.25 4.30mol/L；3)往上述步驟2)中得到的上清液加入異丙醇，離心，得到古代動物DNA沉淀；所述異丙醇的體積是所述上清液體積的0.6 1倍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述裂解緩沖液是以水為溶 劑，以Tris · Cl、NaCl、EDTA和SDS為溶質(zhì)配制而成，所述Tris · Cl、NaCl、EDTA和SDS的 終濃度為如下Tris'Cl 100mmol/L, NaCl 1 OOmmo 1/L, EDTA lOOmmol/L, SDS 0. 5% (質(zhì)量 百分比)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述古代動物樣品為古 代動物的骨骼或牙齒；所述古代動物樣品在置于裂解緩沖液中裂解之前經(jīng)過粉碎步驟，所 述粉碎步驟得到的粉末與所述裂解緩沖液的體積比是1 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述裂解液是將所 述裂解后的溶液經(jīng)過離心得到的上清液，所述離心的轉(zhuǎn)速為12000g，離心時間為5分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于步驟2)中，所述助沉緩沖液中 醋酸鉀的濃度為1. 43mol/L，氯化鋰的濃度為4. 29mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于步驟2)中，所述處理的步驟 是在冰上進行的，所述冰上進行的時間為25-35分鐘，優(yōu)選為30分鐘；所述離心條件為 12000g, 15 分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于步驟3)中，所述離心條件為 12000g，30分鐘；所述離心步驟之前還包括一靜置步驟，所述靜置的時間為100-150分鐘， 優(yōu)選為120分鐘，靜置的溫度條件為-20°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于步驟3)中，所述異丙醇是 經(jīng)_20°C預(yù)冷的；所述異丙醇的體積是所述上清液體積的1倍。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括步驟3)之后的 洗滌步驟；所述洗滌是往上述步驟3)得到的DNA沉淀中加入濃度為70g/100ml的乙醇水溶 液，輕彈管壁后離心去上清；所述洗滌次數(shù)為1次或2次；所述離心條件為12000g，1分鐘。
10.一種獲取古代動物遺傳信息的方法，是往權(quán)利要求1-9中任一所述的方法得到的 DNA沉淀中加入水得到DNA提取液，將所述DNA提取液進行PCR擴增測序，得到古代動物遺 傳信息。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述PCR擴增測序包括如下步驟a)將提取所得的DNA提取液作為模板，進行PCR擴增，測序；b)將提取所得的DNA提取液作為模板，在常規(guī)PCR擴增反應(yīng)之前加入一個去除受損傷 模板的步驟，再進行去除受損傷模板后的PCR擴增，然后測序；c)將步驟a)和b)的兩個結(jié)果進行比對分析，得到古代動物遺傳信息。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于步驟b)中，所述去除受損傷模板的步 驟是往所述PCR擴增反應(yīng)體系中加入尿嘧啶糖苷酶進行處理；所述尿嘧啶糖苷酶的用量是每25 μ IPCR擴增反應(yīng)體系中加入IU的尿嘧啶糖苷酶；所述處理的溫度是37°C，處理的時 間 5min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種獲取古代動物遺傳信息的方法。本發(fā)明還提供了古代動物DNA的提取方法，其包括以下步驟1)將古代動物樣品至于裂解緩沖液中裂解，離心，得到裂解液；2)向裂解液中加入與所述裂解液等體積的助沉緩沖液，離心得到上清液；3)取上清液加入與所述上清液等體積的異丙醇，離心，得到DNA沉淀。本發(fā)明的獲取古代動物遺傳信息的方法在步驟3)的基礎(chǔ)上還包括4)洗滌；5)將步驟4)所得的DNA沉淀用水溶解，進行去除受損傷的模板后的擴增測序；6)抽樣進行多次常規(guī)的擴增后測序并與步驟5)的結(jié)果進行比對，獲取真實的古代動物遺傳信息。發(fā)明的方法有簡單、省時、成本低和提取效率高的特點，適用于大樣本量檢測工作的開展。
文檔編號C12Q1/68GK101921743SQ20101023880
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月26日
發(fā)明者方遲, 趙興波 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)