專利名稱：與甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F緊密連鎖的特異片段及其獲得方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與甜瓜白粉病抗性基因Pm_2F緊密連鎖的特異片段及其獲得方法，屬 于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甜瓜為葫蘆科黃瓜屬(Cucumis melo L.) 一年生蔓生草本植物，是一種國內(nèi)外廣 泛栽培的重要經(jīng)濟(jì)作物。我國已有3000多年的甜瓜栽培歷史，是世界上最早栽培甜瓜的國 家之一，也是目前世界上甜瓜栽培面積最大、產(chǎn)量最高的國家。白粉病是危害甜瓜生產(chǎn)的一種世界性病害，在許多國家和地區(qū)都有發(fā)生，嚴(yán)重影 響甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)，甚至?xí)斐山^產(chǎn)，引起了世界各國的廣泛重視。白粉病主要由瓜單囊 殼菌(Sphaerotheca fuliginea)禾口二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)弓|起。目前人 們已較深入地對病原菌的致病性、傳播途徑、預(yù)防措施等進(jìn)行了研究，也為尋找相關(guān)抗源基 因做了大量工作，但白粉病菌的危害還是有不斷發(fā)展的趨勢，開展抗病品種的選育是解決 這一問題的有效途徑。因此，對瓜類白粉病抗病育種的研究已成為育種工作的主要目標(biāo)之
O傳統(tǒng)育種方式費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要非常大的群體對白粉病菌的抗性進(jìn)行嚴(yán)格篩選。利 用與抗病性狀緊密連鎖的特異標(biāo)記片段進(jìn)行品種篩選，可大大縮短傳統(tǒng)育種的研究周期， 加速目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)移。目前，與抗病性狀緊密連鎖的特異標(biāo)記片段的獲得主要來源于各種 分子標(biāo)記技術(shù)，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)、微衛(wèi)星DNA或 簡單重復(fù)序列(SSR)、特異序列擴(kuò)增(SCAR)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)等。其中，RAPD和AFLP 標(biāo)記技術(shù)檢測易受環(huán)境條件的影響而造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性差，SCAR和SNP標(biāo)記技術(shù)需要利 用已知DNA序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，而SSR標(biāo)記技術(shù)具有重復(fù)性好，標(biāo)記穩(wěn)定可靠，便 于統(tǒng)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)，是目前實(shí)際應(yīng)用中比較穩(wěn)定的標(biāo)記工具，而且利用SSR標(biāo)記技術(shù)獲得的特 異片段序列也是開發(fā)SCAR和SNP等其他分子標(biāo)記的重要基礎(chǔ)。因此，本項(xiàng)研究擬利用SSR 標(biāo)記技術(shù)尋找與甜瓜白粉病抗性基因緊密連鎖的特異標(biāo)記片段，這將是今后進(jìn)行甜瓜白粉 病抗性分子育種的基礎(chǔ)，而由此獲得的擴(kuò)增序列又是開發(fā)SCAR和SNP等特異分子標(biāo)記的基 石出。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種與甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F緊密連鎖的特異片段，該特異片段可用于甜瓜抗白粉病分子標(biāo)記輔助育種中。本發(fā)明的另一個目的是提供這種特異片段的獲得方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種與甜瓜白粉病抗性基因Pm_2F緊密連鎖的特異片段，其具有序列表中SEQ ID NO 1 4所述的DNA序列。序列表中SEQID NO 1為抗病特異擴(kuò)增片段SSR509-172的序列；序列表中SEQ ID NO 2為抗病特異擴(kuò)增片段SSR510-98的序列；序列表中SEQ ID NO 3為感病特異擴(kuò)增片段SSR509-170的序列；序列表中SEQ ID NO 4為感病特異擴(kuò)增片段SSR510-104的序列。一種與甜瓜白粉病抗性基因Pm_2F緊密連鎖的特異片段的獲得方法，所述方法包 括如下步驟(1)與甜瓜白粉病抗性基因Pm_2F緊密連鎖的特異片段的篩選提取基因組DNA， 使用SSR引物對基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析；通過BSA法，尋找與 甜瓜白粉病抗性基因Pm_2F緊密連鎖的特異SSR片段，測定連鎖距離并驗(yàn)證連鎖關(guān)系；(2)與甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F緊密連鎖的特異擴(kuò)增序列的獲得對SSR產(chǎn)物 進(jìn)行回收、克隆和測序，獲得特異片段序列。上述的一種與甜瓜白粉病抗性基因Pm_2F緊密連鎖的特異片段的獲得方法，所述 步驟(1)中SSR引物為SSR引物509和SSR引物510 ；所述SSR引物509上游引物序列為5，-CTGGCCCCCTCCTAAACTAA-3，，509下游引物 序列為 5，-CAAAAAGCATCAAAATGGTTG-3，。所述SSR引物510上游引物序列為5，-TTTCACTTTTTCCCGCCG_3，，510下游引物序 列為 5，-AATGGAAAAGGGAAGTGCAA-3，。上述的一種與甜瓜白粉病抗性基因Pm_2F緊密連鎖的特異片段的獲得方法，其 中，所述步驟(1)中的提取基因組DNA是指將1.5克葉片在液氮中研磨成粉末，加入9ml 2% CTAB提取液，混勻65°C水浴1小時(shí)；從水浴中取出離心管，加1/3體積5M醋酸鉀，混勻 冰浴20分鐘；加入等體積氯仿/異戊醇抽提兩次；取上清加入2/3體積異丙醇沉淀DNA ；洗 滌緩沖液洗滌一次，吹干，加TE緩沖液溶解；加入RNase A使其終濃度達(dá)100 μ g/ml，混勻 37°C水浴1小時(shí)；用等體積氯仿/異戊醇抽提；取上清，加入1/2體積7. 5M醋酸銨和2倍體 積無水乙醇沉淀DNA ；70%乙醇洗滌沉淀，吹干，加適量ddH20溶解DNA。上述的一種與甜瓜白粉病抗性基因Pm_2F緊密連鎖的特異片段的獲得方法，其 中，所述步驟(1)中的PCR反應(yīng)條件是25μ 1的反應(yīng)體系中含有2. 5μ1 10 X buffer, 2. 0μ 1 25mM MgCl2, 2. 0 μ 1 2. 5mM dNTP, IU TaqDNA 聚合酶，30ng SSR 引物，50ng 模板DNA ； 反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min，然后94°C lmin，52°C lmin，72°C 2min下循環(huán)35次，72°C延 伸7min后保存在4°C條件下。上述的一種與甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F緊密連鎖的特異片段的獲得方法，其 中，所述步驟(2)中的SSR產(chǎn)物的回收、克隆和測序是指用Gene-Clean試劑盒純化回收已 證明是連鎖的SSR特異片段，然后連接到pGEM@-T Vector Easy載體上，將重組質(zhì)粒DNA用 EcoRI進(jìn)行酶切處理，用SSR-PCR驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物，觀察擴(kuò)增出的片段是否與原來的目的片段 和酶切片段一致，并測序。
本發(fā)明應(yīng)用簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat, SSR)技術(shù)，在甜瓜重組自 交系(Recombinant Inbred Line，RIL)群體中采用混合分組分析法(Bulked Segregating Analysis, BSA)篩選了與甜瓜白粉病抗性基因Pm_2F緊密連鎖的SSR特異片段，并將SSR特 異片段克隆測序獲得了特異擴(kuò)增序列。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明獲得的SSR特異片段具有重復(fù)性好，標(biāo)記穩(wěn)定可靠，便于 統(tǒng)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)，其特異擴(kuò)增序列亦是開發(fā)其它特異標(biāo)記的基礎(chǔ)。下面結(jié)合附圖及最佳實(shí)施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，以使公眾對發(fā)明內(nèi)容有整 體和充分的了解，而并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。前述部分已經(jīng)充分公開了本發(fā)明可以 實(shí)施的保護(hù)范圍，因此凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容進(jìn)行的任何本領(lǐng)域公知的等同替換，均屬于 對本發(fā)明的侵犯。


圖1為引物SSR509和510對抗感親本、F1、抗感池DNA擴(kuò)增結(jié)果圖；圖2為引物SSR509對重組自交系群體的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖；圖3為引物SSR510對重組自交系群體的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖；圖4為引物SSR509對甜瓜種質(zhì)資源的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖；圖5為引物SSR510對甜瓜種質(zhì)資源的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例與甜瓜白粉病抗性基因Pm_2F緊密連鎖的特異片段及其擴(kuò)增序列的獲得一、材料和方法1. 1 材料供試材料親本為日本類型甜瓜材料K7-1和典型的新疆哈密瓜株系K7-2。兩材料 均由新疆農(nóng)科院吳明珠院士提供。父本K7-1為日本高抗白粉病材料，母本K7-2高感白粉 病，為典型的新疆哈密瓜，果實(shí)糖度高，肉質(zhì)脆，貨架期長，有特殊的芳香味。以二者為親本 進(jìn)行雜交，從它們的雜交后代F2材料中隨機(jī)抽樣自交，通過單粒傳獲得F8重組自交系構(gòu)成 RIL群體，共106個株系，用于特異片段及序列研究。為進(jìn)一步驗(yàn)證獲得的標(biāo)記，還采用了本實(shí)驗(yàn)室特有的120份優(yōu)良甜瓜種質(zhì)資源， 其中13份抗病種質(zhì)資源，107份感病種質(zhì)資源。1. 2研究方法1. 2. 1基因組DNA的提取參照Murry 等(1980)的方法(Murray Μ, Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J], Nucl Acid Res，1980，8 :668_673.)加以改進(jìn)后進(jìn)行DNA提取。將1. 5克葉片在液氮中研磨成粉末，加入9ml 2% CTAB提取液(2% CTAB, 1. 4mM NaCl，IOOmM Tris-HCl pH8. 0,20mM EDTA pH8. 0,1% PVP-40,0. 2% β-巰基乙醇)，混勻 65°C水浴1小時(shí)；從水浴中取出離心管，加1/3體積5M醋酸鉀，混勻，冰浴20分鐘；加入等 體積氯仿/異戊醇(24 1)抽提兩次；取上清加入2/3體積異丙醇沉淀DNA;洗滌緩沖液 (76% 乙醇，IOmM 乙酸銨)洗滌一次，吹干，加 TE緩沖液(IOmM Tri s_HCl，lmM EDTA，pH7. 4)
5溶解；加入RNase A使其終濃度達(dá)100 μ g/ml，混勻37°C水浴1小時(shí)；用等體積氯仿/異戊 醇(24 1)抽提；取上清，加入1/2體積7. 5M醋酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀DNA ；70% 乙醇洗滌沉淀，吹干，加適量ddH20溶解DNA。DNA濃度用紫外分光光度計(jì)(Shimadzu UV-1201，日本)以0D260值測定，并用 0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。1. 2. 2PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物的檢測25μ 1 的反應(yīng)體系中含有 2. 5μ 1 10 X buffer, 2. 0 μ 1 25mM MgCl2, 2. 0 μ 1 2. 5mM dNTP, IU Taq DNA聚合酶，30ng引物，50ng模板DNA。Taq DNA聚合酶及反應(yīng)緩沖液購自 TaKaRa公司。dNTP購自上海Sangon公司。SSR引物由北京奧科生物公司合成。反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性 5min，然后 94°C lmin，52°C lmin，72°C 2min 下循環(huán) 35 次， 72°C延伸7min后保存在4°C條件下。PCR儀為美國Biorad公司制造的PTC-100。取擴(kuò)增產(chǎn)物與載樣緩沖液(98%甲酰胺，IOmM EDTA，0. 25%溴酚蘭，0. 25%二甲苯 青)各5μ1混合，94°C變性5min，立即置于冰上冷卻。每個樣品取5 μ 1上樣，采用6 %聚 丙烯酰胺凝膠、75W恒功率電泳分離，至二甲苯青指示劑跑到膠的2/3處結(jié)束電泳。銀染顯 現(xiàn)結(jié)果并分析。1. 2. 3特異擴(kuò)增PCR產(chǎn)物與白粉病抗性基因的連鎖關(guān)系銀染顯現(xiàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，對電泳譜帶進(jìn)行分析。來自父本Κ7-1的純合帶型記為 “a”，來自母本Κ7-2的純合帶型記為“b”，模糊不清或者丟失的帶記為“-”。利用Joinmap3. 0 軟件分析特異擴(kuò)增PCR產(chǎn)物與白粉病抗性基因的連鎖關(guān)系。1. 2. 4特異擴(kuò)增序列的獲得確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與白粉病抗性基因存在緊密連鎖關(guān)系后，用ddH20將膠板沖 洗干凈，用刀片切取差異條帶，浸泡在高鹽緩沖液中(20%乙醇，IM LiCl，IOmM Tris) 24h, 然后氯仿抽提，乙醇沉淀后吹干，溶于ddH20中，取5μ 1用作模板在與選擇性擴(kuò)增相同的 PCR條件下重新擴(kuò)增。產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖上檢測，如果確定為目標(biāo)帶，采用博奧生物公 司的凝膠回收純化試劑盒Gene-Clean對目的片段進(jìn)行純化。PCR產(chǎn)物與載體的連接采用 Promega公司的PGEM-T easy Vector系統(tǒng)。參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中的方法進(jìn)行重組 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與篩選。利用天根生物公司的質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，采用酶切方法與 PCR法對其進(jìn)行檢測。將經(jīng)過PCR和酶切檢測為陽性克隆的質(zhì)粒送于北京奧科生物公司進(jìn) 行測序并提供結(jié)果。1. 2. 5父本、母本、F1和重組自交系苗期抗病接種鑒定
0053]1. 2. 5. 1白粉病菌源及接種菌源制備從國家蔬菜工程技術(shù)研究中心四季青農(nóng)場收集南瓜上的白粉病菌，采用孢子懸浮 液噴霧法接種于西葫蘆幼苗上純化繁殖后，用于白粉病的接種鑒定。用毛筆刷取西葫蘆病葉葉片上的孢子置于無菌水的燒杯中，攪拌均勻配制孢子懸 浮液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分生孢子數(shù)。接種濃度為2. OX IO5個孢子/mL。1. 2. 5. 2苗期抗病接種鑒定父本、母本、F1和重組自交系F8的106個株系，各取20粒種子，設(shè)2次重復(fù)，1次 重復(fù)10株苗。種子用紗布包好，55°C溫湯浸種消毒后，再浸泡4h，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中 催芽18小時(shí)，播于裝有滅菌營養(yǎng)土的72孔穴盤中，生長于空調(diào)溫室內(nèi)，晝/夜溫度為25 280C /18 200C 0子葉展平后，采用孢子粉噴霧法接種S. fuliginea小種2F，接種12至15 天充分發(fā)病后開始調(diào)查抗感反應(yīng)。1. 2. 5. 3苗期抗病接種鑒定的分級標(biāo)準(zhǔn)共分6級。0級整株沒有任何病斑；1級僅子葉有很少量病斑；2級僅子葉有 較多病斑或子葉有病斑，莖上有很少量病斑；3級子葉有很多病斑，莖上有少量病斑；4級 子葉和莖上布滿病斑；5級植株死亡。1. 2. 5. 4父本、母本、F1和重組自交系苗期抗感表現(xiàn)型的確定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)病情指數(shù)DI確定父本、母本J1和重組自交系的抗感表現(xiàn)型。病情指數(shù)DI = ( Σ級別X株數(shù))X 100/ (總株數(shù)X 6)。病情指數(shù)大于40定為感病，小于40定為抗病。二、結(jié)果與分析2. 1甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F遺傳規(guī)律分析對抗病親本K7-1、感病親本K7-2、F1、重組自交系F8的106個株系進(jìn)行苗期抗病 接種鑒定，按照白粉病病情分級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查每個株系的發(fā)病率并計(jì)算病情指數(shù)。結(jié)果表明， K7-UK7-2和F1的病情指數(shù)分別是0. 00,93. 03和3. 44，分別表現(xiàn)為抗病、感病、抗病，說明 甜瓜K7-1對白粉病S. fuliginea生理小種2F的抗性是由顯性基因控制。而重組自交系的 抗病鑒定結(jié)果表明106個株系有58個抗病株系和48個感病株系，分離比符合1 1的理 論比例，卡平方檢驗(yàn)X2 = 0.94 < Q2a05a = 3. 84，表明甜瓜K7-1對白粉病S. fuliginea 生理小種2F的抗性為一對基因控制。綜合雙親、&和重組自交系的106個株系的苗期抗病 鑒定結(jié)果，甜瓜K7-1對白粉病S. fuliginea生理小種2F的抗性受一對顯性基因Pm_2F控 制。2. 2與甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F緊密連鎖的特異片段采用集團(tuán)混合分析法獲得與甜瓜白粉病抗性基因Pm_2F緊密連鎖的特異片段。根據(jù)重組自交系苗期抗病鑒定結(jié)果，各取5份純合的抗感株系DNA混合構(gòu)建抗感 基因池。以抗病親本K7-1、感病親本K7-2、Fi和抗感基因池為模板，對660對SSR引物組合進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，篩選出能在雙親和抗感基因池之間產(chǎn)生明顯差異條帶的引物組合。660對SSR 引物序列來自于目前已經(jīng)發(fā)表的論文(Danin-Poleg-2001, Genzalo et al. 2005，Joobeur T et al，2004，F(xiàn)azio et al. 2002)和根據(jù)互連網(wǎng)中甜瓜 EST 信息庫(http://melon.bti. Cornell, edu)自行設(shè)計(jì)。集團(tuán)混合分析結(jié)果顯示，660對SSR引物中只有引物SSR509和SSR510的抗感親 本擴(kuò)增條帶與抗感池的擴(kuò)增譜帶一致，如圖ι所示，圖ι為引物SSR509和SSR510對抗感親 本、F1、抗感池的 PCR擴(kuò)增結(jié)果。(M. 30-330bpmarker ； 1,6. K7-2 ；2,7. K7-1 ；3,8. Fl ；4,9.抗 病基因池；5，10.感病基因池)所述SSR引物509上游引物序列為5，-CTGGCCCCCTCCTAAACTAA-3，，509下游引物 序列為 5，-CAAAAAGCATCAAAATGGTTG-3，。所述SSR引物510上游引物序列為5，-TTTCACTTTTTCCCGCCG_3，，510下游引物序 列為 5，-AATGGAAAAGGGAAGTGCAA-3，。將抗病親本K7-1利用引物SSR509和SSR510進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的抗病特異擴(kuò)增 片段分別定名為SSR509-172和SSR510—98。將感病親本K7—2利用引物SSR509和SSR510進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的感病特異擴(kuò)增片段分別定名為SSR509-170和SSR510-104。利用引物SSR509和SSR510分別對106個重組自交系的株系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物SSR509的PCR擴(kuò)增中，如圖2所示，圖2為引物SSR509對重組自交系群體 的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖(1 :K7-1 ;2 :K7-2 ;3-57 :RTL株系)。58個抗病株系中有56個株系只 擴(kuò)增出SSR509-172抗病特異片段，2個抗病株系同時(shí)擴(kuò)增出SSR509-172抗病特異片段和 SSR509-170感病特異片段，F(xiàn)7和F8兩代苗期抗病接種鑒定結(jié)果顯示這2個抗病株系為雜 合株系，因此PCR擴(kuò)增結(jié)果與田間抗病鑒定結(jié)果一致。48個感病株系中有47個株系只擴(kuò)增 出SSR509-170感病特異片段，1個株系擴(kuò)增出SSR509-172抗病特異片段，即106個重組自 交系株系中只有1個交換株系。經(jīng)Joinmap3. 0軟件分析，抗病特異片段SSR509-172與甜 瓜白粉病抗性基因Pm_2F的連鎖距離為1cm，呈現(xiàn)緊密連鎖關(guān)系。引物SSR510擴(kuò)增中，如圖3所示，圖3引物SSR510對重組自交系群體的PCR擴(kuò) 增結(jié)果圖(1 :K7-1 ；2 :Κ7-2 ；3-50 =RIL株系；)。58個抗病株系中有55個株系只擴(kuò)增出 SSR510-98抗病特異片段，2個抗病株系同時(shí)擴(kuò)增出SSR510-98抗病特異片段和SSR510-104 感病特異片段，F(xiàn)7和F8兩代苗期抗病接種鑒定結(jié)果顯示這2個抗病株系為雜合株系，1個抗 病株系只擴(kuò)增出SSR510-104感病特異片段，表明該抗病株系為交換株系。48個感病株系 中有47個株系只擴(kuò)增出SSR510-104感病特異片段，1個感病株系擴(kuò)增出SSR510-98抗病 特異片段，說明此感病株系也為交換株系。因此，106個重組自交系株系中共有2個交換株 系。經(jīng)Joinmap3. 0軟件分析，抗病特異片段SSR510-98與甜瓜白粉病抗性基因Pm_2F的連 鎖距離為3cM，呈現(xiàn)緊密連鎖關(guān)系。為進(jìn)一步確認(rèn)抗病特異片段SSR509-172、SSR510-98與甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F的連鎖關(guān)系，利用本實(shí)驗(yàn)室的120份優(yōu)良甜瓜種質(zhì)資源材料進(jìn)行驗(yàn)證。田間抗病鑒定 結(jié)果顯示120份甜瓜種質(zhì)資源材料中有13個抗病品種和107個感病品種。SSR509的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，如圖4所示，圖4為引物SSR 509對甜瓜種質(zhì)資源的 PCR擴(kuò)增結(jié)果圖；13個抗病品種中有4個品種擴(kuò)增出SSR509-172抗病特異片段，其余品種 擴(kuò)增出的譜帶在另一位置；107個感病品種中有101個擴(kuò)增出SSR509-170感病特異片段， 與田間抗病鑒定結(jié)果吻合率為87. 5%。SSR510擴(kuò)增結(jié)果顯示，如圖5所示，圖5為引物SSR 510對甜瓜種質(zhì)資源的PCR擴(kuò) 增結(jié)果圖；13個抗病品種中有4個品種擴(kuò)增出SSR510-98抗病特異片段，107個感病品種中 有83個擴(kuò)增出SSR510-104感病特異片段，與田間調(diào)查結(jié)果的吻合率達(dá)到72.5%。上述PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了抗病特異片段SSR509-172和SSR510-98、感病特 異片段SSR509-170和SSR510-104與甜瓜白粉病抗性基因Pm_2F的緊密連鎖關(guān)系，準(zhǔn)確性 高，說明上述標(biāo)記片段在鑒別抗、感病品種時(shí)有非常高的利用價(jià)值。2. 4特異片段的測序結(jié)果將抗病特異擴(kuò)增片段SSR509-172和SSR510-98和感病特異擴(kuò)增片段SSR509-170 和SSR510-104進(jìn)行測序。4個測序片段的兩端分別有引物SSR509和SSR510的上下游結(jié)合 位點(diǎn)，且片段的大小與依分子量標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)的基本吻合，證實(shí)了測序片段的正確性。利用SSR 引物509擴(kuò)增得到的抗、感特異片段長度分別為172bp和170bp，只有2個堿基“CT”的插 入。利用SSR引物510擴(kuò)增得到的抗、感特異片段長度分別為98bp和102bp，只有4個堿基 “CTCT”的缺失。
權(quán)利要求
一種與甜瓜白粉病抗性基因Pm 2F緊密連鎖的特異片段，其特征在于，其如序列表SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示。
2.一種與甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F緊密連鎖的特異片段的獲得方法，其特征在于， 所述方法包括如下步驟(1)與甜瓜白粉病抗性基因Pm_2F緊密連鎖的特異片段的篩選提取基因組DNA，使用 SSR引物對基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析；通過BSA法，尋找與甜瓜 白粉病抗性基因Pm-2F緊密連鎖的特異SSR片段，測定連鎖距離并驗(yàn)證連鎖關(guān)系；(2)與甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F緊密連鎖的特異擴(kuò)增序列的獲得對SSR產(chǎn)物進(jìn)行 回收、克隆和測序，獲得特異片段序列。所述步驟(1)中SSR引物為SSR引物510 ；所述SSR引物510上游引物序列為5’-TTTCACTTTTTCCCGCCG-3’，510下游引物序列為 5’ -AATGGAAAAGGGAAGTGCAA-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種與甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F緊密連鎖的特異片段的 獲得方法，其特征在于，所述步驟(1)中的提取基因組DNA是指將1.5克葉片在液氮中研磨 成粉末，加入9ml 2% CTAB提取液，混勻65°C水浴1小時(shí)；從水浴中取出離心管，加1/3體 積5M醋酸鉀，混勻冰浴20分鐘；加入等體積氯仿/異戊醇抽提兩次；取上清加入2/3體積 異丙醇沉淀DNA ；洗滌緩沖液洗滌一次，吹干，加TE緩沖液溶解；加入RNaseA使其終濃度達(dá) 100 μ g/ml，混勻37°C水浴1小時(shí)；用等體積氯仿/異戊醇抽提；取上清，加入1/2體積7. 5M 醋酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀DNA ；70%乙醇洗滌沉淀，吹干，加適量ddH20溶解DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種與甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F緊密連鎖的特異片段的獲 得方法，其特征在于，所述步驟(1)中的PCR反應(yīng)條件是25μ1的反應(yīng)體系中含有2.5μ1 10 Xbuffer, 2. 0 μ 1 25mM MgCl2, 2. 0 μ 1 2. 5mM dNTP, IU Taq DNA 聚合酶，30ng SSR 引物， 50ng模板DNA ；反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min，然后94°C lmin，52°C lmin，72°C 2min下循環(huán) 35次，72 °C延伸7min后保存在4°C條件下。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種與甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F緊密連鎖的特異片段的 獲得方法，其特征在于，所述步驟(2)中的SSR產(chǎn)物的回收、克隆和測序是指用Gene-Clean 試劑盒純化回收已證明是連鎖的SSR特異片段，然后連接到pGEM@-T Vector Easy載體上， 將重組質(zhì)粒DNA用EcoRI進(jìn)行酶切處理，用SSR-PCR驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物，觀察擴(kuò)增出的片段是否 與原來的目的片段和酶切片段一致，并測序。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F緊密連鎖的特異片段，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，其如序列表SEQ ID NO2和4所示。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明獲得的SSR特異片段具有重復(fù)性好，標(biāo)記穩(wěn)定可靠，便于統(tǒng)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)，其特異擴(kuò)增序列亦是開發(fā)其它特異標(biāo)記的基礎(chǔ)，并且在鑒別抗、感病品種時(shí)有非常高的利用價(jià)值。
文檔編號C12N15/10GK101899439SQ20101023888
公開日2010年12月1日 申請日期2007年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月23日
發(fā)明者宮國義, 張海英, 蘇芳, 許勇, 郭紹貴 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院