專(zhuān)利名稱(chēng):棗樹(shù)水通道蛋白基因及在提高植物耐旱性和耐鹽性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉 及基因工程技術(shù)領(lǐng)域,具體為一種棗樹(shù)水通道蛋白基因及在提高植物耐 旱性和耐鹽性中的應(yīng)用。
背景技術(shù):
公知,水通道蛋白(aquaporin,AQP)大量存在于植物、動(dòng)物、微生物等多種生物體 內(nèi)。植物水通道蛋白是一類(lèi)在植物體內(nèi)形成水選擇性運(yùn)輸通道的蛋白質(zhì),它在植物種子萌 發(fā)、細(xì)胞伸長(zhǎng)、氣孔運(yùn)動(dòng)等過(guò)程中調(diào)節(jié)水分的快速跨膜運(yùn)輸,它使植物能快速靈敏地調(diào)節(jié)細(xì) 胞內(nèi)與細(xì)胞間的水分流動(dòng)。有些水通道蛋白是組成型表達(dá)的,而多數(shù)水通道蛋白則受環(huán)境 因子,如干旱、鹽害、激素、光質(zhì)等誘導(dǎo)表達(dá),因此研究水通道蛋白與植物抗逆性的關(guān)系備受 人們關(guān)注。第一個(gè)植物水通道蛋白Y-TIP是從模式植物擬南芥中分離出來(lái)的,它位于液泡 膜上,因此被命名為T(mén)IP(tonoplast intrinsic protein)。通過(guò)爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分 析確認(rèn)了 Y-TIP蛋白運(yùn)輸水的專(zhuān)一性功能。到目前為止,科學(xué)家已經(jīng)在擬南芥、豌豆、煙 草、玉米、水稻等多種植物中都發(fā)現(xiàn)了 AQP。另外,從蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中也發(fā)現(xiàn)了大量AQP的同源 物,它們廣泛存在于單子葉和雙子葉植物以及C3和C4代謝植物中,通過(guò)氨基酸序列同源性 分析推測(cè)它們可能也是AQP。越來(lái)越多的研究表明,大多數(shù)植物中都存在著多個(gè)AQP及其 同源物且含量豐富。如擬南芥中,PIPl蛋白占葉與根質(zhì)膜蛋白的以上;菠菜葉肉細(xì)胞 中含豐富的質(zhì)膜AQP,占其質(zhì)膜總蛋白的20% ;菜豆子葉中含豐富的a-TIP同源物,約占細(xì) 胞可抽提總蛋白的2%。根據(jù)水通道蛋白氨基酸序列同源性及結(jié)構(gòu)特征,可將其分為4類(lèi) 質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(plasma membrane intrinsic protein,PIPs)、液泡膜內(nèi)在蛋白(tonoplast intrinsic protein,TIPs)、類(lèi)nodulin26膜內(nèi)蛋白(nodulin26_like intrinsic protein, NIPs)和小分子堿性?xún)?nèi)在蛋白(small and basic intrinsic protein,SIPs)。植物水通道蛋白的發(fā)現(xiàn)是植物水分生理學(xué)研究的重大進(jìn)展,將水分代謝的研究引 入了一個(gè)全新的階段。目前,科學(xué)家們已經(jīng)在擬南芥、豌豆、玉米、煙草、向日葵、含羞草等多 種植物中發(fā)現(xiàn)了 AQP,并對(duì)它們中的某些蛋白進(jìn)行了分類(lèi)、功能、亞細(xì)胞定位等方面的研究。 但是對(duì)于中國(guó)古老的、重要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種——棗樹(shù)的水通道蛋白的研究還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道, 到目前為止,還未見(jiàn)有從棗樹(shù)中分離出AQP基因并用于提高植物耐旱性和耐鹽性方面的報(bào) 道。棗樹(shù)原產(chǎn)于我國(guó)黃河流域,是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種之一,棗樹(shù)耐寒,抗旱,抵御各種 外界不良因子的能力強(qiáng),尤其是對(duì)土壤瘠薄、干旱有很強(qiáng)的忍耐力,在晉西北、太行山、陜北 等黃土高原地區(qū),棗樹(shù)一般生長(zhǎng)在土壤相當(dāng)貧瘠、少雨干旱的丘陵山坡、高崖邊等不良環(huán)境 下,且都能正常生長(zhǎng)結(jié)果。這種極其耐旱、耐瘠薄的特點(diǎn)顯著優(yōu)于其它農(nóng)作物,因此棗樹(shù)的 抗逆性基因是非常寶貴的遺傳資源,了解具有優(yōu)良抗性的棗樹(shù)的抗逆機(jī)制,逆境相關(guān)基因 的分子結(jié)構(gòu)、表達(dá)、功能及調(diào)控,可充分利用這些優(yōu)良抗性基因提高植物的抗逆性提供一定 的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和奠定理論基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種棗樹(shù)水通道蛋白基因,該基因來(lái)自于棗樹(shù),可作為目 的基因?qū)胫参?,提高植物耐旱性和耐鹽性,進(jìn)行植物品種改良。本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種棗樹(shù)水通道蛋白基因,該基因的核苷酸 序列具有如SEQ ID NO 1所示的序列。由所述一種棗樹(shù)水通道蛋白基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列,該氨基酸序列 具有如SEQ ID NO :2所示的序列。一種棗樹(shù)水通道蛋白基因在提高植物耐旱性和耐鹽性中的應(yīng)用。本發(fā)明從壺瓶棗樹(shù)(Ziziphus jujuba Mill. HUPING)的結(jié)果枝(棗吊),利用CTAB 法提取總RNA,根據(jù)mRNA純化試劑盒方法從提取到的總RNA中分離純化mRNA,構(gòu)建cDNA文 庫(kù),然后通過(guò)Blast分析與比對(duì),從中克隆到一個(gè)cDNA序列為棗樹(shù)中的水通道蛋白基因全 序列,將其命名為 ZjPIP2 (Zizyphus jujuba Mill plasma membrane intrinsic protein)。 根據(jù)該基因的核苷酸序列,設(shè)計(jì)并合成引物,上游引物WP3序列為5' —ATGGATCC]ΑΤ<^'GCAAAAGACCCTG-3‘,包含 BamH I 限制性酶切位點(diǎn)(即有下
劃線部分),兩個(gè)保護(hù)堿基AT,及水通道蛋白ZjPIP2基因的起始密碼子ATG。下游引物WP6 序列為5' —ATACCCGGGjTCA]AACATGAGGGTT-3‘,包含Sam I 限制性酶切位點(diǎn)(即有下劃 線部分),三個(gè)保護(hù)堿基ATA,及水通道蛋白Z jPIP2基因的終止密碼子TGA (反向序列)。引 物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。然后使用PCR技術(shù)成功擴(kuò)增出ZjPIP2的目 的基因片段,電泳分析ZjPIP2基因的cDNA序列全長(zhǎng)為846bp,編碼281氨基酸,其中包含有 16個(gè)酸性氨基酸,19個(gè)堿性氨基酸,蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量為29. 87KD,理論等電點(diǎn)為8. 77。 多重比對(duì)表明ZjPIP2與其他水通道蛋白有非常高的同源性,特別是與菜豆PIP2的同源性 達(dá)到88%。而且,ZjPIP2蛋白序列當(dāng)中含有MIP家族典型的保守氨基酸序列“HINPAVIFG” 和兩個(gè)“NPA”保守肽段。進(jìn)化樹(shù)分析表明棗樹(shù)ZjPIP2和茄科煙草屬的粉藍(lán)煙草親緣關(guān)系 最近。特別是三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析暗示著ZjPIP2跟菠菜水通道蛋白相似,推測(cè)其功能有著類(lèi)似 性。上述同源性分析、氨基酸序列特性分析以及氨基酸序列的進(jìn)化樹(shù)分析、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等 分析手段是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的常規(guī)驗(yàn)證手段,通過(guò)上述多重對(duì)比分析,即可證 明本發(fā)明克隆得到的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列即為本發(fā)明所述的棗樹(shù)水通道蛋 白基因的序列,而且其蛋白功能也被唯一確定。本發(fā)明在PCR克隆得到ZjPIP2基因后,經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶修飾后連接到植物表 達(dá)載體PBI121上,經(jīng)含卡納霉素的LB平板篩選、PCR、酶切、測(cè)序等方法證明植物表達(dá)載 體pBII21-ZjPIP2構(gòu)建成功。通過(guò)凍融法將植物表達(dá)載體pBI121_ZjPIP2轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿 菌LBA4404的感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)含卡納霉素的YEB平板篩選、PCR鑒定等方法證明工程菌 pBI121-ZjPIP2-L構(gòu)建成功。農(nóng)桿菌介導(dǎo)ZjPIP2基因轉(zhuǎn)化擬南芥,經(jīng)含卡納霉素的1/2MS 培養(yǎng)基篩選獲得含有目的基因ZjPIP2的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株,然后對(duì)轉(zhuǎn)基因植物及其Tl代 進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)及耐旱性性評(píng)價(jià),經(jīng)在0. IM NaCl溶液連續(xù)處理3天(鹽處理)或是不澆 任何液體(干旱處理),觀察其生長(zhǎng)表現(xiàn),均能夠在正常生長(zhǎng)條件下恢復(fù)。
此外,本發(fā)明為了進(jìn)一步研究ZjPIP2基因在棗樹(shù)體內(nèi)的表達(dá),分別對(duì)盆栽壺瓶棗 樹(shù)苗進(jìn)行干旱、NaCl脅迫處理,并以未作任何處理的正常壺瓶棗樹(shù)苗為對(duì)照,研究逆境因素 對(duì)ZjPIP2基因表達(dá)的影響,當(dāng)處理過(guò)的樹(shù)苗出現(xiàn)嚴(yán)重卷葉、枯黃現(xiàn)象時(shí),立即采樣并速凍 保存于-80°C冰箱。用CTAB法提取所采集到的對(duì)照及脅迫處理過(guò)的植物材料的總RNA,經(jīng) OD260值的測(cè)定、甲醛變性膠電泳等方法檢測(cè)證明所提RNA純度高、無(wú)降解,質(zhì)量合格。反轉(zhuǎn) 錄所提總RNA,RT-PCR分析得Z jPIP2基因在植物莖、葉中的表達(dá)比較穩(wěn)定,同時(shí)證實(shí)ZjPIP2 可受干旱、NaCl脅迫等逆境因素誘導(dǎo)表達(dá)。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并從棗樹(shù)中克隆出棗樹(shù)水通道蛋白基因 ZjPIP2,該基因可作為目的基因?qū)胫参?,提高植物耐鹽性和耐旱性,以進(jìn)行植物品種改 良,明確了具有優(yōu)良抗性的棗樹(shù)的抗逆機(jī)制,逆境相關(guān)基因的分子結(jié)構(gòu)、表達(dá)、功能及調(diào)控, 為進(jìn)一步充分利用這些優(yōu)良抗性基因提高植物的抗逆性提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),奠定了一 定的理論基礎(chǔ)。
圖1為目的基因ZjPIP2的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖;圖2為pBI121載體及目的基因ZjPIP2的雙酶切圖譜;圖3為重組質(zhì)粒pBI121_ZjPIP2的酶切圖譜;圖4為植物表達(dá)載體pBI121_ZjPIP2的構(gòu)建過(guò)程示意圖;圖5為工程菌pBI121-ZjPIP2_L的PCR鑒定圖譜;圖6(a)為棗樹(shù)不同環(huán)境、組織器官中內(nèi)參基因ZjH3的差異性表達(dá)圖譜一;圖6(b)為棗樹(shù)不同環(huán)境、組織器官中內(nèi)參基因ZjH3的差異性表達(dá)圖譜二 ;圖7為ZjPIP2基因在不同環(huán)境、組織器官的差異性表達(dá)圖譜。
具體實(shí)施例方式一、棗樹(shù)水通道蛋白基因ZjPIP2的獲得春天采集壺瓶棗樹(shù)(Ziziphus jujuba Mill.HUPING)長(zhǎng)度約2mm的結(jié)果枝(棗 吊),利用CTAB法提取總RNA,根據(jù)mRNA純化試劑盒(貨號(hào):Z5200)購(gòu)自Promega (美國(guó)) 方法從提取到的總RNA中分離純化mRNA。利用cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒(貨號(hào)18248_039) 購(gòu)自Invitrogen (美國(guó))構(gòu)建cDNA文庫(kù)。將獲得的文庫(kù)中的cDNA與克隆載體pSPORTl連 接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含有氨芐青霉素抗性的平皿37°C培 養(yǎng)過(guò)夜,藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒,并隨機(jī)挑選部分質(zhì)粒委托上海生工測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果利用NCBI (www, ncbi. nlm. nih. rov/)在線分析軟件進(jìn)行Blast分 析,結(jié)果表明其中的一個(gè)cDNA序列為棗樹(shù)中的水通道蛋白同源基因全序列。將其命名為 ZjPIP2 (Zizyphus jujuba Mill plasma membrane intrinsic nrotein)。根據(jù)上述已經(jīng)獲得的棗樹(shù)水通道蛋白基因的精確核苷酸序列設(shè)計(jì)并委托上海生 工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成如下引物,用于ZjPIP2基因的克隆。上游引物WP3序 列為5' -ATGGATCCATGGCAAAAGACCCTG-3 ‘,包含BamH I限制性酶切位點(diǎn)(即有下劃線部 分),兩個(gè)保護(hù)堿基AT,及水通道蛋白ZjPIP2基因的起始密碼子ATG。下游引物WP6序列為 5 ‘ -ATACCCGGGTCAAACATGAGGGTT-3 ‘,包含Sam I限制性酶切位點(diǎn)(即有下劃線部分),三個(gè)保護(hù)堿基ATA,及水通道蛋白ZjPIP2基因的終止密碼子TGA。引物由上海生工生物工程 技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以克隆載體pSP0RTl_ZjPIP2為模板,以WP3和WP6為引物,擴(kuò)增獲得含完整 開(kāi)放閱讀框的棗樹(shù)水通道蛋白基因。PCR反應(yīng)體系組成為5 μ L 10XPCR buffer, 1 μ L 2. 5MmdNTPs, IOpmol WP3, IOpmol WP6,1. 5U Taq DNA聚合酶,50ng 的模板,去離子水補(bǔ)充體 IRM 50 μ L0 PCR 擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性 5min,94°C 30s、54°C 30s,72°C Imin 35 個(gè)循環(huán), 最后72°C延伸5min。取5yL PCR產(chǎn)物,1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析確認(rèn)片段大小。按照DNA純化試劑 盒說(shuō)明操作,純化PCR產(chǎn)物。二、ZJPIP2基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建
1、材料、試劑與儀器1.1載體和菌株植物表達(dá)載體PBI121均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心園藝作物研究室 保存,大腸桿菌(E. coli)DH5a、含ZjPIP2基因的重組質(zhì)粒pSP0RTl_ZjPIP2。1. 2酶與試劑盒限制性?xún)?nèi)切酶 BamH I、Sma I、Xba I、Sac I、DNA Ligation Kit、RNA 酶、 PrimeScript RT reagent Kit、 Taq _、 dNTP Mixture> DNA Marker(15000bp>2000bp ladder)均購(gòu)自大連TaKaRa (寶生物)工程有限公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 QIAquick 購(gòu)自 QIAGEN 公司。1. 3常用試劑及培養(yǎng)基卡那青霉素(100mg/mL),酚氯仿異戊醇(V V V = 25 24 1)葡萄糖溶液(IM)EDTA (0. 5M, ρΗ8· 0)10ΧΤΒΕ電泳緩沖液硼酸55.2g/LTris108g/LEDTA (0. 5M, ρΗ8· 0) 40mL10% SDS (pH7. 2)NaOH (2M)Tris-HCl (1M, pH8. 0)醋酸鈉(3M,pH5.2)TE 溶液(IOmM Tris-Hcl, IMm EDTA, pH8. 0)LB培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基加瓊脂0. 15g/L)蛋白胨0. lg/L酵母提取物 0.05g/LNaCl0. 05g/L2實(shí)驗(yàn)方法2. 1大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的制作
用CaCl2法制備大腸桿菌(E.Coli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞,具體方法見(jiàn)精編分子生物 學(xué)實(shí)驗(yàn)指南。2. 2PCR引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)棗樹(shù)水通道蛋白基因cDNA編碼的序列,設(shè)計(jì)帶有Ba mH I和Sam I酶切位點(diǎn) 的特異性引物,并委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,用于ZjPIP2基因及組蛋 白基因的克隆。ZjPIP2 基因的上游引物 WP3 序列為5 ‘ -ATGGATCCATGGCAAAAGACCCTG-3 ‘,包含 BamH I限制性酶切位點(diǎn)(即有下劃線部分),兩個(gè)保護(hù)堿基AT,及水通道蛋白ZjPIP2基因 的起始密碼子ATG。下游引物WP6 的序列為5' -ATACCCGGGTCAAACATGAGGGTT-3 ‘,包含 Sam I 限制 性酶切位點(diǎn)(即有下劃線部分),三個(gè)保護(hù)堿基ATA,及水通道蛋白ZjPIP2基因的終止密碼 子 TGA。2. 3質(zhì)粒pBI121和pSP0RTl_ZjPIP2的少量制備及目的基因ZjPIP2的擴(kuò)增2. 3. 1 載體 pBI121、pSP0RTl-ZjPIP2 的少量制備pSP0RTl-ZjPIP2質(zhì)粒的DH5 α菌液用2mL的LB液體培養(yǎng)基加1 μ 1氨芐青霉素 (100mg/mL)接菌后37°C過(guò)夜培養(yǎng)所得。含pBI121質(zhì)粒的DH5 α菌液則用2mL的LB液體 培養(yǎng)基加1 μ L卡那青霉素(100mg/mL)接菌后37°C過(guò)夜培養(yǎng)所得。堿裂解法快速提取質(zhì)粒pBI121、pSP0RTl_ZjPIP2的具體步驟見(jiàn)精編分子生物學(xué)
實(shí)驗(yàn)指南。最后將干燥的質(zhì)粒溶于20 μ 1 TE中,-20°C保存?zhèn)溆谩?. 3. 2目的基因序列的擴(kuò)增以克隆載體pSPORTl (攜帶目的片段)為模板,用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 以獲得含完整開(kāi)放閱讀框的棗水通道蛋白基因。先利用梯度PCR技術(shù)設(shè)置不同的退火溫 度,找出最佳退火溫度為54°C。PCR擴(kuò)增 ZjPIP2 基因的反應(yīng)體系10 X PCRbuffer 5 μ 1 (含Mg 離子),dNTP 1 μ 1, 上下游引物各1μ l(20pmol/L),rTaq聚合酶0. 3 μ 1,模板DNA 1 μ 1 (2. 3 μ g/μ 1),滅菌超 純水加40. 7 μ 1至總體積為50 μ 1。擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性5min,94°C變性lmin,54°C退 火lmin,72°C延伸2min,共40個(gè)循環(huán),最后72°C延伸5min。2. 4目的基因ZjPIP2和載體pBI121的準(zhǔn)備因?yàn)镻CR擴(kuò)增獲得的目的基因片段兩端及PBI121載體的多克隆位點(diǎn)都具有BamH I和Sma I限制性酶切位點(diǎn),利用BamH I和Sma I分別雙酶切目的基因Z jPIP2的PCR產(chǎn)物 及載體PBI121,使它們都具有相同的粘性末端,為連接載體做準(zhǔn)備。PCR產(chǎn)物的酶切反應(yīng)體系 注PCR產(chǎn)物的體積依據(jù)其濃度而定,最少酶切1 2 μ g目的基因片段。最后加 超純水至總體積為50 μ 1。載體pGEX-4T-l的酶切反應(yīng)體系 酶切后分別取5μ 1雙酶切產(chǎn)物,1. 0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析,確認(rèn)片段大小 都與預(yù)期相吻合。2. 5酶切產(chǎn)物的純化及連接按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒QIAquick 里的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,純化雙酶切后 的目的基因片段和載體。用T4DNA連接酶將純化后的pBI121載體與ZjPIP2基因片段進(jìn)行連接。將載體 PBI121的DNA與欲插入的目的基因ZjPIP2的DNA片段混合制備成體積為5 μ L左右的DNA 溶液(載體DNA和插入DNA的摩爾數(shù)比一般為0. 03pmol 0. 1 0. 3pmol),向上述DNA溶 液中加入等體積的DNA Ligation Kit中的Solution I,充分混勻。連接反應(yīng)體系總體積為 10 μ 1左右,16°C反應(yīng)過(guò)夜。采用設(shè)計(jì)構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-ZjPIP2。2. 6連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化將100 μ 1的新鮮或保存于_70°C的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α加入到上面的連接 產(chǎn)物中,輕輕混勻,冰上放置30min。放入預(yù)加溫到42°C的循環(huán)水浴中熱休克90s,快速將 管轉(zhuǎn)移到冰浴中,使細(xì)胞冷卻3 5min。加400 μ L的LB培養(yǎng)基,將管轉(zhuǎn)移到37°C的搖床 上,溫浴40min使細(xì)菌復(fù)蘇,復(fù)蘇期應(yīng)溫和的搖動(dòng)細(xì)胞(轉(zhuǎn)速低于225轉(zhuǎn)/min)。將適當(dāng)體 積的已轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到LB平板(含氨芐青霉素),涂勻。將平板置于室溫直至液體 被吸收,倒置平板,37°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜。2. 7轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的鑒定2. 7. IPCR 鑒定待轉(zhuǎn)化菌在含有卡那霉素抗性的LB平板上長(zhǎng)出菌落后,用無(wú)菌牙簽挑取轉(zhuǎn)化單菌落至50 μ L超純水中,沸水浴5min使菌裂解。取1 μ 1作為模板進(jìn)行PCR陽(yáng)性鑒定,反應(yīng)體 系為10 XPCR buffer 1. 5 μ 1 (含 Mg 離子),dNTP 0. 2 μ 1,上下游引物各 0. 5 μ 1 (20pmol/ L),rTaq聚合酶0. 1 μ 1,模板DNA 1μ 1 (2. 3 μ g/ μ 1),滅菌超純水加11. 2 μ 1至總體積為 15μ 1。擴(kuò)增條件同前,將鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化體劃線培養(yǎng)。2. 7. 2酶切鑒定將PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆子用堿裂減法提取質(zhì)粒DNA后,質(zhì)粒pBI121_ZjPIP2用 XbaI和Sac I進(jìn)行雙酶切鑒定,再用Sma I和Sac I進(jìn)行雙酶切鑒定。載體pBI121_ZjPIP2的Xba I和Sac I雙酶切反應(yīng)體系 載體pBI121_ZjPIP2的Sma I和Sac I雙酶切反應(yīng)體系 S. D. W 6 μ 1瓊脂糖凝膠電泳酶切液,驗(yàn)證片段的大小,保存有目的片段的陽(yáng)性菌落。并將陽(yáng)性 菌株送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序,驗(yàn)證重組質(zhì)粒讀碼框的正確性。3、ZJPIP2基因植物表達(dá)載體構(gòu)建的結(jié)果與分析3. lZjPIP2cDNA 的擴(kuò)增利用設(shè)計(jì)的特異性上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,產(chǎn)物在1. 0%瓊脂糖中電泳,經(jīng)EB 染色后在紫外燈下觀測(cè)到一條約850bp的條帶,如圖1所示,圖中M :DL2000Marker ;1,2 PCR產(chǎn)物,與所設(shè)計(jì)的擴(kuò)增目的片段大小吻合。3. 2目的基因片段及載體片段的制備將PCR產(chǎn)物和pBI121質(zhì)粒用BamH I和Sma I雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳,結(jié) 果如圖 2 所示,圖中,Ml :DL15000Marker ;1 :pBI121 酶切產(chǎn)物;M2 :DL2000Marker ;2 目的 基因酶切產(chǎn)物,PCR產(chǎn)物大小約為850bp,pBI121載體片段分別約為14. 7Kb,與預(yù)期結(jié)果相 符。分別用試劑盒純化目的片段與載體片段,用于連接。3. 3重組質(zhì)粒的鑒定從含有卡那霉素的培養(yǎng)基上挑取陽(yáng)性單菌落進(jìn)行PCR鑒定,如圖3所示,圖中,M DL2000Marker ;1,2 陽(yáng)性克隆,與預(yù)期結(jié)果相符;初步推斷重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,且重組質(zhì)粒 的大小約為15. 6Kb。測(cè)序結(jié)果表明該轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒中確實(shí)含有目的片段,且讀碼框正確,重 組質(zhì)粒構(gòu)建成功。3. 4構(gòu)建ZjPIP2基因植物表達(dá)載體小結(jié)通過(guò)PCR技術(shù)克隆得到目的基因ZjPIP2的cDNA片段,經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶BamH I 和Sma I修飾并純化后連接到植物表達(dá)載體PBI121中;用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中;用含有卡那霉素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子,最后經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定及 測(cè)序證明植物表達(dá)載體pBI121-ZjPIP2構(gòu)建成功,如圖4所示,為載體的構(gòu)建圖譜,為探討 ZJPIP2基因在植物體內(nèi)的功能奠定了基礎(chǔ)。三、農(nóng)桿菌介導(dǎo)ZjPIP2基因轉(zhuǎn)化擬南芥1、材料、試劑及儀器
1.1植物材料野生型擬南芥種子來(lái)源于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心園藝作物研究室, 培養(yǎng)基質(zhì)購(gòu)自山西省農(nóng)科院園藝作物研究所。1.2載體和菌株根癌農(nóng)桿菌LBA4404、植物表達(dá)載體PBI121均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究 中心園藝作物研究室保存。1-3 試劑卡那霉素購(gòu)自上海生工生物工程服務(wù)有限公司;YEB、1/2MS培養(yǎng)基中所用試劑均 購(gòu)自天津天大化工。1.4培養(yǎng)基及試劑配方1.4. IYEB 培養(yǎng)基蛋白胨0. 05g/L,酵母膏 0. 01g/L,蔗糖 0. 05g/L,硫酸鎂 0. 005g/L。注固體培養(yǎng)基需加終濃度為1. 0%的瓊脂粉。1.4. 21/2MS 培養(yǎng)基按配制MS培養(yǎng)基配制1/2MS培養(yǎng)基,大量元素、微量元素、有機(jī)元素、鐵鹽的量各 減半,蔗糖30g/L,瓊脂粉6g/L。其他試劑配方與ZjPIP2基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建中所用到的試劑一樣。2實(shí)驗(yàn)方法2.1擬南芥的培養(yǎng)將擬南芥種子先在95%乙醇浸泡30 60s ;再轉(zhuǎn)入2. 65%次氯酸鈉滅菌5min,其 間上下顛倒洗,5000rpm離心2min。滅菌水洗三次。然后將種子懸浮于0. 的瓊脂粉溶膠 中。用槍頭吸上懸浮液將種子點(diǎn)播于1/2MS固體培養(yǎng)基上,封口。4°C黑暗春化2d后,將擬 南芥種子在22°C,16h/8h光周期條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)擬南芥長(zhǎng)出2片真葉時(shí),移栽到營(yíng)養(yǎng)
基質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)。2. 2根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞的制作,為本領(lǐng)域公知技術(shù)。2. 3工程菌pBI121-ZjPIP2_L的構(gòu)建及篩選通過(guò)凍融法將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404,然后提取陽(yáng)性克隆 的質(zhì)粒DNA,并通過(guò)PCR鑒定重組質(zhì)粒載體是否轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。
從28°C培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒pBI121_ZjPIP2的篩選平板上隨機(jī)挑選生長(zhǎng)良好 的若干單菌落,各取二分之一菌落至50 μ 1超純水中,沸水浴5min使菌裂解,取1 μ 1作為 模板進(jìn)行PCR鑒定,將鑒定出的陽(yáng)性工程菌重新劃線保存一份,備用。2. 4農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥2. 4. 1 工程菌 pBI121-ZjPIP2_L 的培養(yǎng)挑選鑒定的陽(yáng)性克隆于IOmLYEB液體培養(yǎng)基(含終濃度為50 μ g/mL的卡納抗生 素)過(guò)夜培養(yǎng)后。6000rpm離心5min收集菌體,用培養(yǎng)基懸浮菌體至OD6tltl值為0. 8左右, 用于轉(zhuǎn)化擬南芥植株。2. 4. 2農(nóng)桿菌侵染擬南芥 當(dāng)擬南芥植株形成花蕾時(shí),即可用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。將含農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化介質(zhì)倒入燒 杯,將擬南芥植株的花蕾部分浸入轉(zhuǎn)化介質(zhì)3 5S后,把浸染過(guò)的植株放到塑料盤(pán)中,用薄 膜覆蓋,暗處放置過(guò)夜。然后揭開(kāi)薄膜,在正常條件下,繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的擬南芥植株。當(dāng) 擬南芥的角果枯黃、欲開(kāi)裂時(shí),收獲種子。2. 4. 3轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選將消毒的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的TO代種子播種于1/2MS篩選培養(yǎng)基(含終濃度為 50 μ g/mL的卡那抗生素),4°C黑暗春化2d后在22°C,16h/8h光周期下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化成功的 擬南芥種子長(zhǎng)出來(lái)的幼苗生長(zhǎng)正常,未轉(zhuǎn)化成功的幼苗葉子發(fā)黃,生長(zhǎng)緩慢。生長(zhǎng)正常的擬 南芥長(zhǎng)出2片真葉時(shí),移栽到營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)。3ZJPIP2基因轉(zhuǎn)化擬南芥的結(jié)果與分析3.1農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化結(jié)果將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pBI121-ZjPIP2轉(zhuǎn)人農(nóng)桿菌LBA4404,在YEB固體培養(yǎng)基 (含終濃度為50 μ g/mL的卡那霉素上篩選轉(zhuǎn)化子,從篩選平板上隨機(jī)挑選生長(zhǎng)良好的若干 單菌落,進(jìn)行PCR檢測(cè),PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖5所示,圖中M:DL2000Marker :1、4、5、12、13 陽(yáng) 性克隆,產(chǎn)生一條大小約為850bp的特異條帶,表明這些菌落為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,重組植物表達(dá) 載體已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404。3. 2轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的獲得按上述方法侵染擬南芥后,將消毒的轉(zhuǎn)基因擬南芥的Ttl代種子播種于1/2MS篩選 培養(yǎng)基(含終濃度為50 μ g/mL的卡那霉素),4°C黑暗春化2d后在22°C,16h/8h光周期下 培養(yǎng)。經(jīng)觀察,抗卡那霉素的擬南芥幼苗生長(zhǎng)正常,且有真葉形成,而不抗卡那霉素的擬南 芥幼苗比較小,葉子發(fā)黃,也沒(méi)有真葉形成。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥植物及其Tl代進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)及耐旱性性評(píng)價(jià),選取對(duì)照、干旱 處理、NaCl處理的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物及其Tl代。每天下午給對(duì)照澆充足的水,NaCl處理的 苗各澆0. IM NaCl溶液500ml,干旱處理的苗不澆任何液體。連續(xù)處理3天后,觀察其生長(zhǎng) 表現(xiàn),結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)兩種脅迫處理的轉(zhuǎn)基因擬南芥及其Tl代均能夠在正常生長(zhǎng)條件下恢 復(fù),而對(duì)照則死亡。3. 3轉(zhuǎn)ZjPIP2基因擬南芥小結(jié)通過(guò)凍融法將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pBI121_ZjPIP2轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài) 細(xì)胞中,經(jīng)含卡納霉素的YEB平板篩選、PCR鑒定成功構(gòu)建工程菌pBI121-ZjPIP2-L;工程 菌介導(dǎo)ZjPIP2基因侵染擬南芥,經(jīng)含有卡納霉素的1/2MS培養(yǎng)基篩選獲得含有目的基因ZJPIP2的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株,并對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥植物進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)及耐旱性性評(píng)價(jià),為 研究ZjPIP2基因在植物體內(nèi)的表達(dá)定位、功能及調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
四、ZjPIP2在棗樹(shù)體內(nèi)的表達(dá)1材料、試劑及儀器1.1植物材料壺瓶棗(Ziziphus jujuba Mill hupingzao)樹(shù)苗由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù) 研究中心園藝作物研究室提供。1.2試劑及儀器設(shè)備N(xiāo)aCl購(gòu)自天津天大化工;飽和酚、DEPC及RNA提取過(guò)程中所用到的試劑均購(gòu)自上 海生工生物工程有限公司。1.3試劑配方與ZjPIP2基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建中所用到的試劑一樣。2實(shí)驗(yàn)方法2. 1材料的準(zhǔn)備及采集將壺瓶棗樹(shù)苗移栽到直徑為50厘米的大花盆中。放置戶外正常培養(yǎng),對(duì)照、干旱 處理、NaCl處理的棗苗各三盆。每天下午給對(duì)照棗苗澆充足的水,NaCl處理的棗苗各交 0. IM NaCl溶液500ml,干旱處理的棗苗不澆任何液體。連續(xù)處理3天后,經(jīng)過(guò)脅迫處理的 早樹(shù)苗開(kāi)始出現(xiàn)卷葉癥狀。兩周后,兩種脅迫處理的棗苗卷葉、枯黃現(xiàn)象嚴(yán)重,然后進(jìn)行取 樣。取每盆植株的根、莖、葉、結(jié)果枝莖段到50mL離心管中,液氮速凍后保存于-80°C冰箱, 用于RNA的提取。2. 2植物RNA的抽提和質(zhì)量檢測(cè)2. 2. 1植物材料RNA的提取CTAB法提取植物材料的總RNA。2. 2. 2RNA 質(zhì)量檢測(cè)采用甲醛變性膠電泳法來(lái)檢驗(yàn)RNA是否降解,同時(shí)用分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度。(1)測(cè)所抽提RNA的0D260值取1μ 1 RNA 力卩到 99 μ 1 RNA-free water 中,用分光光度計(jì)(印pendorf BioPhotometer)檢測(cè)RNA質(zhì)量,如果0D26(1/0D28(1 = 2.0那么RNA的質(zhì)量非常好,純度高,無(wú) 降解,可以用于反轉(zhuǎn)錄。(2)甲醛變性膠電泳RNA甲醛變性電泳液1XM0PS 500 600ml 用 DEPC 處理過(guò)的水稀釋 20XM0PS 20 倍。瓊脂糖變性膠配制方法如下水(經(jīng)DEPC 處理)44mL甲醛3. OmL20 X MOPS3. OmL瓊脂糖0.6g加熱溶解后再加水至總體積為60ml,使溶液冷卻。
注制膠時(shí)先將水、MOPS、瓊脂糖融化,室溫放置至冷卻到60°C,再加入甲醛,混勻 并置通風(fēng)櫥中15分鐘后倒入制膠器中。RNA變性Buffer配制方法如下 RNA樣品分別加3倍體積的RNA變性Buffer,混勻后在65°C水浴中溫浴lOmin,置 于冰水混合物上使之冷卻;點(diǎn)樣,電泳,EB染色40min,S. D. W洗三次,每次15min,紫外檢測(cè) 照相,能看到較分明的兩條帶,且前后兩條帶亮度比接近2 1,則RNA可用。2. 3RNA 的反轉(zhuǎn)錄及 RT-PCR2. 3. 1 反轉(zhuǎn)錄 RNA按試劑盒PrimeScrip RT reagent Kit說(shuō)明將2. 6. 2. 2所提的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 反轉(zhuǎn)錄體系如下5XPrime Script Buffer8μ 1Prime Script Enzyme MixI 1 μ 1Oligo dT Primer1 μ 1Random 6mers1 μ 1Total RNA2 μ gS. D. Wup to 40 μ 1反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序?yàn)?7°C 15min (反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)),85°C 5sec (反轉(zhuǎn)錄酶的失活反 應(yīng))。2. 3. 2內(nèi)參基因ZjH3引物的設(shè)計(jì)與合成孫海峰等[66]研究表明棗樹(shù)ZjH3基因可作為內(nèi)參基因?qū)jPIP2基因進(jìn)行mRNA表 達(dá)水平的檢測(cè)。由序列號(hào)EU916201獲得ZjH3基因序列,根據(jù)所得序列設(shè)計(jì)內(nèi)參基因ZjH3 的特異性引物,并委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,用于ZjH3基因的克隆分 析。內(nèi)參基因Z jH3的上游弓丨物序列為Z1 5,-ATGGATCCATGGCACGGACAAAGCA-3,,包含 BamHI限制性酶切位點(diǎn)(即有下劃線部分),兩個(gè)保護(hù)堿基AT,及組蛋白基因的起始密碼子 ATG。下游引物序列為Z2 :5,-TATACCCGGGCTAAGCCCTCTCGCC-3’,包含 Sam I 限制性酶切 位點(diǎn)(即有下劃線部分),四個(gè)保護(hù)堿基TATA,及組蛋白基因的終止密碼子CTA。2. 3. 3RT-PCR 分析以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,WP3、WP6 ;Zl, Z2為引物,PCR鑒定棗樹(shù)水通道蛋白的表 達(dá)位置及各種脅迫處理后的表達(dá)情況。反應(yīng)體系為10XPCR buffer 1.5μ1(含Mg離 子),dNTPO. 2 μ 1,上下游引物各 0. 5 μ 1 (20pmol/L),rTaq 聚合酶 0. 1 μ 1,模板 cDNA 1 μ 1(2. 3 μ g/μ 1),滅菌超純水加11. 2μ 1至總體積為15 μ 1。擴(kuò)增條件同2. 2. 3. 2,WP3 >WP6的退火溫度為54°c,Z1, Z2的退火溫度為56°C。3干旱、NaCI脅迫下ZjPIP2的表達(dá)分析結(jié)果
3. IRNA的質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果3. 1. 1 測(cè)定所提 RNA 的 0D260 值將所提RNA按1 99與S. D. W配好后,分光光度計(jì)測(cè)得的RNA濃度見(jiàn)表1 表1棗苗處理后分子數(shù)據(jù)材料總RNA 濃260/280 260/230 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)度用量 物濃度(ug/ml)(ul) (ug/ml)對(duì)照根 1170.1 1.85 2.6311116.5蓮 316.9 1.83 2.4841343.8葉 1637.3 1.82 2.6911484.5結(jié) 1082.5 1. 79 2. 6611169.3干旱脅迫根31.9 1.99 1.7720 1595.8蓮 2393.3 2.06 2.4911796.1葉 1977.6 2.04 2.5311621.5結(jié) 2840.4 2.04 2. 5511516.8NaCl 脅迫根 172.2 1.95 2.1620 1078.2蓮 30. 3 3. 79 1. 6820 1433. 4葉 11894 1.99 2. 260.5 1459.7結(jié) 3863.6 2.00 2. 5211427. 73. 1.2甲醛變性膠電泳將所提RNA樣品處理后,進(jìn)行甲醛變性膠電泳,凝膠成像分析儀下觀察所提RNA質(zhì) 量,如果看到較分明的兩條帶,且前后兩條帶亮度比接近2 1,表明所提RNA純度高、無(wú)降 解、可用于反轉(zhuǎn)錄。3. 2ZJPIP2在不同脅迫下的RT-PCR分析結(jié)果按上述方法反轉(zhuǎn)錄所提RNA,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物濃度見(jiàn)表1 ;然后再分別以ZpZ2JP3JPe 為引物對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行RT-PCR分析,瓊脂糖凝膠電泳RT-PCR產(chǎn)物,結(jié)果如圖6 (a)、圖 6(b)所示,如圖7所示圖6(a)中,M :DL2000Marker ;1 質(zhì)粒對(duì)照;.2-5 干旱處理植株的根、莖、葉、結(jié)果 枝莖段;圖6(b)中,2-5 對(duì)照植株的根、莖、葉、結(jié)果枝莖段;6-9 =NaCl處理植株的根、莖、 葉、結(jié)果枝莖段,表明ZjH3基因在對(duì)照和處理所有植株的不同組織均有表達(dá),進(jìn)一步表明 所提RNA可用。圖7中,M :DL2000Marker ;1 質(zhì)粒對(duì)照;2_5 對(duì)照植株的根、莖、葉、結(jié)果枝 莖段6-9 干旱處理植株的根、莖、葉、結(jié)果枝莖段;10-13 =NaCl處理植株的根、莖、葉、結(jié)果 枝莖段.顯示棗水通道蛋白在對(duì)照植株的莖和葉片中有表達(dá),葉片中的表達(dá)量相對(duì)少一點(diǎn) 兒;在干旱處理過(guò)的植株的莖、葉、結(jié)果枝莖段中均有表達(dá),結(jié)果枝莖段經(jīng)干旱脅迫表達(dá)了 目的基因,葉中的表達(dá)量現(xiàn)相對(duì)對(duì)照有所增加;在NaCl處理過(guò)的植株中,莖、葉、結(jié)果枝莖 段均有表達(dá),而且莖、葉中的表達(dá)量比對(duì)照增加顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ZjPIP2蛋白在莖、葉中 的表達(dá)比較穩(wěn)定,證實(shí)逆境因素可誘導(dǎo)目的基因在結(jié)果枝中的表達(dá)。
3. 3ZJPIP2表達(dá)研究小結(jié)分別對(duì)盆栽壺瓶棗樹(shù)苗進(jìn)行干旱、NaCl脅迫處理,并以未作任何處理的正常壺瓶棗樹(shù)苗為對(duì)照,研究逆境因素對(duì)ZjPIP2基因表達(dá)的影響,當(dāng)處理過(guò)的樹(shù)苗出現(xiàn)嚴(yán)重卷葉、 枯黃現(xiàn)象時(shí),立即采樣并速凍保存于-80°C冰箱。用CTAB法提取所采集到的對(duì)照及脅迫處 理過(guò)的植物材料的總RNA,經(jīng)OD26tl值的測(cè)定、甲醛變性膠電泳等方法檢測(cè)證明所提RNA純度 高、無(wú)降解,質(zhì)量合格。反轉(zhuǎn)錄所提RNA,RT-PCR分析得ZjPIP2基因在植物莖、葉中的表達(dá) 比較穩(wěn)定,并推測(cè)ZjPIP2可受干旱、NaCl脅迫等逆境因素誘導(dǎo)表達(dá)。
權(quán)利要求
一種棗樹(shù)水通道蛋白基因,其特征是該基因的核苷酸序列具有如SEQ ID NO1所示的序列。
2.由權(quán)利要求1所述一種棗樹(shù)水通道蛋白基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列,其特 征是該氨基酸序列具有如SEQ ID NO :2所示的序列。
3.一種棗樹(shù)水通道蛋白基因在提高植物耐旱性和耐鹽性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域,具體為一種棗樹(shù)水通道蛋白基因及在提高植物耐旱性和耐鹽性中的應(yīng)用,該基因的核苷酸序列以及氨基酸序列如序列表中所示SEQ ID NO1和SEQID NO2,本發(fā)明構(gòu)建植物表達(dá)載體,獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株,對(duì)其進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)及耐旱性性評(píng)價(jià),證明其可用在提高植物耐旱性和耐鹽性中。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并從棗樹(shù)中克隆出棗樹(shù)水通道蛋白基因ZjPIP2,該基因可作為目的基因?qū)胫参?,提高植物耐鹽性和耐旱性,以進(jìn)行植物品種改良,明確了具有優(yōu)良抗性的棗樹(shù)的抗逆機(jī)制,逆境相關(guān)基因的分子結(jié)構(gòu)、表達(dá)、功能及調(diào)控,為進(jìn)一步充分利用這些優(yōu)良抗性基因提高植物的抗逆性提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101880674SQ201010239449
公開(kāi)日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月27日
發(fā)明者孟玉平, 張潔, 曹秋芬, 顧蓉 申請(qǐng)人:山西省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心