專利名稱：一種制備蝦青素單體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及水解蝦青素酯，獲得蝦青素單體的方法。
背景技術(shù)：
蝦青素(3，3’ _ 二羥基-3，3 ’ _胡蘿卜素_4，4’ _ 二酮酮式類胡蘿卜素)是類 胡蘿卜素的含氧衍生物。它具有極強(qiáng)的抗氧化能力，其自由基猝滅活力是胡蘿卜素的 10倍，是維生素E的100-500倍?？勺鳛樘烊恢珓┯糜谒a(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)；既具有增強(qiáng)免疫反 應(yīng)及抗癌的活性，還可用于食品、醫(yī)藥、化妝品等工業(yè)。蝦青素可化學(xué)合成或從天然樣品中提取。利用化學(xué)手段合成蝦青素時(shí)將不可避免 的引入雜質(zhì)化學(xué)物質(zhì)，如合成過程中產(chǎn)生的非天然副產(chǎn)物等，將降低其生物利用安全性。因 此，不能用在人類市場。天然提取法主要是從法夫酵母、雨生紅球藻和蝦殼廢棄物中提取得 到蝦青素。法夫酵母細(xì)胞合成蝦青素以單體為主，但在胞內(nèi)含量低，目前還難以形成生產(chǎn)規(guī) 模。雨生紅球藻內(nèi)蝦青素含量較高，一般可達(dá)細(xì)胞干重的2-3% (w/w) 0但其蝦青素主要以 蝦青素單酯(70% )及蝦青素雙酯(25% )的形式存在。蝦青素酯與油脂性質(zhì)相近，組分復(fù)雜，純化和檢測困難。游離蝦青素不僅具有極強(qiáng) 的抗氧化能力，還可阻止鼠胚成纖維細(xì)胞中由致癌原誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，在藥物開發(fā)中 具有重要作用。將蝦青素酯水解后可增加其親水性，并通過在蝦青素的羥基上連接某些基 團(tuán)，使其變?yōu)樗苄苑肿?，有利于其在制備口服藥物中的?yīng)用。如蝦青素雙琥珀酸二鈉鹽可 制成口服藥物，在治療心血管病中具有很好的應(yīng)用前景。目前對蝦青素酯水解的方法主要 是堿皂化，其過程需要低溫且條件難于控制，收率低，容易產(chǎn)生蝦青素的多種異構(gòu)體及其它 副產(chǎn)物。脂肪酶(E. C. 3. 1. 1. 3)能夠分解三酰甘油，可專一性針對含有酯鍵的物質(zhì)進(jìn)行水 解反應(yīng)，將油脂水解為游離脂肪酸和醇，還可催化酯化反應(yīng)，轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)及酯交換反應(yīng)。脂 肪酶的水解反應(yīng)是在一種非均相體系中進(jìn)行的，酶(水溶性)在底物(水不溶性)和水的 界面上催化底物反應(yīng)，這種特性被稱為界面活性。脂肪酶具有底物特異性和反應(yīng)條件溫和 的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明人利用脂肪酶對雨生紅球藻粗提物蝦青素酯進(jìn)行水解，最終得到了一種在 溫和條件下進(jìn)行酶解的策略，可提高雨生紅球藻蝦青素的收率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的水解雨生紅球藻中蝦青素酯，獲得蝦青素單體的方 法。本發(fā)明制備蝦青素單體的方法是將蝦青素酯用脂肪酶水解得到游離蝦青素單體。所述脂肪酶優(yōu)選為堿性脂肪酶，更優(yōu)選為來自Penicillium cyclopium var. albus的堿性脂肪酶。所述蝦青素酯可以是來自雨生紅球藻的蝦青素酯，在本發(fā)明實(shí)施例中蝦青素酯是 雨生紅球藻粗提物油劑，其天然左旋蝦青素可達(dá)5%。
可將雨生紅球藻粗提物油劑經(jīng)乳化劑乳化后，再用脂肪酶水解。所述乳化劑可以 是非離子型乳化劑，優(yōu)選為吐溫80。乳化劑的加入量以使得油劑能夠充分乳化為宜。例如， 吐溫80的加入量宜為雨生紅球藻粗提物油劑重量的1 3倍。上述脂肪酶按照2 12U/i! g總類胡蘿卜素加入，優(yōu)選每微克總類胡蘿卜素加入 4 10U脂肪酶。上述水解反應(yīng)可以在pH6. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行，于150 200rpm、25 30°C下反應(yīng)5 7小時(shí)即可。進(jìn)一步可以用薄層層析(TLC)、高效液相色譜(HPLC)和質(zhì)譜(MS)對水解產(chǎn)物進(jìn)行 檢測鑒定。本發(fā)明提供了一種新的水解雨生紅球藻中蝦青素酯而得蝦青素單體的方法。采用 本發(fā)明所述的方法，蝦青素單體回收率達(dá)63. 2%。本方法操作簡單，只需要一步反應(yīng)再經(jīng)提 取即得到目的產(chǎn)物，節(jié)省能耗，也可在一定程度上避免因長時(shí)間反應(yīng)導(dǎo)致的蝦青素?fù)p失。


圖1脂肪酶水解蝦青素酯的TLC檢測；其中，Lanel 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)； Lane2 未加酶液的反應(yīng)底物；Lane3 加酶液振蕩反應(yīng)7h的反應(yīng)產(chǎn)物。圖2脂肪酶水解蝦青素酯的HPLC檢測；圖2a 水解前底物的HPLC檢測；其中峰2 為游離蝦青素，峰8-22為蝦青素酯；圖2b 加酶水解7h產(chǎn)物的HPLC檢測；其中峰6為游離 蝦青素，峰16-25為蝦青素酯。圖3TLC法回收的游離蝦青素的質(zhì)譜檢測。圖3a 用TLC法從反應(yīng)體系中回收的 游離蝦青素的質(zhì)譜檢測；圖3b 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)的質(zhì)譜檢測。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明中涉及到的百分號“ ％”，若未特別說明，是指質(zhì)量百分比；但溶液的百分 比，除另有規(guī)定外，是指溶液100ml中含有溶質(zhì)若干克；液體之間的百分比，是指在20°C時(shí) 容量的比例。實(shí)施例IPeniciIlium cyclopium var. albus堿性脂肪酶酶液的制備以 Penicillium cyclopium var. albus (CGMCC 3. 4041)堿性脂肪酶的 cDNA 為 模板，根據(jù)GenBank中該酶的基因序列(GenBank登錄號為AF274320. 1)設(shè)計(jì)引物(P1 gaattcgcaactgctgacgccgct, P2 :gcggccgtcagctcagatagccaca),進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。從 PCR 產(chǎn) 物中回收目的條帶，并連接到載體pMD18-T-Simple上(購自TaKaRa公司)；再用限制性內(nèi) 切酶SnaBI和Not 1分別對pMD18-T-alip和pKIC9K進(jìn)行雙酶切，然后對目的片段進(jìn)行回 收，用T4連接酶將其連接，得到表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-alip。用限制性內(nèi)切酶Sal I酶切載體 PIC9K-alip，然后用乙醇沉淀的方法濃縮線性化片段，電擊法轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母GS115 感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后涂布不含組氨酸的基本培養(yǎng)基MD平板。平板在30°C培養(yǎng)2-3天后，將 長出的轉(zhuǎn)化子經(jīng)無菌水懸浮后稀釋至105個(gè)細(xì)胞/毫升懸浮液，涂至不同G418抗性的YPD 平板，采用G418濃度梯度篩選巴斯德畢赤酵母高拷貝轉(zhuǎn)化子，通過酵母菌落PCR法鑒定正 確整合的轉(zhuǎn)化子，再通過搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)，選取其中酶活最高的一株進(jìn)行下面的產(chǎn)酶發(fā)酵實(shí)
將重組Penicillium cyclopium var. albus堿性脂肪酶基因的巴斯德畢赤酵母接 種于含有25ml BMGY培養(yǎng)基(1%酵母粉，2%蛋白胨，甘油)的250ml三角瓶中，于30°C， 180rpm搖床培養(yǎng)至OD6tltl為6. 0左右，再轉(zhuǎn)接到裝有50ml BMMY培養(yǎng)基(1%酵母粉，2%蛋 白胨，1. 0%甲醇，1. 34%無氨基酸酵母氮源，100mmol/l磷酸緩沖液，pH 7. 0的500ml三角 瓶中，相同培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)，每24小時(shí)補(bǔ)加100%甲醇于培養(yǎng)基至終濃度為1.0%，誘導(dǎo) 表達(dá)2天。每隔一定的時(shí)間取樣，測量其細(xì)胞密度(0D_)和胞外的脂肪酶的酶活。當(dāng)酶活 達(dá)到170U/ml時(shí)不再上升時(shí)，收集發(fā)酵液，8000rpm，4°C，離心lOmin，取上清，4°C保存，用于 以下的酶解反應(yīng)。實(shí)施例2乳化物制備及酶解反應(yīng)條件優(yōu)化 取0. Ig雨生紅球藻蝦青素粗提物油劑(天然左旋蝦青素5%油劑，購自荊州天然 蝦青素有限公司)于研缽中，加入0.5 5倍質(zhì)量的吐溫80，研磨乳化，并加0. IM磷酸鈉緩 沖液(pH5. 0 8. 0)定容至IOml ；以每微克總類胡蘿卜素加入2 12U脂肪酶的量加入乳 化物(Iml)及酶，再加入0. 1M，pH5. 0 8. 0的磷酸鈉緩沖液至總體積IOml ；30°C,180rpm 振蕩反應(yīng)，每隔l_2h取樣，用TLC及HPLC檢測，反應(yīng)至12h停止。結(jié)果表明，吐溫80按照雨生紅球藻粗提物油劑重量的1 3倍加入可有效乳化， 但由于TweenSO量多會增加提取液丙酮的用量，出于經(jīng)濟(jì)因素考慮，優(yōu)選TweenSO量為雨生 紅球藻粗提物油劑重量的1倍。脂肪酶按照2 12U/y g總類胡蘿卜素加入可以有效水 解，優(yōu)選每微克總類胡蘿卜素加入4 IOU脂肪酶，水解5 7小時(shí)即可。水解反應(yīng)可在 pH6. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行，其中pH7. 0的條件下反應(yīng)較佳。實(shí)施例3蝦青素酯的水解取0. Ig雨生紅球藻蝦青素粗提物油劑(購自荊州天然蝦青素有限公司)于研缽 中，加入1倍質(zhì)量的吐溫80，研磨乳化，并加0. IM磷酸鈉緩沖液(pH7. 0)定容至IOml ；以每 微克總類胡蘿卜素加入4U脂肪酶的量加入乳化物(Iml)及酶，再加入0. 1M，pH7. 0的磷酸 鈉緩沖液至總體積IOml ；28°C，150rpm振蕩反應(yīng)7小時(shí)，蝦青素得率為63. 2%。反應(yīng)結(jié)束 后，加入與樣品同體積的丙酮，室溫條件下用漩渦振蕩器振蕩30s，再加入等體積的正己烷， 上述同樣方法振蕩30s，12000rpm，離心lmin，取上清用于TLC和HPLC檢測。實(shí)施例4蝦青素酯的水解取0. Ig雨生紅球藻蝦青素粗提物油劑(購自荊州天然蝦青素有限公司)于研缽 中，加入1倍質(zhì)量的吐溫80，研磨乳化，并加0. IM磷酸鈉緩沖液(pH7. 0)定容至IOml ；以每 微克總類胡蘿卜素加入8U脂肪酶的量加入乳化物(Iml)及酶，再加入0. 1M，pH7. 0的磷酸 鈉緩沖液至總體積IOml ；28°C，180rpm振蕩反應(yīng)6小時(shí)。蝦青素得率為63. 0%。反應(yīng)結(jié)束 后，加入與樣品同體積的丙酮，室溫條件下用漩渦振蕩器振蕩30s，再加入等體積的正己烷， 上述同樣方法振蕩30s，12000rpm，離心lmin，取上清用于TLC和HPLC檢測。實(shí)施例5蝦青素酯的水解取0. Ig雨生紅球藻蝦青素粗提物油劑(購自荊州天然蝦青素有限公司)于研缽 中，加入1倍質(zhì)量的吐溫80，研磨乳化，并加0. IM磷酸鈉緩沖液(pH7. 0)定容至IOml ；以每 微克總類胡蘿卜素加入12U脂肪酶的量加入乳化物(Iml)及酶，再加入0. 1Μ，ρΗ7. 0的磷酸 鈉緩沖液至總體積IOml ；28°C，200rpm振蕩反應(yīng)5小時(shí)。蝦青素得率為63. 1%。反應(yīng)結(jié)束
5后，加入與樣品同體積的丙酮，室溫條件下用漩渦振蕩器振蕩30s，再加入等體積的正己烷， 上述同樣方法振蕩30s，12000rpm，，離心lmin，取上清用于TLC和HPLC檢測。實(shí)施例6產(chǎn)物的TLC、HPLC及MS檢測產(chǎn)物用等體積的丙酮和正己烷的混合液進(jìn)行提取，12000rpm，離心lmin，取上清， 用于TLC和HPLC檢測(l)TLC檢測方法采用5%檸檬酸對硅膠板進(jìn)行噴霧酸化處理，70°C干燥lh ；選用正己烷和丙酮 (4 1)為展層劑，點(diǎn)樣后在層析缸中展層15min。蝦青素單體及蝦青素酯具有鮮艷的紅色， 易于觀察判斷；另取標(biāo)準(zhǔn)蝦青素樣品(購自Sigma公司)10mg，定溶于100ml 二氯甲烷和甲 醇的混合液(1 4)中，作為正對照。如圖1所示，大部分蝦青素酯被降解為蝦青素單體。(2) HPLC 檢測方法色譜柱反相C18柱(北京創(chuàng)新通恒)，內(nèi)徑4. 6mm,長度250mm ；流動相乙腈、乙 酸乙酯和水(63 30 7)，流速lml/min，檢測波長470nm，柱溫35°C。配置蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品 (Sigma)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。其結(jié)果見圖2?？梢?，加酶反應(yīng)后，蝦青素酯含量變少，游離蝦青素
含量升高。蝦青素得率為反應(yīng)后所得蝦青素單體的質(zhì)量與反應(yīng)前加入反應(yīng)體系中的蝦青素 酯的質(zhì)量的比值。(3) MS 檢測用丙酮和正己烷提取酶解后的產(chǎn)物，取上層吹氮濃縮，TLC分離。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品遷移 位置回收產(chǎn)物中的單體條帶，丙酮洗脫后，12000rpm,離心lOmin，取上層，0. 45 u m濾膜過 濾，進(jìn)行質(zhì)譜分析(LCQ Deca XP Thermo Finngian，San Jose，CA)。質(zhì)譜條件為噴射電壓 4. 5kv，毛細(xì)管溫度300°C，正離子檢測，質(zhì)譜儀在m/z = 400-800的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。其檢 測結(jié)果見圖3?；厥盏挠坞x蝦青素樣品分子量為596. 7 (M-1)，與蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的分子量一 致，證明是同一物質(zhì)。
權(quán)利要求
一種制備蝦青素單體的方法，其是將蝦青素酯用脂肪酶水解得到游離蝦青素單體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶為堿性脂肪酶。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶來自Penicilliumcyclopium var. albuso
4.如權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述蝦青素酯來自雨生紅球藻。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述將雨生紅球藻粗提物油劑經(jīng)乳化劑乳 化后，用脂肪酶水解。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述乳化劑為吐溫80。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述吐溫80的加入量為雨生紅球藻粗提物 油劑重量的1 3倍。
8.如權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶按照2 12U/μ g總 類胡蘿卜素加入。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述水解反應(yīng)在pH6.0 8. 0的磷酸鹽緩沖 液中進(jìn)行，于150 200rpm、25 30°C下反應(yīng)5 7小時(shí)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，將雨生紅球藻粗提物油劑與吐溫80按照重 量比1 1 3混合，充分乳化，加入0. 1ΜρΗ6. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液，按照每微克總類 胡蘿卜素加入4 IOU總類胡蘿卜素，于150 200rpm、25 30°C下反應(yīng)5 7小時(shí)。全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的制備蝦青素單體的方法，其是將蝦青素酯用脂肪酶水解得到游離蝦青素單體。采用該方法蝦青素單體回收率達(dá)63.2％。本方法操作簡單，只需要一步反應(yīng)再經(jīng)提取即得到目的產(chǎn)物，節(jié)省能耗，也可在一定程度上避免蝦青素在長時(shí)間反應(yīng)過程中的損失。本發(fā)明為酶法從雨生紅球藻粗提物中獲取蝦青素單體的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12P23/00GK101892281SQ20101023998
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月28日
發(fā)明者關(guān)國華, 關(guān)菲菲, 李穎, 王珍芳, 王貴利, 趙瑩瑩 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)