專利名稱:大豆開花調節(jié)基因GmCIB5、其編碼蛋白及應用的制作方法
技術領域:
本發(fā)明涉及基因工程領域,特別是涉及大豆開花調節(jié)基因GmCIB5、其編碼蛋白及 其在植物光周期和開花時間調節(jié)中的應用。
背景技術:
大豆是重要的農(nóng)作物之一,是植物蛋白質、食用油、生物柴油以及異黃酮和卵磷脂 等次生代謝產(chǎn)物的重要來源。因為大豆是短日植物,開花受光周期的嚴格控制,因而不同區(qū) 域間的優(yōu)異品種不能相互引種、生育期也受環(huán)境光周期的制約。如果能降低大豆對光周期 的敏感性,突破大豆開花對光周期的限制,就能解決大豆的引種問題,從而實現(xiàn)各區(qū)域間優(yōu) 質品種的相互交換,豐富各地優(yōu)異種質資源,調節(jié)大豆生育期,提高大豆產(chǎn)量和品質。雖然 通過傳統(tǒng)的栽培和遺傳育種的方法在一定程度上改變大豆的生長習性,也獲得一些光周期 適應性較廣的品種,但都沒有從根本上改變大豆開花習性(趙存等,用光周期誘導法篩選 光鈍感的大豆品種(系).大豆科學.1996,15(1) :42-47 ;陳潔敏和楊方人,播期對大豆開 花及產(chǎn)量的影響,大豆科學,1998,17 (3) 225-230 ;楊志攀和周新安,大豆光周期遺傳育種 研究進展,中國油料作物學報,1999,21 (1) 61-73 ;欒曉燕,滿為群,杜維廣,陳怡,劉鑫磊, 大豆光鈍感種質創(chuàng)新與光周期育種途徑的研究,大豆科學,2004,23 (3) 196-199).其主要 原因是目前對大豆開花分子機理的了解甚少,從而導致很難從根本上解決大豆的開花習性 問題。對擬南芥開花分子機理的研究表明,植物的開花受四條途徑的控制,即光周期途 徑、自主途徑、春化途徑和赤霉素途徑(Mouradov等,2002),這些途徑的信號最后都匯總到 兩個主要的整合子FT和S0C1,從而促進開花(Suarez-Lopez P, Wheatley K, Robson F, Onouchi H,Valverde F,Coupland G,CONSTANS mediates between the circadian clock and the control of fowering in Arabidopsis. Nature,2001,410 1116-20. ;Hepworth SR, Valverde F, Ravenscroft D, Mouradov A, Coupland G. Antagonistic regulation of flowering-time gene SOCl by CONSTANS and FLC via separate promoter motifs. EMBO J. 2002.21(16) 4327-37) 0隱花色素(cryptochrome)是從細菌到植物和動物三個物種 中都存在的藍光受體,調控植物的生長發(fā)育和動植物的生物鐘(Cashmore AR.,Cell 114 537-543(2003).。Lin C.,Shalitin D.,Annu Rev Plant Biol 54 469-496 (2003)) 植物 中至少含有兩種隱花色素CRY1 和 CRY2(Guo H, Yang H, Mockler TC,Lin C.,Science279 1360-1363 (1998))。在擬南芥中CRYl主要調控藍光控制的脫黃化作用,而CRY2主要調節(jié)開 花的光周期活動(KoornneefM,Heynh.,Z Pflanzenphysiol Bd 100 :147_160 (1980))。除擬 南芥外,還對藻類、苔蘚、蕨類植物、番茄、油菜、豌豆和水稻中的隱花色素進行了相關研究。 這些研究表明,在被子植物中,隱花色素調控生長發(fā)育的方式與擬南芥中的相同(ImmelnD, Schlesinger R,J Biol Chem 282:21720—21728. (2007) ;Imaizumi Τ,Kanegae T,ffadaM., Plant Cell 12:81—96. (2000). ;Imaizumi Τ,Kadota A,Plant Cell 14:373—386. (2002); Ninu L,等,Plant J18 :551_556. (1999) ;Giliberto L,等,Plant Physiol 137:199—208.(2005). ;Chatterjee M,Sharma P, Plant Physiol 141 61-74. (2006). ;Platten JD, 等,Plant Physiol 139 1472-1482. (2005) ;Matsumoto N, Hirano T, Iwasaki T, Plant Physiol 133 1494-1503. (2003). ;Zhang YC,等,Plant J 46:971-983. (2006))。與其他的 光受體相似,隱花色素與其靶蛋白相互作用來調控基因的表達和生理反應(H. -Q. Yang等, Cell 103,815(2000) ;X. Yu 等,Proc Natl Acad Sci US A 104,7289(2007) ;M. F. Ceriani 等,Science 285,553(1999) ;Μ. Ni, J. Μ. Tepperman, P. H. Quail, Cell 95,657(1998))。在 植物體中,CRYs 禾口 CIBl (cryptochrome—interacting basic-helix-loop-helix)藍光f衣賴 的相互作用是一個早期的光受體信號機制。CIBl蛋白在酵母和擬南芥中以藍光特異的方式 與CRY2相互作用,并與其它CIBl相關的蛋白共同啟動CRY2依賴的花形成。過表達CIBl的 擬南芥轉基因植株的FTmRNA顯著提高,表現(xiàn)為早花(H Liu等,Science 269,968(2008))。 發(fā)現(xiàn)大豆的兩個隱花色素GmCRYla和GmCRY2a的表達和功能與擬南芥的隱花色素相似,兩 者都影響藍光抑制細胞的伸長,但是只有GmCRYla的降解依賴于藍光和26S蛋白體。與擬 南芥隱花色素相反,GmCRYla而非GmCRY2a表現(xiàn)出很強的促進開花的活性,并且GmCRYla 的蛋白表達水平隨生物鐘的節(jié)律而波動。在大豆中GmCRYla是花周期調控的主要調節(jié)子 (Q. Z. Zhang.,等,Proc Natl Acad Sci 2046(2008))。因此推測同屬雙子葉植物的大豆中 的CIBs基因可能與GmCRYla相互作用來調節(jié)大豆的開花。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種大豆開花調節(jié)基因GmCIB5、其編碼蛋白及其在植物光周 期和開花時間調節(jié)中的應用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的,本發(fā)明的一種大豆開花調節(jié)基因GmCIB5編碼的蛋白,其氨 基酸序列如SEQ ID No. 2所示或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有 同等功能的氨基酸序列。本發(fā)明還提供編碼上述蛋白的大豆開花調節(jié)基因GmCIB5。前述的大豆開花調節(jié)基因GmCIB5,其核苷酸序列如SEQ IDNo. 1所示。本發(fā)明還提供含有大豆開花調節(jié)基因GmCIB5的載體。本發(fā)明還提供含有上述載體的宿主細胞。本發(fā)明還提供含有大豆開花調節(jié)基因GmCIB5的轉化植物細胞。本發(fā)明進一步提供大豆開花調節(jié)基因GmCIB5所述的基因在調節(jié)植物,尤其是大 豆和擬南芥光周期和開花時間中的應用。另夕卜,本發(fā)明提供一種用于擴增大豆開花調節(jié)基因GmCIB5的引物, 其包括正向弓丨物Fl :5 ‘ -ATGGGAATTCAACTAACAGTTATG-3 ‘ 和反向引物Rl 5 ‘ -TCAGAGCTCAACTTTCATCTGTG-3‘。GmCIB5是從大豆中分離并獲得功能鑒定的bHLH家族基因,其中的Gm為Glycine max(Linn)Merril 的首字母,CIB 為 cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix 的縮寫。根據(jù)擬南芥CIBl 基因的 CDS (code sequence)序列,在 http:// www. phytozome. net網(wǎng)站中進行同源性比對,找到一批大豆同源序列,其中 GmCIB5的CDS序列在大豆基因組上的位置為Glyma08g46040. 1,設計PCR擴增引物,正向引物 Fl :5 ‘ -ATGGAAAACCAATTCTTTCTCAATG-3 ‘和反向引物 Rl 5' -TCATAGGGGTTCTTGATTTGAGC-3 ‘。以大豆總 cDNA 為模板,進行 PCR 獲得 GmCIB5 全序 列,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示,其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。GmCIB5基因與擬南芥CIBl基因高度同源,其編碼的蛋白質與擬南芥CIBl蛋白的 一致性達36. 4 %。(如圖1所示)。將GmCIB5基因在擬南芥野生型中過表達,轉化植株對光周期的敏感性降低,在長 日和短日下均早花。這表明,GmCIB5基因具有與擬南芥CIBl類似的功能,對開花的時間起 著重要的調節(jié)作用。GmCIB5基因有著重要的應用價值,過表達GmCIB5可以降低植物開花對光周期的 敏感性,可明顯促進植物開花,使開花時間縮短,生育期縮短。可用于解決雜交育種中的花 期不遇問題、各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制問題、光周期敏感性問題和引種問題。
圖1為本發(fā)明大豆CIB5蛋白與擬南芥CIBl蛋白的氨基酸序列對比,其中GmCIB5 表示大豆CIB5蛋白,AtCIBl表示擬南芥CIBl蛋白;圖2為擬南芥Col-O野生型與其轉GmCIB5基因Tl植株的開花對比,其中,左側表 示Col-O野生型植株,右側表示轉化植株;圖3為擬南芥Col-O野生型與其轉GmCIB5基因T2植株的在長日照(LD)條件下 開花對比,其中,左側表示Col-O野生型植株,右側表示轉化植株;圖4為擬南芥Col-O野生型與其轉GmCIB5基因T2植株的在短日照(SD)條件下 開花對比,其中,右側表示Co 1-0野生型植株,左側表示轉化植株。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明,但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1 GmCIB5基因的分離克隆根據(jù)擬南芥CIBl 基因的 CDS (code sequence)序列,在 http:// www. phytozome. net網(wǎng)站中進行同源性比對,找到一批大豆同源序列,其中 GmCIB5的CDS序列在大豆基因組上的位置為Glyma08g46040. 1,設計PCR擴 增引物,正向引物 Fl :5 ‘ -ATGGAAAACCAATTCTTTCTCAATG-3 ‘和反向引物 Rl 5 ‘ -TCATAGGGGTTCTTGATTTGAGC-3 ‘。以大豆總 cDNA 為模板,進行 PCR 獲得 GmCIB5 全序 列,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。PCR 反應總體系為 25 μ L,包括大豆 cDNA(50ng) 1 μ L ;dNTP(2. 5mM) 2. 5 μ L ;引物 Fl(IOyM) 1 μ L ;弓| 物 Rl (10 μ Μ) 1 μ L ;LATaq 酶(5U/ μ L) 0. 3 μ L ;IOX 緩沖液 2· 5 μ L ; ddH20 16. 7 μ L,共 25 μ L。PCR 反應程序為94 "C 預變性 5min,95 "C 30s, 53. 5 "C 30s, 72°C 2min,30 個循環(huán);最后 72°C IOmin0實施例2 GmCIB5基因的分析鑒定GmCIB5的⑶S序列全長1761bp,編碼一個586AA的蛋白,與擬南芥CIBl蛋白的同 源性為36.4%。蛋白結構分析表明,其C端含有一個basic helix-loop-helix結構,該結構域為bHLH族轉錄調節(jié)因子的保守結構域,通過與DNA中的E-box結合,來調控基因的轉 錄;蛋白N端還含有一個NLS,該結構域與入核相關。根據(jù)在NCBI (www. ncbi. nlm. nih. gov)上的序列查詢結果,到目前為止,大豆中尚 無與CIBl相類似的序列信息;而且迄今也沒有公開發(fā)表的涉及其功能研究的論文。因此認 為GmCIB5是大豆的一個新基因。實施例3轉GmCIB5基因擬南芥的獲得根據(jù)GmCIB5的序列信息,在其CDS兩端設計PCR擴增弓丨物, 正向弓丨物 F 1 :5 ‘ -ATGGAAAACCAATTCTTTCTCAATG-3 ‘和反向引物 Rl 5' -TCATAGGGGTTCTTGATTTGAGC-3 ‘。以大豆總 cDNA 為模板,進行 PCR 獲得 GmCIB5 全序 列。PCR 反應總體系為 25 μ L,包括大豆 cDNA(50ng) 1 μ L ; dNTP(2. 5mM)2. 5μ L ;引物 Fl(IOyM) 1 μ L ;弓I 物 Rl(IOyM) 1 μ L ;LATaq 酶(5U/ μ L) 0. 3 μ L ;IOX 緩沖液 2. 5 μ L ; ddH20 16. 7 μ L,共 25 μ L。PCR 反應程序為95 "C 預變性 5min,94 "C 30s, 53. 5 "C 30s, 72°C 2min,30個循環(huán);最后72°C IOmin0重復上述PCR程序三次,將三次PCR產(chǎn)物合并后進 行瓊脂糖凝膠電泳,然后切膠回收獲得純化的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物克隆到含有Gateway接頭的pGWC載體(陳其軍、王學臣等,使用與 Gateway技術兼容的T載體獲得入門克隆,2004. 31 (10),951-954)上,經(jīng)測序鑒定得到 與目的GmCIB5完全相同的序列。通過LR反應將GmCIB5構建至過表達載體pLeela(購 自Invitrogen)上,獲得載體35S: :GmCIB5。將過表達載體35S: :GmCIB5導入農(nóng)桿菌菌 株GV3101 :90RK (購自Invitrogen)中,通過農(nóng)桿菌介導的蘸花法(Steven J. Clough and Andrew F. Bent. Floral dip :A Simpled Method for Agrobacterium-mediated Transformation of Arabidopsis thaliana. Plant Journal. 1998. 16 (6), 735-743.)
盛花期的擬南芥,將轉化植株收獲的種子進行播種,播種7-10d后待子葉完全張開時噴灑 稀釋1000倍的除草劑Basta (購自Chem Service Lot :395_85A)進行篩選,獲得抗Basta 的過表達GmCIB5的擬南芥轉基因植株20株。實施例4 GmCIB5基因功能分析按照實施例3的方法獲得的20株GmCIB5擬南芥轉基因植株,其Tl植株表現(xiàn)為早 花(圖2)。選擇其中的5株轉基因植株分別種植在長日照和短日照下,T2植株在長日和短 日下均為早花(圖3和圖4)。表明轉化植株對光周期的敏感性降低,說明了 GmCIB5基因具 有與擬南芥CIBl類似的功能,對開花的時間起著重要的調節(jié)作用。雖然,上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述,但在 本發(fā)明基礎上,可以對之作一些修改或改進,這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此,在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進,均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權利要求
一種用于擴增大豆開花調節(jié)基因GmCIB5的引物,其包括正向引物F15′ ATGGAAAACCAATTCTTTCTCAATG 3′和反向引物R15′ TCATAGGGGTTCTTGATTTGAGC 3′。
2.大豆開花調節(jié)基因GmCIB5編碼的蛋白,其特征在于,其氨基酸序列如SEQID No. 2 所示或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.編碼權利要求2所述蛋白的基因。
4.如權利要求3所述的基因,其特征在于,其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
5.含有權利要求3或4所述基因的載體。
6.含有權利要求5所述載體的宿主細胞。
7.含有權利要求3或4所述基因的轉化植物細胞。
8.權利要求3或4所述的基因在調節(jié)植物光周期和開花時間中的應用。
9.如權利要求8所述的應用,其中所述的植物為大豆。
10.如權利要求8所述的應用,其中所述的植物為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆開花調節(jié)基因GmCIB5及其編碼蛋白,其具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。過表達大豆開花調節(jié)基因GmCIB5可明顯促進植物(擬南芥)開花,使開花時間縮短,生育期縮短??捎糜诮鉀Q雜交育種中的花期不遇問題、各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制問題、光周期敏感性問題和引種問題。
文檔編號C12N15/29GK101921753SQ20101024104
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月29日 優(yōu)先權日2010年7月29日
發(fā)明者孟穎穎, 李宏宇, 林辰濤 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所