專利名稱：具有改變的生長(zhǎng)特性的植物及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及一種改變植物的生長(zhǎng)特性的方法。更為具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及通過(guò)改 變植物中編碼TAD蛋白的核酸序列的表達(dá)和/或TAD蛋白的活性來(lái)增加產(chǎn)量。本發(fā)明還涉 及具有編碼TAD蛋白核酸序列表達(dá)的改變和/或TAD蛋白活性改變的植物，該植物相對(duì)于 相應(yīng)的野生型植物具有增加的產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
AAA 蛋白家方矣(ATPases Associated with various cellular Activities, Kunau等人，Biochimie 75，209-224，1993)代表了一大組共有大約230個(gè)氨基酸的高度 保守的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白，表現(xiàn)出ATPase活性(Neuwald等人，Genome Research 9， 27-43,1999 ；Vale, J. Cell Biol. 150，F(xiàn)13-F19，2000)。AAA 蛋白分布廣泛，且已經(jīng)在古細(xì) 菌(Archaea)、真細(xì)菌(Eubacteria)和所有的真核界中被鑒定。AAA結(jié)構(gòu)域是蛋白功能所 必需的，以六聚體環(huán)組織，在ATP水解時(shí)發(fā)生構(gòu)象改變。這種依賴于ATP水解的構(gòu)象改變給 結(jié)合蛋白質(zhì)施加了壓力，這一機(jī)械活動(dòng)使相關(guān)蛋白打開(kāi)折疊、蛋白-蛋白分離等等。結(jié)果， AAA蛋白在不同的細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞器合成、線粒體功能、囊泡 運(yùn)輸、蛋白折疊、細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)。因此，AAA蛋白可能代表了許多種類的機(jī)械 酶(mechanoenzymes)，涉及在許多不同生物環(huán)境中利用實(shí)質(zhì)上類似的構(gòu)象改變的獨(dú)特的方 式，但是與其目標(biāo)蛋白相互作用的基礎(chǔ)仍然是需要思考的問(wèn)題(Vale，2000)。到目前為止， 大多的研究努力集中于解析AAA ATPases的分子結(jié)構(gòu)和功能，而人們對(duì)它們?cè)诤暧^水平的 功能，例如植物生長(zhǎng)或產(chǎn)量，一無(wú)所知?；诓粩嘣鲩L(zhǎng)的世界人口，提高農(nóng)業(yè)效率和增加植物園藝學(xué)的多樣性仍然是農(nóng)業(yè) 研究的一個(gè)主要目標(biāo)。農(nóng)作物和園藝提高的傳統(tǒng)方式采用選擇性育種技術(shù)來(lái)識(shí)別具有需要 的特性的植物。然而，這種選擇性育種技術(shù)具有幾個(gè)缺點(diǎn)，即，這些技術(shù)通常是勞動(dòng)密集型 的，并且導(dǎo)致經(jīng)常含有異質(zhì)性遺傳組分的植物，這導(dǎo)致所需的特性不能總是從親本植物傳 給下代。分子生物學(xué)的進(jìn)步已經(jīng)允許人類操縱動(dòng)物和植物的生殖質(zhì)。植物的遺傳工程學(xué)使 分離和操縱遺傳材料(通常以DNA或RNA的形式)以及隨后將遺傳材料導(dǎo)入植物成為可能。 這種技術(shù)已經(jīng)導(dǎo)致具有多種改良的經(jīng)濟(jì)學(xué)、農(nóng)藝學(xué)或園藝學(xué)性質(zhì)的植物的產(chǎn)生。一種具有 特別經(jīng)濟(jì)利益的特性為較高的產(chǎn)量。發(fā)明詳述發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)改變植物中編碼來(lái)源于T0B3樣蛋白的ATPase結(jié)構(gòu)域(此后命 名為T0B3 ATPase結(jié)構(gòu)域，TAD)的核酸序列的表達(dá)導(dǎo)致相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物具有增加
的產(chǎn)量。因此，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)具體實(shí)施方式
，提供了與相應(yīng)的野生型植物相比，增加 植物的產(chǎn)量的方法，包括改變植物中分離的編碼TAD蛋白或其同源物、衍生物或活性片段的核酸序列的表達(dá)和/或改變植物中TAD蛋白、其同源物、衍生物或活性片段的活性。這里所定義的術(shù)語(yǔ)TAD編碼核酸/基因指任意的編碼來(lái)源于T0B3樣蛋白的 ATPase結(jié)構(gòu)域的核酸或其互補(bǔ)序列。該核酸可以從任何來(lái)源獲得(直接或間接(如果隨后 進(jìn)行修飾))，只要該序列在植物中表達(dá)時(shí)，導(dǎo)致TAD核酸/基因表達(dá)的改變。該核酸可以 從微生物來(lái)源分離，例如細(xì)菌、古細(xì)菌(archaea)、酵母或真菌，或來(lái)自植物、藻類或動(dòng)物來(lái) 源。與其原始的形式相比，通過(guò)精密的人工操作，該核酸的組成和/或基因組環(huán)境可以充分 地改變，該核酸分子優(yōu)選同源性的核酸分子，即結(jié)構(gòu)和/或功能相關(guān)的核酸分子，優(yōu)選來(lái)自 植物，無(wú)論來(lái)自相同或不同的植物品種。該核酸分子可以從雙子葉植物中分離，優(yōu)選來(lái)自茄 科(Solanaceae)，進(jìn)一步優(yōu)選來(lái)自煙草(Nicotiana tabacum)，更加優(yōu)選該核酸是SEQ ID NO 1所代表的核酸或其一部分，或能夠與其雜交的核酸，該雜交分子編碼具有TAD (ATP結(jié) 合和/或ATP水解)活性的蛋白質(zhì)，即與SEQ ID NO :1具有類似的生物學(xué)活性；或該核酸 編碼SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或編碼其同源物、衍生物或活性片段。術(shù)語(yǔ)TAD編碼 核酸/基因也包括根據(jù)遺傳密碼的簡(jiǎn)并性編碼TAD的核酸的變異體；編碼TAD的核酸的等 位基因變異體；編碼TAD的核酸的不同的剪接變異體及被一個(gè)或多個(gè)插入序列中斷的變異 體。這里所定義的術(shù)語(yǔ)TAD指含有來(lái)源于T0B3樣蛋白的ATPase結(jié)構(gòu)域的蛋白。TAD 優(yōu)選來(lái)自煙草，更加優(yōu)選TAD蛋白是由SEQ ID NO :2所示的蛋白，或其同源物、衍生物或活 性片段，該同源物、衍生物或活性片段與SEQ ID NO :2具有相似的生物活性。檢測(cè)ATP結(jié)合 或檢測(cè)ATPase活性的方法在現(xiàn)有技術(shù)中廣為人知。根據(jù)本發(fā)明的方法可以方便地采用SEQ ID NO 1所代表的序列的一部分進(jìn)行，或 通過(guò)采用與SEQ ID NO :1雜交(優(yōu)選在嚴(yán)格條件下)的序列進(jìn)行，該雜交序列與SEQ ID NO :1發(fā)揮同樣的生物學(xué)功能(即編碼具有TAD活性的蛋白)，或通過(guò)采用編碼SEQ ID NO 2的序列的同源物、衍生物或其活性片段的核酸進(jìn)行。SEQ ID NO 2的同源物可以在多種原核和真核生物體中找到。然而最接近的同源 物通常在植物界中發(fā)現(xiàn)。合適的SEQ ID NO :2的同源物包括其它在蛋白中出現(xiàn)的TAD結(jié) 構(gòu)域，例如在 GenBank 中登錄號(hào) NP_565435、NP_195376、AAL87170、BAD08048、NP_186956、 BAD07862、NP_197195 或 PIR 登錄號(hào) A84563 或 T51548 中所示的。搜索和識(shí)別TAD同源物的方法完全在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所掌握的技術(shù)范圍內(nèi)。 這種方法包括用計(jì)算機(jī)可讀形式的SEQ ID NO 1或2代表的序列與可以在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中 得到的序列進(jìn)行對(duì)比，例如 MIPS (http://mips. Rsf. de/)、GenBank (http //www, ncbi. nlm. nih. Rov/Genbank/index. html)或 EMBL· 核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www, ebi. ac. uk/embl/ index, html)，采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的序列比對(duì)或比較的運(yùn)算法則，例如，GAP (Needleman和 ffunsch, J. Mol. Biol. 48，443-453 (1970))、BESTFIT (使用 Smith 和 Waterman 的局部同源性
(Advances in Applied Mathematics 2,482-489 (1981))) > BLAST (Altschul, S. F., Gish,ff. ,Miller, W.，Myers，E. W. & Lipman，D. J. , J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)) ,FASTA 和 TFASTA (W. R. Pearson 和 D. J. Lipman，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85，2444-2448 (1988))。 公眾可以通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心獲得進(jìn)行BLAST分析的軟件。上述為了計(jì)算序列同源性的分析可以采用全長(zhǎng)查詢序列或這種序列的一定區(qū)域， 例如采用保守結(jié)構(gòu)域。識(shí)別TAD家族成員(如下定義)或確定TAD和同源物(如下定義)的序列一致性的百分比也可以通過(guò)采用這些保守序列進(jìn)行。對(duì)蛋白序列中這種結(jié)構(gòu)域的 識(shí)別，也完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)，并涉及本發(fā)明采用的計(jì)算機(jī)可讀形式的核 酸、比對(duì)軟件程序的應(yīng)用和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、保守基序和盒的公開(kāi)信息的應(yīng)用。綜合搜索可 以采用 INTERPR0 數(shù)據(jù)庫(kù)(Mulder 等，(2003)Nucl. Acids Res. 31, 315-318, http://www. ebi. ac. uk/interpro/scan. html)進(jìn)行，該數(shù)據(jù)庫(kù)將關(guān)于蛋白質(zhì)家族、結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)的 幾個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合起來(lái)，例如 PRODOM(Servant 等人，(2002) Briefings in Bioinformatics 3, 246-251, http//prodes.toulouse. inra.fr/prodom/2002. l/html/home.php)、 PIR(Huang 等人，(2003)Nucl. Acids Res. 31,390-392, http://pir. georgetown. edu/)或 Pfam(Bateman 等人，(2002)Nucl. Acids Res. 30,276-280, http://pfam. wustl. edu/)數(shù)據(jù) 庫(kù)。為基序搜索而設(shè)計(jì)的序列分析程序可以用于識(shí)別上述的保守片段、區(qū)域和結(jié)構(gòu)域。為 這一目標(biāo)的合適的計(jì)算機(jī)程序包括，例如MEME(Bailey和Elkan(1994)Proceedings of the Second InternationalConference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36，AAAI Press, Menlo Park, California, http://meme. sdsc. edu/meme/website/ intro. html)。術(shù)語(yǔ)TAD包括SEQ ID NO 2代表的蛋白的蛋白同源物，TAD蛋白的“同源物”包括 相對(duì)于未改變的蛋白具有氨基酸取代、缺失和/或插入的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，且具 有與它們衍生自的未改變蛋白類似的生物學(xué)和功能活性。為生產(chǎn)這種同源物，蛋白質(zhì)的氨 基酸可以被其他具有類似性質(zhì)(例如類似的疏水性、親水性、抗原性、形成或打破α-螺旋 結(jié)構(gòu)或片層結(jié)構(gòu)的傾向性)的氨基酸替代?，F(xiàn)有技術(shù)中熟知保守替代表(例如參見(jiàn) Creighton(1984)Proteins, W.H.Freeman and Company)。當(dāng)采用例如GAP的比對(duì)程序，缺口罰分為10和延伸罰分(extend penalty)為0. 5 以及BLOSUM 62矩陣，可用于本發(fā)明的方法的同源物在其與SEQ ID NO 2相應(yīng)的蛋白質(zhì)序 列的部分中，與SEQ ID NO 2具有至少70%的序列一致性。通常同源物與SEQ ID NO 2具 有至少80%的序列一致性或相似性，優(yōu)選至少85%的序列一致性或相似性，進(jìn)一步優(yōu)選與 SEQ ID NO 2具有至少90%的序列一致性或相似性，最優(yōu)選與SEQ ID NO 2具有至少95%、 96%、97%、98%或99%的序列一致性或相似性。相似性的百分比也可以采用例如GAP的比 對(duì)程序計(jì)算。另外，可用于本發(fā)明的方法的同源物也可以定義為具有ATP結(jié)合活性和/或 ATPase活性、且包括22個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的序列，該序列與SEQ ID NO 2中的相應(yīng)序列具 有至少90%的一致性。同源物蛋白可以被分組為“蛋白家族”，一個(gè)蛋白家族可以采用例如Clustal W的 程序通過(guò)功能和序列相似性分析而定義。由Clustal W程序產(chǎn)生的SEQ ID NO 2的同源性 蛋白的鄰近關(guān)系樹(shù)給出了它們的結(jié)構(gòu)和祖先關(guān)系的良好的概括。這些家族成員可以方便地 用于本發(fā)明的方法中。兩種特殊類型的同源物，直向同系物(orthologous)和平行進(jìn)化同源物 (paralogues)是用來(lái)描述基因的祖先關(guān)系的進(jìn)化概念。術(shù)語(yǔ)“平行進(jìn)化同源物”涉及來(lái)自 物種的基因組內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)基因副本的同源性基因。術(shù)語(yǔ)直向同系物涉及在不同的有機(jī) 體中根據(jù)祖先關(guān)系確定的同源性基因。這里采用的術(shù)語(yǔ)“同源物”也包括了可用于本發(fā)明 的方法的蛋白的平行進(jìn)化同源物和直向同系物。直向同系物基因可以通過(guò)用感興趣的目的基因查詢一個(gè)或多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)而識(shí)別，采用諸如BLAST的程序，從搜索中得到的最高級(jí)別的 目標(biāo)基因接著再進(jìn)行BLAST分析，只有那些與查詢基因再次匹配的目標(biāo)基因被保留為真正 的直向同系物基因。例如，為了找到擬南芥(Arabidopsis thaliana)基因的水稻直向同系 物(orthologues)，可以對(duì)水稻數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTN或TBLASTX分析，(例如(但并不限于) NCBI 網(wǎng)立占(http //www, ncbi. nlm. nih. gov)可獲得的7k稻(Oryza sativa) Nipponbare 數(shù)據(jù)庫(kù)，或水稻的基因組序列(栽培種indica或japonica)。下一步，得到的水稻序列被用 來(lái)用擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行反向BLAST分析。當(dāng)?shù)玫降男蛄杏肅lustalW分析并在鄰近關(guān)系樹(shù) 狀圖中顯示時(shí)，結(jié)果可以被進(jìn)一步精確。該方法可以用來(lái)識(shí)別從其它許多不同物種得到的 直向同系物。蛋白質(zhì)的“取代變異體”指那些氨基酸序列中至少一個(gè)殘基被去除且一個(gè)不同的 殘基插入該位置的變異體。氨基酸的取代通常為單個(gè)殘基，但可以根據(jù)多肽的功能限制而 成簇取代。氨基酸取代優(yōu)選包括保守氨基酸的取代。蛋白質(zhì)的“插入變異體”為那些在所 述蛋白質(zhì)的預(yù)先確定的位置插入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。插入可以包括氨基端 和/或羧基端的融合以及序列內(nèi)單個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入。通常在氨基酸序列內(nèi)的插入比 氨基或羧基端的融合小1到10個(gè)殘基的級(jí)別。氨基端或羧基端融合蛋白或肽的例子包括 在酵母雙雜交系統(tǒng)采用的轉(zhuǎn)錄活化劑的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或活性結(jié)構(gòu)域、噬菌體包膜蛋白，(組氨 酸)6-標(biāo)簽，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽，蛋白A，麥芽糖結(jié)合蛋白，二氫葉酸還原酶，標(biāo)簽·100抗 原決定簇，c-myc抗原決定簇，F(xiàn)LAG -抗原決定簇，lacZ，CMP (鈣調(diào)蛋白(calmodulin)結(jié)合 肽)，HA抗原決定簇，蛋白C抗原決定簇和VSV抗原決定簇。蛋白的“缺失變異體”以從蛋白 中去除一個(gè)或多個(gè)氨基酸為特征，缺失通常在大約1-20個(gè)殘基的范圍內(nèi)。蛋白的氨基酸變 異體可以容易地用現(xiàn)有技術(shù)中已知的肽合成技術(shù)制成，例如固相肽合成以及類似的技術(shù)， 或通過(guò)重組DNA操作?，F(xiàn)有技術(shù)中熟知操作DNA序列來(lái)產(chǎn)生蛋白的取代、插入或缺失變異 體的方法。例如，在DNA中預(yù)先確定的位點(diǎn)產(chǎn)生取代突變的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，包 括 M13 誘變，T7-Gen 體外誘變(USB, Cleveland, 0H)，QuickChange 定點(diǎn)誘變(Stratagene, San Diego, CA)，PCR-介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變或其它定點(diǎn)誘變方案。術(shù)語(yǔ)“衍生物”指肽，寡肽，多肽，蛋白和酶，與蛋白的天然形式的氨基酸序列，例如 SEQ ID NO :2所列的蛋白相比，它們可以含有天然或非天然發(fā)生氨基酸殘基的取代、缺失或 添加。TAD的“衍生物”包含肽，寡肽，多肽，蛋白和酶，其中可以含有天然產(chǎn)生的改變，糖基 化，酰基化或與多肽的天然形式的氨基酸序列相比非天然發(fā)生的氨基酸殘基。與其來(lái)源的 氨基酸序列相比，衍生物也可以包括一個(gè)或多個(gè)非氨基酸的取代，例如，與氨基酸序列共價(jià) 或非共價(jià)結(jié)合并促進(jìn)其檢測(cè)的報(bào)告分子或其它配體，以及相對(duì)于天然發(fā)生蛋白的氨基酸序 列的非天然發(fā)生的氨基酸殘基。TAD蛋白的“活性片段”包括蛋白質(zhì)的至少5個(gè)鄰近的氨基 酸殘基，該殘基保留了與天然發(fā)生的蛋白質(zhì)類似的生物學(xué)和/或功能活性。本發(fā)明的方法也可以方便地采用DNA或核酸分子的一部分實(shí)施，該部分保留了 TAD活性，即與SEQ ID NO :2相似的生物學(xué)功能。DNA分子的一部分指從原始(較大的)DNA 分子得來(lái)或制備的DNA片段，當(dāng)該DNA部分在植物中表達(dá)時(shí)，使植物具有改變的生長(zhǎng)特性。 該部分可以包括許多基因，含有或不含另外的調(diào)控元件，或可以只包括間隔序列。本發(fā)明也包括能夠與編碼TAD蛋白的核酸分子雜交的核酸分子，本發(fā)明的方法也 可以采用這些核酸分子施行。這里定義的術(shù)語(yǔ)“雜交”是同源性互補(bǔ)核苷酸序列充分地相互退火的過(guò)程。雜交過(guò)程可以完全在溶液中進(jìn)行，即，互補(bǔ)核酸都在溶液中。依賴于這一過(guò) 程的分子生物學(xué)工具包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR ；以及所有以此為基礎(chǔ)的方法)、差減雜交、隨 機(jī)引物延伸、核酸酶S1作圖、引物延伸、反轉(zhuǎn)錄、cDNA合成、RNAs差異顯示、以及DNA序列確 定。雜交過(guò)程的發(fā)生也可以其中一個(gè)互補(bǔ)核酸固定于基質(zhì)，例如磁珠、瓊脂糖凝膠或任何其 它樹(shù)脂。依賴于這一過(guò)程的分子生物學(xué)工具包括分離poly (A+)mRNA。此外，雜交過(guò)程的發(fā) 生可以其中一個(gè)互補(bǔ)核酸固定于固體支持物，例如硝酸纖維素或尼龍膜，或者用如光刻法 的方式固定于例如硅玻璃支持物(后者已知為核酸陣列或微陣列或核酸芯片)。依賴于這 一過(guò)程的分子生物學(xué)工具包括RNA和DNA凝膠印跡分析、菌落雜交、蝕斑雜交、原位雜交和 微陣列雜交。為了允許雜交的發(fā)生，核酸分子通常被加熱或用化學(xué)方法變性從而由雙鏈熔 解為兩條單鏈和/或從單鏈中去除發(fā)卡結(jié)構(gòu)或其它的二級(jí)結(jié)構(gòu)。例如溫度、鹽濃度和雜交 緩沖液成分的條件影響著雜交的嚴(yán)格性。對(duì)于需要較高的選擇性的應(yīng)用，通常需要采用相對(duì)嚴(yán)格的條件來(lái)形成雜交，例如， 將選擇較低的鹽濃度和/或較高的溫度，如由大約0. 02M到大約0. 15M NaCl在大約50°C到 大約70°C提供的。因此雜交的高度嚴(yán)格性條件包括較高的溫度和/或低鹽濃度(包括NaCl 和檸檬酸鈉的鹽)，但雜交緩沖液中甲酰胺的存在和/或降低雜交緩沖液中例如SDS (十二 烷基硫酸鈉)的化合物的濃度和/或從雜交緩沖液中排除硫酸葡聚糖或聚乙二醇(提高分 子擁擠度)等化合物也可以影響雜交的嚴(yán)格性。特別優(yōu)選足夠低的雜交嚴(yán)格度條件來(lái)分離 與本發(fā)明先前定義的DNA序列同源的核酸。導(dǎo)致同源性的因素包括等位性、遺傳密碼簡(jiǎn)并 性和優(yōu)選密碼子應(yīng)用的不同等。在核酸雜交試驗(yàn)，例如Southern和Northern雜交的情形下，“嚴(yán)格雜交條件”和 “嚴(yán)格雜交洗滌條件”取決于序列，在不同的環(huán)境參數(shù)下也不同。例如，較長(zhǎng)的序列在較高的 溫度下特異性地雜交。Tm是在預(yù)定的離子強(qiáng)度和pH下，50%的目標(biāo)序列與完全匹配的探針 雜交的溫度。特異性通常是雜交后洗滌的函數(shù)，這種洗滌的關(guān)鍵因素包括最終洗滌溶液的 離子強(qiáng)度和溫度。通常，選擇的嚴(yán)格條件比在定義的離子強(qiáng)度和PH下特異性序列的熱熔點(diǎn) Tm低大約50°C。1是在定義的離子強(qiáng)度和pH下，50%的目標(biāo)序列與完全匹配的探針雜交 的溫度。Tm取決于溶液條件和探針的堿基組成，可以用下列等式計(jì)算Tm = 79. 8 "C +(18. 5xlog[Na+]) + (58. 4 "C χ % [G+C]) - (820χ (雙鏈中的 #bp)^)-(0. 5x% 甲酰胺)更加優(yōu)選的嚴(yán)格條件為當(dāng)溫度低于Tm 20°C時(shí)，最優(yōu)選的嚴(yán)格條件為當(dāng)溫度低于 Tffl 10°C時(shí)。也可以采用一些已知技術(shù)的任意一種來(lái)控制非特異性結(jié)合，例如用含有蛋白質(zhì) 的溶液封閉膜，向雜交緩沖液中加入異源性RNA、DNA，以及SDS,以及用Rnase處理。洗滌條 件通常在雜交嚴(yán)格度條件或低于雜交嚴(yán)格度條件實(shí)行。通常，核酸雜交分析的適宜嚴(yán)格度 條件或基因擴(kuò)增檢測(cè)的程序如上所述，可選擇嚴(yán)格度更高或更低的條件。為了確定嚴(yán)格度的水平，可以方便地參考Sambrook等人(2001)分子克隆實(shí)驗(yàn)室 手冊(cè)，第3版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，CSH，紐約，或參考Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989)。低嚴(yán)格度條件的例子為 4_6x SSC/0. 1-0. 5% w/v SDS，37-45°C，2-3小時(shí)。根據(jù)雜交中核酸的來(lái)源和濃度，可以采用其它的嚴(yán)格度條件， 例如中等嚴(yán)格度條件。中等嚴(yán)格度條件的例子包括l-4x SSC/0. 25% w/v SDS, ^ 45°C, 2-3 小時(shí)。高嚴(yán)格度條件的例子包括0. I-Ix SSC/0. 1% w/v SDS，60°C，1_3小時(shí)。熟練技術(shù)人員知道雜交及沖洗期間可以改變的多種參數(shù)，以及維持或改變嚴(yán)格度條件的參數(shù)。例如，另 一嚴(yán)格雜交條件是在4x SSC,65°雜交，然后在0. Ix SSC中，65°C洗滌大約1小時(shí)。另外， 可效仿的嚴(yán)格雜交條件為在50%的甲酰胺，4x SSC中，42°C。另一嚴(yán)格條件的例子包括在 62°C，6x SSC、0.05x BLOTTO 中雜交和在 2x SSC.O. 1% w/v SDS 中，62°C洗滌。本發(fā)明的方法也可應(yīng)用編碼TAD蛋白的核酸分子的可變剪接變異體實(shí)行。這里應(yīng) 用的術(shù)語(yǔ)“可變剪接變異體”包括選擇的內(nèi)含子和/或外顯子已經(jīng)被切除、替代或加入的核 酸序列的變異體。這種變異體可以是其中的蛋白的活性保持不受影響的變異體，可以通過(guò) 選擇性地保留蛋白的功能片段而實(shí)現(xiàn)。這種剪接變異體可以在自然界中發(fā)現(xiàn)或人工制造。 現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知制造該剪接變異體的方法。因此本發(fā)明也包括改變植物的生長(zhǎng)特性， 特別是提高產(chǎn)量的方法，包括改變植物中編碼TAD的核酸分子的可變剪接變異體的表達(dá)和 /或改變由可變剪接變異體編碼的TAD的活性和/或水平。該剪接變異體優(yōu)選SEQ ID NO 1所示序列的剪接變異體。本發(fā)明的方法也可方便地采用編碼TAD的核酸分子的等位基因變異體施行，優(yōu) 選SEQ ID NO :1所示的序列的等位基因變異體。自然界中存在等位基因變異體，本發(fā)明 的方法包括使用這些天然等位基因。等位基因變異體也進(jìn)一步定義為包括單核苷酸多 態(tài)性(SNPs)，以及小插入/缺失多態(tài)性(INDELs ；INDELs的大小通常小于IOObp)。在多 數(shù)有機(jī)體的自然發(fā)生的多態(tài)系中，SNPs和INDELs組成了最大一組的序列變異體。它們 有助于基因作圖和發(fā)現(xiàn)基因和基因功能。它們另外還有助于識(shí)別基因位點(diǎn)，例如植物基 因，涉及生長(zhǎng)率、植物大小和植物產(chǎn)量、植物活力、抗病性、應(yīng)激耐受等等的確定過(guò)程?，F(xiàn) 在可以獲得識(shí)別SNPs和/或INDELs的許多技術(shù)，包括(i)PCR，然后進(jìn)行高效液相變性 色譜(DHPLC ；例如 Cho 等人(1999) Nature Genet. 23，203-207) ； (ii)連續(xù)變性毛細(xì)管電 泳(CDCE)與高保真 PCR 結(jié)合(例如，Li-Sucholeiki 等人(1999)Electrophoresis 20， 1224-1232) ； (iii)變性梯度凝膠電泳(Fischer 和 Lerman (1983)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80,1579-1583) ； (iv)基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析(MALDI-T0F MS; 例如，Ross 等人(2000)Biotechniques 29,620-629) ； (ν)實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè) PCR 分析(Tapp 等人，(2000) Biotechniques 28，732-738) ； (vi) AcryditeTM 凝膠技術(shù)(Kenney 等人， (1998)Biotechniques 25,516-521) ； (vii)循環(huán)雙脫氧指紋識(shí)別(CddF ；Langemeier 等人， (1994)Biotechniques 17,484-490) ； (viii)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析(Vidal-Puig 和 Moller (1994)Biotechniques 17,490-496)以及(ix)迷你測(cè)序引物延伸反應(yīng) (Syvanen (1999) Hum. Mutat. 13，1-10)?；蚪M靴向誘導(dǎo)位點(diǎn)損傷技術(shù)(TILLING ；McCalIum 等人，(2000)Nat. Biotechnol. 18,455-457 ；Plant Physiol. 123，439-442)是上述(i)的 變體，也可以用于迅速地在例如表現(xiàn)出感興趣表型的化學(xué)誘變的植物個(gè)體中識(shí)別改變的基 因。在特定的常規(guī)育種程序中，例如在標(biāo)志物輔助育種中，上述的等位基因變異體的 運(yùn)用也包含在本發(fā)明內(nèi)；這可以是它們?cè)诒景l(fā)明的方法中另外的應(yīng)用。這種育種程序有時(shí) 要求通過(guò)對(duì)植物進(jìn)行誘變處理向植物中引入等位基因變異體。一種合適的誘變方法為EMS 誘變，接著通過(guò)例如PCR的方法來(lái)識(shí)別等位基因變異體，之后為選擇步驟，來(lái)選擇討論序列 [命名蛋白]的更好的等位基因變異體，該變異體可以使植物中生長(zhǎng)特性發(fā)生改變。選擇 通常通過(guò)監(jiān)控含有不同的所討論序列的等位基因變異體的植物的生長(zhǎng)表現(xiàn)進(jìn)行，例如，SEQID NO :1的不同等位基因變異體。監(jiān)控生長(zhǎng)表現(xiàn)可以在溫室或田野中進(jìn)行。另外可選擇的 步驟包括將其中識(shí)別了優(yōu)良等位基因變異體的植物與其它植物雜交，這可以被用于將感興 趣表型特性組合起來(lái)等等。因此，由于TAD基因中的突變可以天然發(fā)生，它們可以構(gòu)成選擇 表現(xiàn)出高產(chǎn)量的植物的基礎(chǔ)。本發(fā)明的方法也可以通過(guò)向植物中至少導(dǎo)入染色體的一部分(自然的或人工的) (例如細(xì)菌人工染色體(BAC))來(lái)施行，該染色體含有編碼TAD (例如SEQ ID NO=D的至少 一種基因/核酸，優(yōu)選與來(lái)自同一物種或來(lái)自同一基因家族的一個(gè)或多個(gè)相關(guān)基因，和/或 編碼TAD表達(dá)和/或活性的調(diào)控蛋白的核酸分子同時(shí)導(dǎo)入。因此，本發(fā)明也包括了一種通 過(guò)向植物中導(dǎo)入含有至少一個(gè)編碼TAD的基因/核酸的染色體的一部分來(lái)改變植物的生長(zhǎng) 特性，特別是提高產(chǎn)量的方法，該編碼TAD的基因/核酸在種子優(yōu)先啟動(dòng)子的控制下，且人 工染色體也優(yōu)選包括來(lái)自同一物種的一個(gè)或多個(gè)相關(guān)基因，和/或編碼TAD表達(dá)和/或活 性的調(diào)控蛋白的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，設(shè)想與相應(yīng)的野生型植物對(duì)比使核酸過(guò)表達(dá)(或表 達(dá)提高)，提高或降低編碼TAD蛋白的核酸的表達(dá)(或調(diào)節(jié)表達(dá))包括在整個(gè)生物體或在特 定的細(xì)胞或組織中改變表達(dá)。可以通過(guò)例如化學(xué)手段和/或重組手段來(lái)實(shí)現(xiàn)改變基因的表 達(dá)。調(diào)節(jié)TAD基因的表達(dá)可以直接實(shí)現(xiàn)(即通過(guò)調(diào)節(jié)所述TAD編碼基因本身的表達(dá))。在 直接方法中，調(diào)節(jié)的表達(dá)可以由改變內(nèi)源性TAD基因的表達(dá)而產(chǎn)生和/或可以由改變預(yù)先 導(dǎo)入植物的TAD編碼核酸的表達(dá)而產(chǎn)生。另外或可選地，上述的表達(dá)的調(diào)節(jié)可以以間接方 式達(dá)到，例如作為降低或增加調(diào)控TAD基因表達(dá)的因子的水平和/或活性的結(jié)果。改變的 表達(dá)理解為當(dāng)與相應(yīng)的野生型植物的相應(yīng)的TAD蛋白的表達(dá)對(duì)比時(shí)的改變?？梢苑奖愕赝ㄟ^(guò)化學(xué)手段改變編碼TAD蛋白核酸的表達(dá)和/或改變TAD蛋白本身 的水平和/或活性，即通過(guò)外源性應(yīng)用一種或多種能夠改變TAD基因(該基因可以是一種 內(nèi)源性基因或?qū)胫参锏霓D(zhuǎn)基因)的表達(dá)的化合物或元件。術(shù)語(yǔ)“外源性應(yīng)用”在其廣義 的含義包括用合適的化合物或元件接觸或給予細(xì)胞、組織、器官或生物體。該化合物可以以 適合植物攝入的方式外源性地應(yīng)用于植物(例如通過(guò)施用到土壤中通過(guò)根來(lái)吸收，或直接 施用于葉子，如通過(guò)噴霧)。適合外源性應(yīng)用的化合物或元件包括編碼TAD的核酸或與其雜 交的核酸。另外或可選地，用基因的相互作用蛋白或用抑制劑或活化劑接觸或給予細(xì)胞、組 織、器官或生物體提供了調(diào)控編碼TAD的核酸的表達(dá)的另一外源性方式。編碼TAD的核酸 的表達(dá)調(diào)控也可以作為直接或間接活化或滅活TAD蛋白的因子的水平改變的結(jié)果而實(shí)現(xiàn)。而且，植物、種子或其它植物材料可以用誘變物質(zhì)進(jìn)行處理。誘導(dǎo)突變的化學(xué)物質(zhì) 包括N-亞硝基-N-乙脲、吖丙啶、乙基甲烷磺酸酯和二乙基硫酸酯。作為選擇，離子放射， 例如X線或Y線也可以同樣良好地使用。引入突變和檢測(cè)突變效果的方法(例如改變的 基因表達(dá)和/或改變的蛋白活性)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。誘變包括利用化學(xué)突變劑，以及 物理突變劑，例如放射。TAD蛋白的任何特性均可以通過(guò)誘變而改變，例如這些突變可以是 TAD編碼基因調(diào)控改變的原因，導(dǎo)致基因預(yù)期的表達(dá)水平或表達(dá)模式。特別是，這些突變可 以導(dǎo)致TAD主要限于種子的過(guò)表達(dá)?？蛇x地和/或另外地可以調(diào)節(jié)蛋白的活性或底物特異 性，或可以調(diào)節(jié)對(duì)輔因子的親和性。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，所述的誘變導(dǎo)致TAD蛋白 在植物種子中表達(dá)和/或活性和/或水平的增加。另外或作為選擇，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，調(diào)節(jié)編碼TAD蛋白的核酸的表達(dá)和/或改變TAD蛋白本身的水平和/或活性可以通過(guò)重組手段實(shí)現(xiàn)。這種重組手段可 以包括直接或間接途徑來(lái)調(diào)節(jié)核酸的表達(dá)。例如，一種間接途徑可以包括向植物中導(dǎo)入一種能夠調(diào)節(jié)目的蛋白(TAD蛋白)水 平和/或活性和/或能夠改變目的基因(編碼TAD蛋白的基因)表達(dá)的核酸。這些能被導(dǎo) 入植物中的核酸的例子包括編碼與TAD基因啟動(dòng)子結(jié)合或與TAD蛋白相互作用的轉(zhuǎn)錄因 子、活化劑、抑制劑或其它配體的核酸。檢測(cè)這些類型的相互作用的方法和分離編碼這種相 互作用物的核酸的方法包括酵母單雜交或酵母雙雜交篩查等。TAD基因或TAD蛋白可以是 野生型，即天然或內(nèi)源性核酸或多肽?？蛇x地，它可以是來(lái)自同一或另一物種的核酸，例如 通過(guò)轉(zhuǎn)化將該基因作為轉(zhuǎn)基因?qū)?。該轉(zhuǎn)基因可以相對(duì)于其最初的形式在組成和/或基因 組環(huán)境上通過(guò)精密的人工操作充分地改變。還包括一種調(diào)節(jié)TAD基因表達(dá)的間接途徑，即 抑制或刺激調(diào)控序列，或提供驅(qū)動(dòng)編碼TAD的天然基因或編碼TAD的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的調(diào)控序 列。這種調(diào)控序列可以被導(dǎo)入植物，例如，被導(dǎo)入植物的調(diào)控序列可以是能夠驅(qū)動(dòng)內(nèi)源性 TAD基因表達(dá)的啟動(dòng)子。一種調(diào)節(jié)TAD基因表達(dá)的直接和優(yōu)選的途徑包括向植物中導(dǎo)入編碼TAD蛋白或其 同源物、衍生物或其活性片段的核酸分子。該核酸可以被導(dǎo)入植物，例如通過(guò)轉(zhuǎn)化。一種更加優(yōu)選的途徑包括向植物中導(dǎo)入SEQ ID NO 1所示的TAD基因。最優(yōu)選的 途徑包括向植物中導(dǎo)入以有義方向與種子優(yōu)先啟動(dòng)子偶聯(lián)的TAD編碼基因?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有許多文件記載了獲得提高或增加的基因表達(dá)或基因產(chǎn)物的方 法，包括通過(guò)合適的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的過(guò)表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子的應(yīng)用。這里采用 的術(shù)語(yǔ)“過(guò)表達(dá)”一詞表示相對(duì)于原初野生型表達(dá)水平增加的任意形式的表達(dá)。相對(duì)于它所 可操作地連接的啟動(dòng)子，優(yōu)選引入植物的核酸和/或在植物中過(guò)表達(dá)的核酸為有義方向。 過(guò)表達(dá)的核酸優(yōu)選編碼TAD蛋白，更加優(yōu)選植物來(lái)源的TAD蛋白，該編碼TAD蛋白的核酸分 子更加優(yōu)選來(lái)自雙子葉植物，優(yōu)選來(lái)自茄科(Solanaceae)，更加優(yōu)選分離于煙草。該核酸序 列最優(yōu)選SED ID NO :1所示的核酸序列或其一部分，或編碼SEQ ID NO :2所示的氨基酸序 列或編碼其同源物、衍生物或活性片段。然而，必須注意本發(fā)明的應(yīng)用并非僅限于SEQ ID NO 1所示的核酸的應(yīng)用，也不僅限于編碼SEQ ID NO 2的氨基酸序列的核酸分子，而其它 編碼SED ID NO :2的同源物、衍生物或活性片段的核酸分子或SEQ ID NO :1的部分，或與 SEQ ID NO :1雜交的序列均可應(yīng)用于本發(fā)明的方法中。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，設(shè)想核酸序列表達(dá)下降。改變基因的表達(dá)(通過(guò)直接或 間接方法)包括改變基因的轉(zhuǎn)錄水平。改變轉(zhuǎn)錄水平可能足夠誘發(fā)一定的表型效應(yīng)，例如 通過(guò)共抑制機(jī)理。這里過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因的總體效應(yīng)是，細(xì)胞中的與引入的轉(zhuǎn)基因有同族關(guān)系 的天然基因編碼的蛋白質(zhì)具有較小的活性，其它降低表達(dá)的例子在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有許 多文件說(shuō)明，包括，例如通過(guò)反義技術(shù)、共抑制技術(shù)、RNAi技術(shù)、小干擾RNAs (siRNAs)和微 RNA(miRNA)、核酶的應(yīng)用等等下調(diào)表達(dá)。因此根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定方面，提供了改變植物 生長(zhǎng)特性的方法，包括基于反義轉(zhuǎn)錄物(與TAD基因片段的mRNA互補(bǔ))的合成、或基于RNA 干擾的技術(shù)。本發(fā)明的方法可以方便地通過(guò)下調(diào)編碼TAD的核酸序列來(lái)施行。具有改變的 生長(zhǎng)特性的植物可以通過(guò)以有義或反義方向表達(dá)編碼TAD的核酸序列而獲得。下調(diào)技術(shù)是 現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知的。這里采用的術(shù)語(yǔ)表達(dá)的“基因靜默”或“下調(diào)”指降低基因表達(dá)的 水平和/或活性基因產(chǎn)物的水平和/或基因產(chǎn)物的活性的水平。這種表達(dá)的降低可以伴隨著有義方向的編碼序列或其部分的增加等等(如果需要共抑制)。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè) 方面，可以通過(guò)向植物中導(dǎo)入另外拷貝的(全長(zhǎng)或部分)宿主植物中已經(jīng)存在的TAD基因 的片段而改變植物的生長(zhǎng)。加入的基因?qū)⑹箖?nèi)源性基因靜默，產(chǎn)生已知為共抑制的現(xiàn)象。以基因表達(dá)靜默為目的的遺傳構(gòu)建體可以包括編碼TAD的核酸序列，例如相對(duì)于 啟動(dòng)子序列的有義和/或反義方向的SEQ ID NO :1所示的核酸序列(或其中一個(gè)或多個(gè)部 分)，本發(fā)明的方法中也可以利用正向或反向重復(fù)形式的內(nèi)源基因的至少一部分的有義或 反義拷貝。植物的生長(zhǎng)特性也可以通過(guò)向植物中引入SEQ ID NO :1等所示的核酸序列的反 義形式的至少一部分而改變。應(yīng)當(dāng)清楚核酸的局部(一部分)可以達(dá)到需要的結(jié)果。來(lái)自 同樣植物物種的相應(yīng)的基因的反義序列優(yōu)于來(lái)自同樣或其它植物物種的同源性基因的反 義序列。另一個(gè)下調(diào)基因表達(dá)或基因靜默的方法包括采用核酶，如Atkins等人1994(W0 94/00012)，Lenee 等人 1995 (W0 95/03404)，Lutziger 等人 2000 (W0 00/00619), Prinsen 等人 1997 (W0 97/3865)以及 Scott 等人 1997 (W0 97/38116)所描述的?；蜢o默也可以通過(guò)插入誘變而達(dá)到(例如，T-DNA插入或轉(zhuǎn)座子插入)，或通過(guò) Angell 和 Baulcombe 1998 (W0 98/36083)，Lowe 等人 1989 (W0 98/53083)，Lederer 等人 1999 (W0 99/15682)或Wang等人1999 (W0 99/53050)所描述的基因靜默策略。如果內(nèi)源性 基因含有突變，則內(nèi)源性基因的表達(dá)也可以下調(diào)，為了得到具有改良的生長(zhǎng)特性的植物，這 樣的突變基因可以被分離并引入同樣或不同的植物物種。TAD蛋白的過(guò)表達(dá)優(yōu)選首先在植物的種子中實(shí)現(xiàn)，更加優(yōu)選在種子的胚乳中?？蛇x 地，過(guò)表達(dá)在植物的幼苗中實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明的方法的實(shí)行可以方便地導(dǎo)致植物具有多種改變 的生長(zhǎng)特性，這些生長(zhǎng)特性包括相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物改變的產(chǎn)量或生物量。改變的生 長(zhǎng)特性優(yōu)選為改善的生長(zhǎng)特性，包括相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物增加的產(chǎn)量或生物量?！爱a(chǎn)量”指單位面積生產(chǎn)的收獲物的量，術(shù)語(yǔ)“增加的產(chǎn)量”包括相對(duì)于相應(yīng)的野 生型植物的生物量而言植物的一個(gè)或多個(gè)部分的生物量的提高。依賴于農(nóng)作物，植物的收 獲部分可能為植物的不同部分或組織，例如種子(如水稻、高梁或?yàn)楂@取種子而種植的玉 米)；總的地上生物量(如，用作飼料的玉米、甘蔗)、根(如甜菜)、果實(shí)(如番茄)、棉纖維， 或具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物的任意其它部分。例如，本發(fā)明的方法用于提高水稻和玉米的種子 產(chǎn)量，或在總的地上生物量和能量含量方面提高飼料玉米的產(chǎn)量。產(chǎn)量的增加包括種子產(chǎn) 量的增加，包括種子的總生物量(總種子重量)的增加和/或飽滿種子(filled seed)數(shù) 的增加和/或總種子數(shù)的增加。產(chǎn)量的增加也表現(xiàn)在收獲指數(shù)的增加，其中收獲指數(shù)表示 為種子等可收獲部分的產(chǎn)量和總生物量的比例。因此，提供了一種相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物而言提高植物產(chǎn)量，特別是種子產(chǎn)量 的方法，包括主要在該植物的種子中導(dǎo)入和過(guò)表達(dá)編碼TAD蛋白，其同源物、衍生物或活性 片段的核酸序列，其中產(chǎn)量的提高包括相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物增加的總種子重量、增加 的飽滿種子數(shù)、或增加的收獲指數(shù)的至少其中之一。產(chǎn)量本身為一種復(fù)雜的參數(shù)，其中總產(chǎn)量取決于一些產(chǎn)量成分。農(nóng)作物增加的產(chǎn) 量的參數(shù)為本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知。例如，農(nóng)作物的關(guān)鍵產(chǎn)量參數(shù)包括每公頃或畝的植物 數(shù)量，每株植物的抽穗數(shù)量，每穗的行數(shù)(種子)，每行的谷粒數(shù)，每千粒重量。根據(jù)本發(fā)明 的方法獲得的產(chǎn)量的提高可以作為這些產(chǎn)量參數(shù)的一個(gè)或多個(gè)的結(jié)果而獲得。例如，水稻的關(guān)鍵產(chǎn)量參數(shù)為每公頃或每畝的植物數(shù)量、每株植物的散穗(panicle)數(shù)目、每散穗的 小穗(spikelet)數(shù)目、種子飽滿率以及每千粒重量。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的產(chǎn)量的提高 可以作為這些產(chǎn)量參數(shù)的一個(gè)或多個(gè)的結(jié)果而獲得。產(chǎn)量的提高優(yōu)選通過(guò)主要基于提高每 散穗花的數(shù)目以及提高種子飽滿率而獲得。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的性質(zhì)，本發(fā)明的方法的完成導(dǎo)致植物具有改變的產(chǎn)量。 改變的產(chǎn)量?jī)?yōu)選為種子產(chǎn)量增加，且包括散穗數(shù)目、每散穗的小穗數(shù)目、總種子數(shù)目、飽滿 種子數(shù)、總種子重量、千粒重以及收獲指數(shù)中的至少一種的增加，每種均相對(duì)于對(duì)照植物而 言。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種提高植物的種子總重、飽滿種子數(shù)和/或收獲指數(shù)的方 法，該方法包括以種子優(yōu)先的方式，調(diào)節(jié)植物中編碼TAD蛋白的核酸分子的表達(dá)和/或調(diào)節(jié) TAD本身的活性，優(yōu)選其中TAD蛋白由SEQ ID NO 1或其一部分或由能夠與其雜交的序列 編碼，或其中TAD如SEQ ID NO :2所示或?yàn)槠渫次?、衍生物或活性片段。根?jù)本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式
，提供了用來(lái)幫助用于本發(fā)明的方法的核酸序列 的導(dǎo)入和/或表達(dá)的遺傳構(gòu)建體和載體，因此根據(jù)本發(fā)明的第二種具體實(shí)施方式
，提供了 一種基因構(gòu)建體，包括 a. 一種能夠調(diào)節(jié)編碼TAD蛋白的核酸的表達(dá)和/或TAD蛋白的水平和/或活性的 核酸序列；b.能夠驅(qū)動(dòng)(a)所述核酸序列表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列；c.轉(zhuǎn)錄終止序列。用于本發(fā)明的方法的構(gòu)建體可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組DNA技術(shù)建立。該 基因構(gòu)建體可以被插入載體，載體可以購(gòu)買得到，適合于轉(zhuǎn)化入植物并適合感興趣基因在 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表達(dá)。遺傳構(gòu)建體可以為表達(dá)載體，其中核酸分子可操作性地與一種或多種調(diào) 控序列連接，使其在原核和/或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，遺傳構(gòu)建體可以為表達(dá)載體，設(shè)計(jì)用于 過(guò)表達(dá)核酸分子；特別為主要在種子中獲得過(guò)表達(dá)，更特別在植物種子的胚乳中過(guò)表達(dá)。 另外地和/或可選地，設(shè)計(jì)的表達(dá)載體用于在幼苗階段過(guò)表達(dá)核酸。能夠調(diào)節(jié)編碼TAD蛋 白的核酸分子的表達(dá)的核酸分子優(yōu)選為編碼TAD或其同源物、衍生物或活性片段的核酸分 子，例如這里前述的任意的核酸分子。優(yōu)選的核酸分子為SEQ ID NO :1所示的序列或其一 部分，或能夠與其雜交的序列，或編碼SEQ ID NO :2所示的序列或編碼其同源物、衍生物或 活性片段的核酸分子。該核酸優(yōu)選相對(duì)于它操作性連接的調(diào)控序列以有義的方向克隆。用含有感興趣序列(即編碼TAD蛋白的核酸分子)的載體轉(zhuǎn)化植物，該序列與一 個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列(至少一個(gè)啟動(dòng)子)可操作地連接。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控元件”、“調(diào)控序列”、“控 制序列，，和“啟動(dòng)子”這里可互換使用和在廣泛的情形下使用，指能夠影響它們所連接的序 列的表達(dá)的調(diào)節(jié)核酸，被前述術(shù)語(yǔ)包括的為來(lái)源于經(jīng)典的真核基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列 (包括精確的轉(zhuǎn)錄起始所必需的TATA盒，具有或不具有CCAAT盒序列)以及附加的調(diào)控元 件(即，上游活化序列，增強(qiáng)子，靜默子)，該序列根據(jù)發(fā)育和/或外部刺激而改變基因的表 達(dá)，或以組織特異性的方式表達(dá)。經(jīng)典的原核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列也包含在該術(shù)語(yǔ)范圍內(nèi)， 在該情形下，它可以包括一個(gè)-35盒序列和/或-10盒轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”也 包含賦予、活化或增強(qiáng)細(xì)胞、組織或器官中核酸分子表達(dá)的合成融合分子或衍生物，這里采 用的術(shù)語(yǔ)“可操作性連接”指在啟動(dòng)子序列和感興趣基因之間的功能性連接，從而使啟動(dòng)子序列能夠起始感興趣基因的轉(zhuǎn)錄。為了獲得需要的改變的生長(zhǎng)特性，感興趣基因以合適的水平和以空間和發(fā)育的適 宜模式表達(dá)很重要。編碼TAD蛋白的核酸分子優(yōu)選與種子優(yōu)先啟動(dòng)子可操作地連接。這里 定義的“種子優(yōu)先”啟動(dòng)子指在一個(gè)或多個(gè)種子組織中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)表達(dá)的啟動(dòng)子，該種子優(yōu) 先啟動(dòng)子優(yōu)選為胚乳優(yōu)先啟動(dòng)子，更優(yōu)選GenBank中登錄號(hào)為X65064所示的啟動(dòng)子(從核 苷酸1到672的序列，這里以后命名為PR00090)，或類似強(qiáng)度和/或類似表達(dá)模式的啟動(dòng) 子。因此，本發(fā)明也提供了一種改變植物的生長(zhǎng)特性，特別是產(chǎn)量的方法，包括增加植物中 編碼TAD蛋白的核酸的表達(dá)，其中增加的表達(dá)主要在種子中獲得。該表達(dá)優(yōu)選在種子優(yōu)先 的啟動(dòng)子的控制下實(shí)現(xiàn)，種子優(yōu)先啟動(dòng)子更加優(yōu)選為胚乳優(yōu)先啟動(dòng)子，種子優(yōu)先啟動(dòng)子最 優(yōu)選PR00090。然而，應(yīng)當(dāng)注意該P(yáng)R00090啟動(dòng)子在幼苗中也有活性，因此本發(fā)明的方法也 可以采用幼苗優(yōu)先啟動(dòng)子實(shí)行。因此，本發(fā)明也提供了一種改變植物的生長(zhǎng)特性，特別是產(chǎn) 量的方法，包括增加植物中編碼TAD蛋白的核酸的表達(dá)，其中增加的表達(dá)主要在幼苗中獲 得。啟動(dòng)子的強(qiáng)度和/或表達(dá)模式可以通過(guò)例如將該啟動(dòng)子與報(bào)告基因連接并檢測(cè) 報(bào)告基因在不同的植物組織中的表達(dá)來(lái)分析。一個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的合適的報(bào)告基因 為β葡糖醛酸酶，接著啟動(dòng)子的強(qiáng)度和/或表達(dá)模式可以與充分鑒定的參考啟動(dòng)子比較， 例如CaMV 35S啟動(dòng)子或種子優(yōu)先的水稻谷醇溶蛋白NRP33啟動(dòng)子。非限制性的其它種子 優(yōu)先啟動(dòng)子的例子列于表1中，這些啟動(dòng)子或其衍生物也可以用于本發(fā)明的方法中。表1 本發(fā)明的實(shí)行中示例性的種子優(yōu)先啟動(dòng)子
權(quán)利要求
一種相對(duì)于相應(yīng)野生型植物提高植物產(chǎn)量的方法，包括改變植物中分離的編碼TAD蛋白的核酸序列的表達(dá)和/或改變植物中TAD蛋白的活性，其中所述的改變表達(dá)和/或改變活性為增加表達(dá)和/或增加活性，和其中所述TAD蛋白是由SEQ ID NO2所示的蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述TAD蛋白由SEQID N0:1所示的核酸編碼。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的改變通過(guò)重組手段實(shí)現(xiàn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的改變表達(dá)包括向植物中導(dǎo)入編碼TAD蛋白 的核酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述提高的產(chǎn)量包括提高的種子產(chǎn)量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述提高的種子產(chǎn)量至少包括飽滿種子數(shù)的提高。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述提高的種子產(chǎn)量至少包括總種子重量的提高。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述提高的種子產(chǎn)量至少包括收獲指數(shù)的提高。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的編碼TAD蛋白的核酸序列來(lái)源于植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的改變表達(dá)為與相應(yīng)的野生型植物相比過(guò)表達(dá)。
11.包括下述各項(xiàng)的構(gòu)建體a.一種能夠改變編碼TAD蛋白的核酸的表達(dá)和/或TAD蛋白的活性的核酸序列，其中 所述的改變表達(dá)和/或改變活性為增加表達(dá)和/或增加活性，和其中所述TAD蛋白是由SEQ ID NO :2所示的蛋白；b.一種或多種能夠驅(qū)動(dòng)(a)項(xiàng)的核酸序列表達(dá)的調(diào)控序列；c.一種轉(zhuǎn)錄終止序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的構(gòu)建體，其中所述TAD蛋白由SEQID NO 1所示的核酸編碼。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的構(gòu)建體，其中所述的核酸編碼TAD蛋白。
14.生產(chǎn)與相應(yīng)的野生型植物相比具有提高的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括a.向植物或植物細(xì)胞中導(dǎo)入編碼TAD蛋白的核酸序列，其中所述TAD蛋白是由SEQID NO :2所示的蛋白；b.在促進(jìn)再生和成熟植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)該植物細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述TAD蛋白由SEQID NO :1所示的核酸編碼。
16.權(quán)利要求11或12的構(gòu)建體在提高產(chǎn)量中的應(yīng)用。
17.權(quán)利要求16的應(yīng)用，其中所述提高的產(chǎn)量包括提高的種子產(chǎn)量。
18.權(quán)利要求17的應(yīng)用，其中所述提高的種子產(chǎn)量包括提高的飽滿種子數(shù)、提高的總 種子重量或提高的收獲指數(shù)中的至少一種。
19.轉(zhuǎn)基因植物、其植物部分或種子在加工中的應(yīng)用，其中所述轉(zhuǎn)基因植物與相應(yīng)的野 生型植物相比具有提高的產(chǎn)量，并且具有改變的編碼TAD蛋白的核酸序列的表達(dá)和/或改 變的TAD蛋白的活性，其中所述改變的表達(dá)和/或改變的活性為與相應(yīng)的野生型植物相比 增加的表達(dá)和/或增加的活性，和其中所述TAD蛋白是由SEQ ID NO :2所示的蛋白。
20.權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中所述TAD蛋白由SEQID NO 1所示的核酸編碼。
21.權(quán)利要求19或20的應(yīng)用，其中所述的植物為農(nóng)作物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的應(yīng)用，其中所述的農(nóng)作物為大豆、向日葵、油菜、苜蓿、油菜籽或棉花。
23.根據(jù)權(quán)利要求19或20的應(yīng)用，其中所述的植物為單子葉植物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的應(yīng)用，其中所述的單子葉植物為甘蔗。
25.根據(jù)權(quán)利要求19或20的應(yīng)用，其中所述的植物為谷物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的應(yīng)用，其中所述的谷物為水稻、玉米、小麥、粟、大麥、高梁。
全文摘要
本申請(qǐng)涉及一種通過(guò)改變植物中編碼TAD蛋白的核酸序列的表達(dá)和/或通過(guò)改變植物中TAD蛋白的活性來(lái)改變植物的生長(zhǎng)特性的方法。本發(fā)明還涉及具有改變的生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因植物，該植物具有編碼TAD蛋白片段的核酸表達(dá)的改變。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101935664SQ201010243748
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2004年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月1日
發(fā)明者V·弗蘭克卡德, Y·哈茨費(fèi)爾德 申請(qǐng)人:作物培植股份有限公司