專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)己烯雌酚的方法及其專(zhuān)用化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)己烯雌酚的方法及其專(zhuān)用化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
目前動(dòng)物性食品安全已成為全世界關(guān)注的焦點(diǎn)，其中獸藥殘留問(wèn)題是影響動(dòng)物 性食品安全的最主要因素之一，由于動(dòng)物樣本成分復(fù)雜，待測(cè)物濃度較低，而且大多數(shù)取 樣量很少，這就對(duì)分析方法的選擇性和靈敏度提出了更高的要求?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析 (Chemiluminescence analysis,CL1A)技術(shù)將高靈敏的化學(xué)發(fā)光技術(shù)與高特異性的免疫反 應(yīng)結(jié)合起來(lái)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、線性范圍寬、操作簡(jiǎn)便、不需要十分昂貴的儀器設(shè)備 等特點(diǎn)。CLIA不需要外來(lái)光源，具有比熒光免疫分析更高的信噪比，比常規(guī)的酶聯(lián)免疫吸附 檢測(cè)方法的抗背景干擾能力強(qiáng)，其靈敏度比ELISA高1至2個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)范圍可達(dá)6個(gè)數(shù) 量級(jí)，自動(dòng)化程度高，提高了分析方法的精密度，CLIA已經(jīng)成為一種先進(jìn)的痕量或超痕量物 質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)。CLIA在獸醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品分析等方面將會(huì)有更廣闊的應(yīng)用前景。己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)是一種人工合成的雌激素，因其能促進(jìn)蛋 白合成，加快增重和骨骼鈣化，并減少飼料消耗，被作為動(dòng)物促生長(zhǎng)劑應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)和水 產(chǎn)養(yǎng)殖等方面。但許多科學(xué)試驗(yàn)證實(shí)了己烯雌酚是一種致癌物質(zhì)，并具有以生殖毒性為主 的嚴(yán)重毒副作用對(duì)人和動(dòng)物的健康危害較大，現(xiàn)在歐美、中國(guó)等許多國(guó)家已禁止將其用于 動(dòng)物飼料中，但在畜牧生產(chǎn)上的常有非法應(yīng)用的情況，導(dǎo)致其在畜禽產(chǎn)品中殘留，危害公眾 健康。目前，動(dòng)物組織中己烯雌酚殘留的檢測(cè)方法主要采用氣相色譜法、液相色譜法、氣相 色譜_質(zhì)譜法、液相色譜_聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫法等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)己烯雌酚的方法及其專(zhuān)用化學(xué)發(fā)光免疫試劑
品.ο本發(fā)明所提供的檢測(cè)己烯雌酚的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，包括己烯雌酚特異性抗 體、包被原和標(biāo)準(zhǔn)品溶液；所述包被原為己烯雌酚半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)式如 式I所示
權(quán)利要求
一種檢測(cè)己烯雌酚的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，包括己烯雌酚特異性抗體、包被原和標(biāo)準(zhǔn)品溶液；所述包被原為己烯雌酚半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)式如式I所示FSA00000216119500011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括發(fā)光 液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液、包被緩沖液、封閉液和酶標(biāo)抗抗體；所述試劑盒由己烯雌酚特異性抗體、包被原、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、發(fā)光液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù) 溶液、包被緩沖液、封閉液和酶標(biāo)抗抗體組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，其特征在于所述己烯雌酚特異性抗體為己烯雌酚單克隆抗體或己烯雌酚多克隆抗體； 所述己烯雌酚單克隆抗體是由保藏號(hào)為CGMCC No. 3775的對(duì)己烯雌酚的單克隆雜交瘤 細(xì)胞株DES分泌的抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液 中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為ο μ g/L、0. 5 μ g/L、1 μ g/L、5 μ g/L、10 μ g/L或50 μ g/L，所述標(biāo)準(zhǔn)品為 己烯雌酚；所述發(fā)光液由C液和D液組成，發(fā)光液C液為過(guò)氧化氫；發(fā)光液D液為魯米諾溶液； 所述濃縮洗滌液是將0. 05g疊氮鈉防腐劑和IOOmL濃度為0. 02M、pH為7. 4的磷酸鹽 緩沖液混合得到溶液；所述濃縮復(fù)溶液是將0. Ig牛血清白蛋白和IOOmL濃度為0. 05mol/L、pH為7. 4的磷酸 鹽緩沖液混合得到的溶液；所述包被緩沖液是PH值為9. 6的濃度為0. 03mol/L的碳酸鹽緩沖液； 所述封閉液是將0. Olg疊氮化鈉、IOg牛血清白蛋白和IOOmL濃度為0. 03mol/L、pH值 為7. 4磷酸鹽溶液混合得到的溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，其特征在于所述包被原是按照如下方法制備得到的a、將每18mg己烯雌酚半抗原、2. 5mL 二甲基 甲酰胺、15 μ L三正丁胺和9 μ L氯甲酸異丁酯混合反應(yīng)30min，得到的產(chǎn)物溶液稱(chēng)為A液； 將每15mg載體蛋白溶于ImL 50%的二甲基甲酰胺水溶液(體積百分含量)中，調(diào)節(jié)pH至 9，得到的產(chǎn)物溶液稱(chēng)為B液；b、將A液加入到B液，4V反應(yīng)4h后，再經(jīng)過(guò)透析得到包被原； 所述己烯雌酚半抗原的結(jié)構(gòu)式如式II所示
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，其特征在于所述己烯雌酚半抗原是按照如下方法制備得到的I、先將每IlOmg己烯雌酚、200mg無(wú)水碳酸鈉、50 μ L 4-溴丁酸乙酯和5mL丙酮混合得 到混合物，II、將步驟I得到的混合物進(jìn)行60°C回流提取4h，抽干反應(yīng)液，得到殘留物，III、 再將步驟II得到的殘留物溶解于5mL甲醇-氫氧化鉀混合液后進(jìn)行80°C回流提取lh，抽 干反應(yīng)液，再次得到殘留物，IV、向步驟III得到的殘留物中加入SmL水得到混合液，調(diào)節(jié) PH為3，離心收集沉淀；V、向步驟IV的沉淀加入5mL氯仿抽提，將有機(jī)相用硫酸鈉干燥得到 殘留物；VI、將步驟V得到的殘留物溶于沸氯仿，再加入石油醚重結(jié)晶，干燥后得到的產(chǎn)物 即為己烯雌酚半抗原；所述甲醇-氫氧化鉀液為將88mg氫氧化鉀溶解于5mL甲醇得到的溶 液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，其特征在于所述載體蛋白為鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血藍(lán)蛋白，優(yōu)選為卵清蛋白；所述酶標(biāo)記抗抗體為酶標(biāo)記羊抗鼠抗抗體。
8.一種檢測(cè)己烯雌酚的方法，包括以下步驟1)樣品前處理將每2g動(dòng)物組織勻漿與IOmL乙腈-丙酮溶液混勻lmin，以3000g轉(zhuǎn)速離心5min，取 上清液；將每2mL所述上清液用氮?dú)飧稍铮偌尤隝mL復(fù)溶液溶解，再向其中加入ImL正己 烷混合，3000g離心5min，取下層溶液稀釋5倍即為待測(cè)樣本溶液；所述乙腈_丙酮溶液為 將乙腈和丙酮按體積比為80 20混合獲得；所述動(dòng)物組織為豬肉或雞肉；所述復(fù)溶液為 將所述濃縮復(fù)溶液用0. 05mol/L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液稀釋10倍得到的；2)利用權(quán)利要求1-7中任一所述的檢測(cè)己烯雌酚的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒檢測(cè)步驟1) 中的樣本溶液。
9.由保藏號(hào)為CGMCCNo. 3775的對(duì)己烯雌酚的單克隆雜交瘤細(xì)胞株DES分泌的己烯雌 酚單克隆抗體。
10.保藏號(hào)為CGMCCNo. 3775的對(duì)己烯雌酚的單克隆雜交瘤細(xì)胞株DES。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)己烯雌酚的方法及其專(zhuān)用化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測(cè)己烯雌酚的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，包括己烯雌酚特異性抗體、包被原和標(biāo)準(zhǔn)品溶液；所述包被原為己烯雌酚半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)式如式I所示。本發(fā)明的檢測(cè)方法，具有樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉、特異性高、靈敏度高、精確度高等特點(diǎn)，能夠現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控且適合大量樣本的篩查。
文檔編號(hào)C12N5/20GK101936985SQ20101024428
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月3日
發(fā)明者史為民, 吳聰明, 張素霞, 曹興元, 湯樹(shù)生, 沈建忠, 王戰(zhàn)輝, 程林麗 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)