專利名稱：一種產(chǎn)甲烷菌劑及其制備技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)用微生物菌劑及其制備技術(shù)。本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。此法 可有效地提高沼氣原料中有機質(zhì)材料的轉(zhuǎn)化利用率，加快沼氣產(chǎn)生，增加沼氣產(chǎn)生量，而且 使用安全、環(huán)保。具有良好的生態(tài)效益和可觀的社會效益。該技術(shù)可應(yīng)用于家庭小型沼氣 池和大型工廠化沼氣設(shè)施使用。
背景技術(shù)：
沼氣是由意大利A.沃爾塔于1776年在沼澤地發(fā)現(xiàn)的。1916年俄國B. Π.奧梅 良斯基分離出了第一株甲烷菌(但不是純種)。中國于1980年首次分離甲烷八疊球菌成 功。目前世界上已分離出的甲烷菌種20多株。世界上第一個沼氣發(fā)生器是由法國L.穆拉于1860年將簡易沉淀池改進而成的。 1925年在德國、1926年在美國分別建造了備有加熱設(shè)施及集氣裝置的消化池，這是現(xiàn)代 大、中型沼氣發(fā)生裝置的原型。第二次世界大戰(zhàn)后，沼氣發(fā)酵技術(shù)曾在西歐一些國家得到發(fā) 展，但由于廉價的石油大量涌入市場而受到影響。后隨著世界性能源危機的出現(xiàn)，沼氣又重 新引起人們重視。1955年新的沼氣發(fā)酵工藝流程——高速率厭氧消化工藝產(chǎn)生。它突破了 傳統(tǒng)的工藝流程，使單位池容積產(chǎn)氣量(即產(chǎn)氣率)在中溫下由每天Im3容積產(chǎn)生0.7 1.5m3沼氣，提高到4 Sm3沼氣，滯留時間由15天或更長的時間縮短到幾天甚至幾個小時。中國于20世紀20年代初期由羅國瑞在廣東省潮梅地區(qū)建成了第一個沼氣池，隨 之成立了中華國瑞瓦斯總行，以推廣沼氣技術(shù)。當前，隨著新農(nóng)村建設(shè)的大力推進，以及養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，沼氣事業(yè)發(fā)展出現(xiàn)空 前可喜的局面，各種規(guī)格(大、中、小型)沼氣設(shè)施均有了較大的改進，特別是太陽能的應(yīng) 用，讓一年四季產(chǎn)沼氣成為可能。但是由于各地氣候、作物秸稈、畜禽糞便等的原料不同，配 料差異很大，加上用戶操作技術(shù)上的差異，出現(xiàn)產(chǎn)沼氣不穩(wěn)定，春夏秋三季產(chǎn)氣不均衡，北 方冬季嚴寒季節(jié)不產(chǎn)氣等現(xiàn)象，在一定程度上制約了沼氣的發(fā)展。通過人為添加產(chǎn)甲烷菌 劑，以提高并穩(wěn)定甲烷產(chǎn)生量，業(yè)已成為新建沼氣池和大型沼氣設(shè)施的重要措施之一。本發(fā)明利用高、中、低溫型產(chǎn)甲烷菌和高、低溫型纖維素分解菌的合理配合，促進 了有機質(zhì)的轉(zhuǎn)化，加快了沼氣產(chǎn)生量，保證了一年四季穩(wěn)定產(chǎn)沼氣，提高了沼氣生產(chǎn)效率。 處理后的物料不產(chǎn)生二次污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)甲烷菌劑及其制備技術(shù)。采用本技術(shù)可最大程度發(fā) 揮微生物及其代謝產(chǎn)物的作用，加速有機質(zhì)材料的物質(zhì)轉(zhuǎn)化，提高甲烷產(chǎn)生量，使用安全方 便，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可靠。本方法可推廣應(yīng)用于各種類型的沼氣設(shè)施。本發(fā)明涉及農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品及其制備技術(shù)。以6種微生物為功能菌，按質(zhì)量 配比，其組成合理，相互間無明顯的拮抗作用，微生物代謝產(chǎn)物數(shù)量多，效果好。其生產(chǎn)工藝 過程如下
以細菌為功能微生物，通過微生物斜面菌種一分別活化一一級擴大一二級擴大一 吸附一配制一檢測一液體包裝一產(chǎn)甲烷菌劑。生產(chǎn)過程關(guān)鍵控制點包括以下幾個方面(1)微生物的選擇本發(fā)明的核心是微生物的選擇。本發(fā)明共有6株微生物，分別 是熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum Viljoen et al.)、拜氏梭菌(Clostridiumbei jerinckii Donkeremend. Keis et al.)、詹氏產(chǎn)甲燒石狀菌〔Methanocaldococcusjannasc hii (Jones et al. )ffhitman) Ep^Bf ^ff (Methanothermobacterwolfeii (Winter et al. )ffasserfallen et al.〕、口耆&甲；^乂Vfti求胃(Methanosarcinathermophila Zinder et al.)和巴氏甲燒八疊球菌(Methanosarcina barkeri Schnellen)。均經(jīng)過中國農(nóng)業(yè)微 生物菌種保藏管理中心(ACCC)鑒定并保藏。(2)活化在無菌條件下，用浸過75%酒精的脫脂棉擦凈安醅管，用火焰加熱其頂 端，滴少量無菌水至加熱頂端使其破裂，用鑷子敲下已經(jīng)破裂的安醅管頂端。用無菌吸管吸 取0. 3 0. 5ml適宜的液體培養(yǎng)基，滴入安醅管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀。吸 取全部菌體懸浮液，分別移植于2支斜面培養(yǎng)基試管中，熱纖維梭菌的培養(yǎng)溫度為60°C ；拜 氏梭菌的培養(yǎng)溫度為35°C;詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌的培養(yǎng)溫度為80 85°C;沃氏甲烷嗜熱桿菌 的培養(yǎng)溫度為65°C ；嗜熱甲烷八疊球菌的培養(yǎng)溫度為50°C ；巴氏甲烷八疊球菌的培養(yǎng)溫度 為30°C，使之具有良好的生長繁殖能力。(3) 一級擴大對于熱纖維梭菌，選用CM-M4培養(yǎng)基=KH2PO4 0. 50g, K2HPO4 · 3H20 1. 00g，尿素 2. Og, MgCl2 · 6H20 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 05g, FeSO4 · 7H20 1. 25g,嗎啉代丙燒 磺酸 10. OOg,刃天青 1. OOg,酵母膏 6. OOg,葡糖糖 5. OOg, cyeteine-HCl -H2O 1. OOg,蒸餾水 1. 0L，pH7. 2，于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌20min。在無菌條件下接種經(jīng)篩選鑒定的熱纖維 梭菌母種，放置在恒溫箱中，保持溫度60°C，厭氧培養(yǎng)72h。對于拜氏梭菌，選用CM-M8培養(yǎng) 基鮮馬鈴薯片200. Og，葡糖糖6. Og，碳酸鈣3. Og，刃天青1. Og, cyeteine-HCl -H2O 0. 5g， 蒸餾水1. OL0在無菌條件下接種拜氏梭菌母種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度35°C，厭氧培養(yǎng) 72h。對于詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基=Fe (NH4)2(SO4)2 ·7Η20 2. OOgjMgCl2 ·6Η20 4. OOg, NaHCO3 5. OOg, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H200. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. Og,微量元素溶液 10. 0ml (微 量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g，AlK (SO4)2O. 01g，ZnCl2 0. lg，NaCl 1. OgjNa2MoO4 0. OlgjH3BO3 0. 01g，蒸餾水 1. 0L)， 維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛 酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯 磺酸5. 0g，蒸餾水1.0L)，蒸餾水1.(^，于1.051^/0112，121.31下滅菌301^11。取出后放成 斜面，無菌條件下接種詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌母種，放置在恒溫箱中，保持溫度80 85°C，培養(yǎng) 72h。對于沃氏甲烷嗜熱桿菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4)2 (SO4) 2 ·7Η20 2. OOgjMgCl2 ·6Η20 4. 00g, NaHC035. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H200. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. Og,微量元素溶液 10. 0ml (微 量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, Mn Cl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20
0.12g, AlK(SO4)2 O.Olg，ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 O.Olg，蒸溜水
1.0L)，維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. Og,
4D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨 基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌 條件下接種沃氏甲烷嗜熱桿菌母種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度65°C，培養(yǎng)72h。對于嗜熱 甲烷八疊球菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4) 2 (SO4) 2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g，NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方 N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, Mn Cl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2
0.01g，ZnCl20. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4O. Olg, H3BO3 0. 01g，蒸餾水 1. 0L)，維生素溶液 10. 0ml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Ogjt 辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸 餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L，于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種嗜熱甲 烷八疊球菌母種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度50°C，培養(yǎng)72h。對于巴氏甲烷八疊球菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4)2 (SO4)2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g，刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2OO. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g，NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g， FeCl2 ·4Η20 0. 4g，MnCl2 ·4Η20 0. lg，CoCl2 · 6Η200· 12g，AlK (SO4) 2 0. OlgjZnCl2 0.1g，NaCl
1.0g, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 0. Olg,蒸餾水1. 0L)，維生素溶液10. Oml (維生素溶液配方生 物素2. 0g，鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. 0g，硫辛酸5. Og,葉酸2. 0g，核黃 酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于 1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種巴氏甲烷八疊球菌母種，放置在恒溫 箱中，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)72h。 (4) 二級擴大對于熱纖維梭菌，選用CM-M4培養(yǎng)基=KH2PO4 0. 50g, K2HPO4 · 3H20 1. 00g，尿素 2. 0g, MgCl2 · 6H20 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 05g, FeSO4 · 7H20 1. 25g,嗎啉代丙 烷磺酸 10. 00g，刃天青 1. OOg,酵母膏 6. 00g,葡糖糖 5. 00g, cyeteine-HCl · H2O 1. 00g， 蒸餾水1. 0L, ρΗ7· 2，于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌20min。在無菌條件下接種經(jīng)篩選鑒 定的熱纖維梭菌一級菌種，放置在恒溫箱中，保持溫度60°C，厭氧培養(yǎng)4天。對于拜氏 梭菌，選用CM-M8培養(yǎng)基鮮馬鈴薯片200. Og,葡糖糖6. Og,碳酸鈣3. 0g，刃天青1. Og, cyeteine-HCl · H2O 0. 5g，蒸餾水1. 0L。在無菌條件下接種拜氏梭菌一級菌種，放置在恒 溫箱中，接種培養(yǎng)溫度35°C，厭氧培養(yǎng)4天。對于詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌，選用CM-M2培養(yǎng)基 Fe (NH4)2 (SO4)2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6Η204· 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H200. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2O. Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4 O.Olg, H3BO3 0. 01g，蒸餾水1. 0L)，維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物 素2. 0g，鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. 0g，硫辛酸5. Og,葉酸2. 0g，核黃酸 5. 0g，尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于 1.051^/(^2，121.31下滅菌301^11。取出后放成斜面，無菌條件下接種詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌 一級菌種，放置在恒溫箱中，保持溫度80 85°C，培養(yǎng)4天。對于沃氏甲烷嗜熱桿菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4)2 (SO4)2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20
53. 45g，刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2Η200· 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4O. 14g，NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. Oml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g， FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2O. Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 0. Olg,蒸餾水 1. OL)，維生素溶液 10. Oml (維生素溶液配 方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. Og,硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核 黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L, 于1.05kg/cm2，121.3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種沃氏甲烷嗜熱桿菌一級菌種， 放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度65°C，培養(yǎng)4天。對于嗜熱甲烷八疊球菌，選用CM-M2培養(yǎng)基， Fe (NH4)2 (SO4)2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7Η203· 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2 0. Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 0. 01g，蒸餾水1. 0L)，維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物 素2. Og,鹽酸吡哆醇1. Og,硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃 酸5. 0g，尼克酸5. Og,維生素B12O. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L, 于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種嗜熱甲烷八疊球菌一級菌種， 放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度50°C，培養(yǎng)4天。對于巴氏甲烷八疊球菌，選用CM-M2培養(yǎng)基， Fe (NH4) 2 (SO4) 2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)34. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2 0. Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4O. Olg, H3BO3 0. Olg,蒸餾水1. 0L)，維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物素 2. Og,鹽酸吡哆醇1. Og,硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og, 尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于1. 05kg/ cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種巴氏甲烷八疊球菌一級菌種，放置在恒溫箱 中，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)4天。(5)吸附熱纖維梭菌、拜氏梭菌、詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌、沃氏甲烷嗜熱桿菌、嗜熱甲 烷八疊球菌和巴氏甲烷八疊球菌各微生物載體均為經(jīng)粉碎過40 80目篩并經(jīng)高溫滅菌后 的膨潤土，吸附量為膨潤土干重的20% 40%。在該產(chǎn)甲烷菌劑吸附載體中添加經(jīng)過高溫 滅菌并過40 80目篩的硫酸鋅、鈣鎂磷肥、硫酸錳和磷酸二氫鉀，混合比例1 5 1 2， 添加量占膨潤土干重的3% 6%。(6)配制微生物菌種按照，熱纖維梭菌拜氏梭菌詹氏產(chǎn)甲烷石狀 菌沃氏甲烷嗜熱桿菌嗜熱甲烷八疊球菌巴氏甲烷八疊球菌為1 2 1 3:1:1:1: 1 4的比例進行配制。(7)檢測有效活菌數(shù)采用平板計數(shù)法測定。(8)計量包裝采用電子或磅秤計量，誤差500士0.05g，1000士0. lg。采用不透明 塑料(或玻璃)瓶包裝。與國內(nèi)外現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點是(1)該微生物菌種由6株不同的菌株組成，其作用效果顯著，相互間無明顯的拮抗作用，有機物料轉(zhuǎn)化快，產(chǎn)沼氣溫度適應(yīng)范圍廣，產(chǎn)氣量大且穩(wěn)定。(2)該發(fā)明對各種沼氣設(shè)施均有良好的效果，尤其是新建沼氣十分有效。
具體實施例方式例一一種產(chǎn)甲烷菌劑及其制備方法，該產(chǎn)甲烷菌劑配制的質(zhì)量比熱纖維梭菌拜氏梭 菌詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌沃氏甲烷嗜熱桿菌嗜熱甲烷八疊球菌巴氏甲烷八疊球菌為 2:3:1:1:1:4。所述的產(chǎn)甲烷菌劑有6種微生物組成，分別屬于6株微生物，分別是熱纖維梭菌 (Clostridium thermocellum Viljoen et al.)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii Donkeremend. Keis et al.)、詹氏產(chǎn)甲燒石狀菌〔Methanocaldococcus jannaschii (Jones et al. (Methanothermobacter wolfeii (Winter et al.) Wasserfallen et al·〕、口耆& 甲；^乂Vfti求胃(Methanosarcina thermophila Zinder et al.)和巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkeri Schnellen)。其保藏編號分別是 熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum Viljoen et al.)保存于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保 藏管理中心，其編號為 ACCC00026 ；拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii Donkeremend. Keis et al.)保存于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其編號為ACCC00028;詹氏產(chǎn)甲
(Methanocaldococcus jannaschii (Jones et al.) Whitman) f^ # Τ" Φ H ^fe ^lk 微生物菌種保藏管理中心，其編號為ACCC00011 ；沃氏甲烷嗜熱桿菌〔Methanothermobact erwolfeii (Winter et al. ) Wasserfallen et al.〕保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理 中心，其編號為 ACCC0007 ；嗜熱甲燒八疊球菌(Methanosarcina thermophila Zinder et al.)保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其編號為ACCC00022 ；巴氏甲烷八疊球菌 (Methanosarcina barkeri Schnellen)保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其編號 為 ACCC00017。所述的產(chǎn)甲烷菌劑，其有效活菌總數(shù)> 10億個/g。所述的一種產(chǎn)甲烷菌劑的制備方法，具體步驟是(1)微生物的選擇本發(fā)明的核心是微生物的選擇。本發(fā)明共有6株微 生物，分別是熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum Viljoen et al.)、拜氏梭 菌(Clostridiumbeijerinckii Donkeremend. Keis et al.)、詹氏產(chǎn)甲燒石狀菌〔Me thanocaldococcus jannaschii (Jones et al. ) Whitman) > ^夭氏甲；^ 口譽 & If 胃(Methan othermobacterwolfeii(Winter et al. )Wasserfallen et al.〕、嗜熱甲烷八疊球菌 (Methanosarcinathermophila Zinder et 已 1·)禾口 EL 氏甲；^yiVfti求lif (Methanosarcina barkeri Schnellen) 0均經(jīng)過中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)鑒定并保藏。(2)活化在無菌條件下，用浸過75%酒精的脫脂棉擦凈安醅管，用火焰加熱其頂 端，滴少量無菌水至加熱頂端使其破裂，用鑷子敲下已經(jīng)破裂的安醅管頂端。用無菌吸管吸 取0. 3 0. 5ml適宜的液體培養(yǎng)基，滴入安醅管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀。吸 取全部菌體懸浮液，分別移植于2支斜面培養(yǎng)基試管中，熱纖維梭菌的培養(yǎng)溫度為60°C ；拜 氏梭菌的培養(yǎng)溫度為35°C;詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌的培養(yǎng)溫度為80 85°C;沃氏甲烷嗜熱桿菌 的培養(yǎng)溫度為65°C ；嗜熱甲烷八疊球菌的培養(yǎng)溫度為50°C ；巴氏甲烷八疊球菌的培養(yǎng)溫度為30°C，使之具有良好的生長繁殖能力。 (3) 一級擴大對于熱纖維梭菌，選用CM-M4培養(yǎng)基=KH2PO4 0. 50g, K2HPO4 · 3H20 1. 00g，尿素 2. 0g, MgCl2 · 6H20 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 05g, FeSO4 · 7H20 1. 25g,嗎啉代丙燒 磺酸 10. OOg,刃天青 1. OOg,酵母膏 6. 00g,葡糖糖 5. 00g, cyeteine-HCl -H2O 1. 00g,蒸餾水 1. 0L，pH7. 2，于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌20min。在無菌條件下接種經(jīng)篩選鑒定的熱纖維 梭菌母種，放置在恒溫箱中，保持溫度60°C，厭氧培養(yǎng)72h。對于拜氏梭菌，選用CM-M8培養(yǎng) 基鮮馬鈴薯片200. 0g，葡糖糖6. 0g，碳酸鈣3. 0g，刃天青1. 0g, cyeteine-HCl -H2O 0. 5g， 蒸餾水1. OL0在無菌條件下接種拜氏梭菌母種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度35°C，厭氧培養(yǎng) 72h。對于詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基=Fe (NH4)2(SO4)2 ·7Η20 2. OOgjMgCl2 ·6Η20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H200. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. Og,微量元素溶液 10. 0ml (微 量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g，AlK (SO4)2O. 01g，ZnCl2 0. lg，NaCl 1. OgjNa2MoO4 0. OlgjH3BO3 0. 01g，蒸餾水 1. 0L)， 維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛 酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12O. Ig,對氨基苯磺 酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于1. 05kg/cm2，121. 3°C下滅菌30min。取出后放成斜 面，無菌條件下接種詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌母種，放置在恒溫箱中，保持溫度80 85°C，培養(yǎng) 72h。對于沃氏甲烷嗜熱桿菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4)2 (SO4) 2 ·7Η20 2. OOgjMgCl2 ·6Η20
4.00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H200. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. Og,微量元素溶液 10. 0ml (微 量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20
0.12g, AlK(SO4)2 O.Olg，ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 O.Olg，蒸溜水
1.0L)，維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. Og, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨 基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌 條件下接種沃氏甲烷嗜熱桿菌母種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度65°C，培養(yǎng)72h。對于嗜熱 甲烷八疊球菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4) 2 (SO4) 2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3
5.00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g，NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方 N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2 O.Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4O. Olg, H3BO3 0. 01g，蒸餾水 1. 0L)，維生素溶液 10. 0ml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Ogjt 辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸 餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L，于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種嗜熱甲 烷八疊球菌母種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度50°C，培養(yǎng)72h。對于巴氏甲烷八疊球菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4)2 (SO4)2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g，刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2OO. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g，NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g， FeCl2 ·4Η20 0. 4g，MnCl2 ·4Η20 0. lg，CoCl2 · 6Η200· 12g，AlK (SO4) 2 0· 01g，ZnCl2 0.1g，NaCl
81. 0g, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 0. Olg,蒸餾水1. 0L)，維生素溶液10. Oml (維生素溶液配方生 物素2. 0g，鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. 0g，硫辛酸5. Og,葉酸2. 0g，核黃 酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于 1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種巴氏甲烷八疊球菌母種，放置在恒溫 箱中，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)72h。(4) 二級擴大對于熱纖維梭菌，選用CM-M4培養(yǎng)基=KH2PO4 0. 50g, K2HPO4 · 3H20 1. 00g，尿素 2. 0g, MgCl2 · 6H20 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 05g, FeSO4 · 7H20 1. 25g,嗎啉代丙燒 磺酸 10. OOg,刃天青 1. 00g,酵母膏 6. 00g,葡糖糖 5. 00g, cyeteine-HCl · H2O 1. 00g,蒸餾 水1. 0L, ρΗ7· 2，于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌20min。在無菌條件下接種經(jīng)篩選鑒定的熱
纖維梭菌一級菌種，放置在恒溫箱中，保持溫度60°C，厭氧培養(yǎng)4天。對于拜氏梭菌，選用CM-M8培養(yǎng)基鮮馬 鈴薯片200. Og,葡糖糖6. Og,碳酸鈣3. Og,刃天青1. 0g, cyeteine-HCl · H2O 0. 5g，蒸餾水 1. 0L。在無菌條件下接種拜氏梭菌一級菌種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度35°C，厭氧培養(yǎng)4 天。對于詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌，選用CM-M2培養(yǎng)基=Fe (NH4)2(SO4)2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20
4.00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H200. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. Og,微量元素溶液 10. 0ml (微 量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20
0.12g, AlK(SO4)2O. Olg, ZnCl2 20. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 0. Olg,蒸餾水
1.0L)，維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. Og, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨 基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。取出后 放成斜面，無菌條件下接種詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌一級菌種，放置在恒溫箱中，保持溫度80 85°C，培養(yǎng)4天。對于沃氏甲烷嗜熱桿菌，選用CM-M2培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4)2 (SO4)2 ·7Η20 2. 00g, MgCl2 · 6Η20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H200. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. Og,微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g，MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 ·6Η20 0. 12g, AlK (SO4)2O. Olg, ZnCl2O. IgjNaCl 1. OgjNa2MoO4 0. OlgjH3BO3 O.Olg，蒸 餾水1. 0L)，維生素溶液10. Oml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. Og,硫胺素
5.0g, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig, 對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無 菌條件下接種沃氏甲烷嗜熱桿菌一級菌種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度65 °C，培養(yǎng)4天。對 于嗜熱甲烷八疊球菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4) 2 (SO4) 2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7Η203· 45g，刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g，Na2S · 9H20 0. 50g，K2HPO4 0. 14g，NaCl 18. Og,微量元素溶液 10. 0ml (微量元素 溶液配方N(CH2COOH) 3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2 0. Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 0. 01g，蒸餾水 1. 0L)，維 生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛酸 鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺 酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于1. 05kg/cm2，121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下
9接種嗜熱甲烷八疊球菌一級菌種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度50°C，培養(yǎng)4天。對于巴氏甲 燒八疊球菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4) 2 (SO4) 2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g，NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方 N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2 O.Olg，ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4O. Olg, H3BO3 0. 01g，蒸餾水 1. 0L)，維生素溶液 10. 0ml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Ogjt 辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾 水1.0L)，蒸餾水1.(^，于1.051^/0112，121.31下滅菌301^11。在無菌條件下接種巴氏甲烷 八疊球菌一級菌種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)4天。(5)吸附熱纖維梭菌、拜氏梭菌、詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌、沃氏甲烷嗜熱桿菌、嗜熱 甲烷八疊球菌、馬氏甲烷八疊球菌和巴氏甲烷八疊球菌各微生物載體均為經(jīng)粉碎過60目 篩并經(jīng)高溫滅菌后的膨潤土，吸附量為膨潤土干重的40%。在該產(chǎn)甲烷菌劑吸附載體 中添加經(jīng)過高溫滅菌并過60目篩的硫酸鋅、鈣鎂磷肥、硫酸錳和磷酸二氫鉀，混合比例 1:5:1: 2，添加量占膨潤土干重的5%。(6)配制微生物菌種按照，熱纖維梭菌拜氏梭菌詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌 沃氏甲烷嗜熱桿菌嗜熱甲烷八疊球菌馬氏甲烷八疊球菌巴氏甲烷八疊球菌為 2:3:1:1:1: 4的比例進行配制。(7)檢測有效活菌數(shù)采用平板計數(shù)法測定。(8)計量包裝采用電子或磅秤計量，誤差500士0.05g，1000士0. lg。采用不透明 塑料(或玻璃)瓶包裝。為了驗證產(chǎn)甲烷菌劑的效果，我們按照不同的添加量進行沼氣產(chǎn)生量測定，檢測 結(jié)果見表1。表1沼氣成分檢測結(jié)果 例二熱纖維梭菌拜氏梭菌詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌沃氏甲烷嗜熱桿菌嗜熱甲烷八 疊球菌巴氏甲烷八疊球菌為1:1:1:1:1:1:1。所述的產(chǎn)甲烷菌劑有6種微生物組成，分別屬于6株微生物，分別是熱纖維梭菌 (Clostridium thermocellum Viljoen et al.)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii Donkeremend. Keis et al.)、詹氏產(chǎn)甲焼石狀菌〔Methanocaldococcus jannaschii (Joneset al.(Methanothermobacter wolfeii (Winter et al.)
Wasserfallen etal.〕、口耆&甲；^乂Vfti求胃(Methanosarcina thermophila Zinder etal.) 和巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkeri Schnellen)。其保藏編號分別是熱纖 維梭菌(Clostridium thermocellum Viljoen et al.)保存于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏 管理中心，其編號為 ACCC00026 ；拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii Donkeremend. Keis etal.)保存于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其編號為ACCC00028 ；詹氏產(chǎn)甲 (Methanocaldococcus jannaschii (Jones et al.) Whitman) f^ # Τ" Φ H ^fe ^lk 微生物菌種保藏管理中心，其編號為ACCC00011 ；沃氏甲烷嗜熱桿菌〔Methanothermobac terwolfeii (Winter et al. ) Wasserfallen et al.〕保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管 理中心，其編號為ACCC0007 ；嗜熱甲燒八疊球菌(Methanosarcina thermophila Zinder etal.)保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其編號為ACCC00022 ；巴氏甲烷八疊球 菌(Methanosarcina barkeri Schnellen)保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其編 號為 ACCC00017。所述的產(chǎn)甲烷菌劑，其有效活菌總數(shù)> 10億個/g。所述的一種產(chǎn)甲烷菌劑的制備方法，具體步驟是(1)微生物的選擇本發(fā)明的核心是微生物的選擇。本發(fā)明共有6株微生 物，分別是熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum Viljoen et al.)、拜氏梭 菌(Clostridiumbeijerinckii Donkeremend. Keis et al.)、詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌〔 Methanocaldococcus jannaschii(Jones et al. )Whitman)> ^夭氏甲；^ 口譽 & If 胃〔 Methanothermobacter wolfeii (Winter et al. ) Wasserfallen et al·〕、嗜熱甲燒八疊球 胃(Methanosarcinathermophila Zinder et al.)禾口 EL氏甲;^7Vfti求lif (Methanosarcina barkeri Schnellen) 0均經(jīng)過中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)鑒定并保藏。(2)活化在無菌條件下，用浸過75%酒精的脫脂棉擦凈安醅管，用火焰加熱其 頂端，滴少量無菌水至加熱頂端使其破裂，用鑷子敲下已經(jīng)破裂的安醅管頂端。用無菌吸管 吸取0. 3 0. 5ml適宜的液體培養(yǎng)基，滴入安醅管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀。 吸取全部菌體懸浮液，分別移植于2支斜面培養(yǎng)基試管中，熱纖維梭菌的培養(yǎng)溫度為60°C ； 拜氏梭菌的培養(yǎng)溫度為35°C;詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌的培養(yǎng)溫度為80 85°C;沃氏甲烷嗜熱桿 菌的培養(yǎng)溫度為65°C ；嗜熱甲烷八疊球菌的培養(yǎng)溫度為50°C ；巴氏甲烷八疊球菌的培養(yǎng)溫 度為30°C，使之具有良好的生長繁殖能力。(3) 一級擴大對于熱纖維梭菌，選用CM-M4培養(yǎng)基=KH2PO4 0. 50g, K2HPO4 · 3H20 1. 00g，尿素 2. Og, MgCl2 · 6H20 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 05g, FeSO4 · 7H20 1. 25g,嗎啉代丙燒 磺酸 10. OOg,刃天青 1. OOg,酵母膏 6. OOg,葡糖糖 5. OOg, cyeteine-HCl -H2O 1. OOg,蒸餾水 1. 0L，pH7. 2，于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌20min。在無菌條件下接種經(jīng)篩選鑒定的熱纖維 梭菌母種，放置在恒溫箱中，保持溫度60°C，厭氧培養(yǎng)72h。對于拜氏梭菌，選用CM-M8培養(yǎng) 基鮮馬鈴薯片200. Og，葡糖糖6. Og，碳酸鈣3. Og，刃天青1. Og, cyeteine-HCl -H2O 0. 5g， 蒸餾水1. OL0在無菌條件下接種拜氏梭菌母種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度35°C，厭氧培養(yǎng) 72h。對于詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基=Fe (NH4)2(SO4)2 ·7Η20 2. OOgjMgCl2 ·6Η20 4. OOg, NaHCO3 5. OOg, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H200. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. Og,微量元素溶液 10. Oml (微
11量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g，AlK (SO4)2O. Olg，ZnCl2 0. lg，NaCl 1. OgjNa2MoO4 0. OlgjH3BO3 0. Olg，蒸餾水 1. OL)， 維生素溶液10. Oml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛 酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯 磺酸5. 0g，蒸餾水1.0L)，蒸餾水1.(^，于1.051^/0112，121.31下滅菌301^11。取出后放成 斜面，無菌條件下接種詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌母種，放置在恒溫箱中，保持溫度80 85°C，培養(yǎng) 72h。對于沃氏甲烷嗜熱桿菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4)2 (SO4) 2 ·7Η20 2. OOgjMgCl2 ·6Η20
4.00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H200. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. Og,微量元素溶液 10. 0ml (微 量元素溶液配方N(CH2COOH)34. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, Mn Cl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20
0.12g, AlK(SO4)2 0. Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 O.Olg，蒸溜水
1.0L)，維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. Og, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨 基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌 條件下接種沃氏甲烷嗜熱桿菌母種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度65°C，培養(yǎng)72h。對于嗜熱 甲烷八疊球菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4) 2 (SO4) 2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3
5.00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g，NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方 N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, Mn Cl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2
0.01g,ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4O. Olg, H3BO3 0. 01g，蒸餾水 1. 0L)，維生素溶液 10. 0ml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Ogjt 辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸 餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L，于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種嗜熱甲 烷八疊球菌母種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度50°C，培養(yǎng)72h。對于巴氏甲烷八疊球菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4)2 (SO4)2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g，刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2OO. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g，NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g， FeCl2 ·4Η20 0. 4g，MnCl2 ·4Η20 0. lg，CoCl2 · 6Η200· 12g，AlK (SO4) 2 0· 01g，ZnCl2 0.1g，NaCl
1.0g, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 0. Olg,蒸餾水1. 0L)，維生素溶液10. Oml (維生素溶液配方生 物素2. 0g，鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. 0g，硫辛酸5. Og,葉酸2. 0g，核黃 酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于 1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種巴氏甲烷八疊球菌母種，放置在恒溫 箱中，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)72h。 (4) 二級擴大對于熱纖維梭菌，選用CM-M4培養(yǎng)基=KH2PO4 0. 50g, K2HPO4 · 3H20 1. 00g，尿素 2. 0g, MgCl2 · 6H20 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 05g, FeSO4 · 7H20 1. 25g,嗎啉代丙 烷磺酸 10. 00g，刃天青 1. OOg,酵母膏 6. 00g,葡糖糖 5. 00g, cyeteine-HCl · H2O 1. 00g， 蒸餾水1. 0L, ρΗ7· 2，于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌20min。在無菌條件下接種經(jīng)篩選鑒 定的熱纖維梭菌一級菌種，放置在恒溫箱中，保持溫度60°C，厭氧培養(yǎng)4天。對于拜氏 梭菌，選用CM-M8培養(yǎng)基鮮馬鈴薯片200. Og,葡糖糖6. Og,碳酸鈣3. 0g，刃天青1. Og,cyeteine-HCl · H2O 0. 5g，蒸餾水1. 0L。在無菌條件下接種拜氏梭菌一級菌種，放置在 恒溫箱中，培養(yǎng)溫度35 °C，厭氧培養(yǎng)4天。對于詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌，選用CM-M2培養(yǎng)基 Fe (NH4)2 (SO4)2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6Η204· 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H200. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2O. Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 0. 01g，蒸餾水1. 0L)，維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物 素2. Og,鹽酸吡哆醇1. Og,硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃 酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12O. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于 1.05kg/cm2，121.3°C下滅菌30min。取出后放成斜面，無菌條件下接種詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌 一級菌種，放置在恒溫箱中，保持溫度80 85°C，培養(yǎng)4天。對于沃氏甲烷嗜熱桿菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4)2 (SO4)2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g，刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H200. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g，NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g， FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2O. Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 0. Olg,蒸餾水 1. 0L)，維生素溶液 10. 0ml (維生素溶液配 方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. Og,硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核 黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L, 于1.05kg/cm2，121.3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種沃氏甲烷嗜熱桿菌一級菌種， 放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度65°C，培養(yǎng)4天。對于嗜熱甲烷八疊球菌，選用CM-M2培養(yǎng)基， Fe (NH4)2 (SO4)2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7Η203· 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2 0. Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4O. Olg, H3BO3 O.Olg，蒸餾水1. 0L)，維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物 素2. Og,鹽酸吡哆醇1. Og,硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃 酸5. 0g，尼克酸5. Og,維生素B12O. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L, 于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種嗜熱甲烷八疊球菌一級菌種， 放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度50°C，培養(yǎng)4天。對于巴氏甲烷八疊球菌，選用CM-M2培養(yǎng)基， Fe (NH4) 2 (SO4) 2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2 0. Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4O. Olg, H3BO3 0. Olg,蒸餾水1. 0L)，維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物素 2. Og,鹽酸吡哆醇1. Og,硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og, 尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于1. 05kg/ cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種巴氏甲烷八疊球菌一級菌種，放置在恒溫箱 中，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)4天。 (5)吸附熱纖維梭菌、拜氏梭菌、詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌、沃氏甲烷嗜熱桿菌、嗜熱甲
13烷八疊球菌和巴氏甲烷八疊球菌各微生物載體均為經(jīng)粉碎過40目篩并經(jīng)高溫滅菌后的膨 潤土，吸附量為膨潤土干重的30%。在該產(chǎn)甲烷菌劑吸附載體中添加經(jīng)過高溫滅菌并過40 目篩的硫酸鋅、鈣鎂磷肥、硫酸錳和磷酸二氫鉀，混合比例1 5 1 2，添加量占膨潤土 干重的5%。(6)配制微生物菌種按照，熱纖維梭菌拜氏梭菌詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌沃氏 甲烷嗜熱桿菌嗜熱甲烷八疊球菌巴氏甲烷八疊球菌為111111的比例 進行配制。(7)檢測有效活菌數(shù)采用平板計數(shù)法測定。(8)計量包裝采用電子或磅秤計量，誤差500士0.05g，1000士0. Igo采用不透明 塑料(或玻璃)瓶包裝。為了驗證產(chǎn)甲烷菌劑的效果，我們按照不同的添加量進行沼氣產(chǎn)生量測定，檢測 結(jié)果見表2。表2沼氣成分檢測結(jié)果 例三熱纖維梭菌拜氏梭菌詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌沃氏甲烷嗜熱桿菌嗜熱甲烷八 疊球菌巴氏甲烷八疊球菌為2 2 1 1 1 2。所述的產(chǎn)甲烷菌劑有6種微生物組成，分別屬于6株微生物，分別是熱纖維梭菌 (Clostridium thermocellum Viljoen et al.)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii Donkeremend. Keis et al.)、詹氏產(chǎn)甲燒石狀菌〔Methanocaldococcus jannaschii (Jones et al. (Methanothermobacter wolfeii (Winter et al.) Wasserfallen et al·〕、口耆& 甲；^乂Vfti求胃(Methanosarcina thermophila Zinder et al.)和巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkeri Schnellen)。其保藏編號分別是 熱纖維梭菌(Clostridium thermoceilum Viljoen et al.)保存于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保 藏管理中心，其編號為 ACCC00026 ；拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii Donkeremend. Keis et al.)保存于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其編號為ACCC00028;詹氏產(chǎn)甲 ' Ζ ^ΧΜ (Methanocaldococcusjannaschii (Jones et al. ) Whitman) 巾 BUM 生物菌種保藏管理中心，其編號為ACCC00011 ；沃氏甲烷嗜熱桿菌〔Methanothermobacter wolfeii (ffinteret al. ) Wasserfallen et al.〕保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中 心，其編號為 ACCC0007 ；嗜熱甲燒八疊球菌(Methanosarcina thermophila Zinder et al.)保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其編號為ACCC00022 ；巴氏甲烷八疊球菌
14(Methanosarcina barkeriSchnellen)保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其編號 為 ACCC00017。所述的產(chǎn)甲烷菌劑，其有效活菌總數(shù)> 10億個/g。所述的一種產(chǎn)甲烷菌劑的制備方法，具體步驟是(1)微生物的選擇本發(fā)明的核心是微生物的選擇。本發(fā)明共有6株微生物，分別 是熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum Viljoen et al·)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii Donkeremend. Keis et al.)、詹氏產(chǎn)甲燒石狀菌〔Methanocaldococcus jannaschii (Jones et al. ) Whitman) > ^夭氏 ￥ !^υ BW If lif (Methanothermobacter wolfeii (Winter et al. )Wasserfallen et al.〕、嗜熱甲燒八疊球菌(Methanosarcina thermophila Zinder et al·)禾口 EL 氏甲；^乂V ft 求胃(Methanosarcina barkeri Schnellen)。均經(jīng)過中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)鑒定并保藏。(2)活化在無菌條件下，用浸過75%酒精的脫脂棉擦凈安醅管，用火焰加熱其 頂端，滴少量無菌水至加熱頂端使其破裂，用鑷子敲下已經(jīng)破裂的安醅管頂端。用無菌吸管 吸取0. 3 0. 5ml適宜的液體培養(yǎng)基，滴入安醅管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀。 吸取全部菌體懸浮液，分別移植于2支斜面培養(yǎng)基試管中，熱纖維梭菌的培養(yǎng)溫度為60°C ； 拜氏梭菌的培養(yǎng)溫度為35°C;詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌的培養(yǎng)溫度為80 85°C;沃氏甲烷嗜熱桿 菌的培養(yǎng)溫度為65°C ；嗜熱甲烷八疊球菌的培養(yǎng)溫度為50°C ；巴氏甲烷八疊球菌的培養(yǎng)溫 度為30°C，使之具有良好的生長繁殖能力。(3) 一級擴大對于熱纖維梭菌，選用CM-M4培養(yǎng)基=KH2PO4 0. 50g, K2HPO4 · 3H20 1. 00g，尿素 2. Og, MgCl2 · 6H20 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 05g, FeSO4 · 7H20 1. 25g,嗎啉代丙燒 磺酸 10. OOg,刃天青 1. 00g,酵母膏 6. 00g,葡糖糖 5. 00g, cyeteine-HCl -H2O 1. 00g,蒸餾水 1. 0L，pH7. 2，于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌20min。在無菌條件下接種經(jīng)篩選鑒定的熱纖維 梭菌母種，放置在恒溫箱中，保持溫度60°C，厭氧培養(yǎng)72h。對于拜氏梭菌，選用CM-M8培養(yǎng) 基鮮馬鈴薯片200. 0g，葡糖糖6. 0g，碳酸鈣3. 0g，刃天青1. 0g, cyeteine-HCl -H2O 0. 5g， 蒸餾水1. OL0在無菌條件下接種拜氏梭菌母種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度35°C，厭氧培養(yǎng) 72h。對于詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基=Fe (NH4)2(SO4)2 ·7Η20 2. OOgjMgCl2 ·6Η20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H200. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. Og,微量元素溶液 10. 0ml (微 量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g，AlK (SO4)2O. 01g，ZnCl2 0. lg，NaCl 1. OgjNa2MoO4 0. OlgjH3BO3 0. 01g，蒸餾水 1. 0L)， 維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛 酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯 磺酸5. 0g，蒸餾水1.0L)，蒸餾水1.(^，于1.051^/0112，121.31下滅菌301^11。取出后放成 斜面，無菌條件下接種詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌母種，放置在恒溫箱中，保持溫度80 85°C，培養(yǎng) 72h。對于沃氏甲烷嗜熱桿菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4)2 (SO4) 2 ·7Η20 2. OOgjMgCl2 ·6Η20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H200. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. Og,微量元素溶液 10. 0ml (微 量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2 O.Olg，ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 O.Olg，蒸溜水1. 0L)，維生素溶液10. Oml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. Og, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12O. Ig,對氨基 苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于1. 05kg/cm2，121. 3°C下滅菌30min。在無菌條 件下接種沃氏甲烷嗜熱桿菌母種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度65°C，培養(yǎng)72h。對于嗜熱甲 燒八疊球菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4) 2 (SO4) 2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g，NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方 N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2
0.01g，ZnCl20. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4O. Olg, H3BO3 0. 01g，蒸餾水 1. 0L)，維生素溶液 10. 0ml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Ogjt 辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸 餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L，于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種嗜熱甲 烷八疊球菌母種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度50°C，培養(yǎng)72h。對于巴氏甲烷八疊球菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4)2 (SO4)2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g，刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2OO. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g，NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g， FeCl2 ·4Η20 0. 4g，MnCl2 ·4Η20 0. lg，CoCl2 · 6Η200· 12g，AlK (SO4) 2 0. OlgjZnCl2 0.1g，NaCl
1.0g, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 0. Olg,蒸餾水1. 0L)，維生素溶液10. Oml (維生素溶液配方生 物素2. 0g，鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. 0g，硫辛酸5. Og,葉酸2. 0g，核黃 酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于 1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種巴氏甲烷八疊球菌母種，放置在恒溫 箱中，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)72h。 (4) 二級擴大對于熱纖維梭菌，選用CM-M4培養(yǎng)基=KH2PO4 0. 50g, K2HPO4 · 3H20 1. 00g，尿素 2. 0g, MgCl2 · 6H20 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 05g, FeSO4 · 7H20 1. 25g,嗎啉代丙 烷磺酸 10. 00g，刃天青 1. OOg,酵母膏 6. 00g,葡糖糖 5. 00g, cyeteine-HCl · H2O 1. 00g， 蒸餾水1. 0L, ρΗ7· 2，于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌20min。在無菌條件下接種經(jīng)篩選鑒 定的熱纖維梭菌一級菌種，放置在恒溫箱中，保持溫度60°C，厭氧培養(yǎng)4天。對于拜氏 梭菌，選用CM-M8培養(yǎng)基鮮馬鈴薯片200. Og,葡糖糖6. Og,碳酸鈣3. 0g，刃天青1. Og, cyeteine-HCl · H2O 0. 5g，蒸餾水1. 0L。在無菌條件下接種拜氏梭菌一級菌種，放置在 恒溫箱中，培養(yǎng)溫度35 °C，厭氧培養(yǎng)4天。對于詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌，選用CM-M2培養(yǎng)基 Fe (NH4)2 (SO4)2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6Η204· 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H200. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2O. Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4 O.Olg, H3BO3 0. 01g，蒸餾水1. 0L)，維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物 素2. Og,鹽酸吡哆醇1. Og,硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸 5.(^，尼克酸5.(^，維生素&2 0. lg，對氨基苯磺酸5.0g，蒸餾水1.0L)，蒸餾水1.0L，于 1.051^/(^2，121.31下滅菌301^11。取出后放成斜面，無菌條件下接種詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌 一級菌種，放置在恒溫箱中，保持溫度80 85°C，培養(yǎng)4天。對于沃氏甲烷嗜熱桿菌，選用
16CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4)2 (SO4)2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. OOg, MgSO4 · 7H20 3. 45g，刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H200. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g，NaCl 18. Og，微量元素溶液 10. Oml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g， FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2O. Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 0. Olg,蒸餾水 1. OL)，維生素溶液 10. Oml (維生素溶液配 方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. Og,硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核 黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L, 于1.05kg/cm2，121.3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種沃氏甲烷嗜熱桿菌一級菌種， 放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度65°C，培養(yǎng)4天。對于嗜熱甲烷八疊球菌，選用CM-M2培養(yǎng)基， Fe (NH4)2 (SO4)2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7Η203· 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2 0. Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 0. 01g，蒸餾水1. 0L)，維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物 素2. Og,鹽酸吡哆醇1. Og,硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃 酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L, 于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種嗜熱甲烷八疊球菌一級菌種， 放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度50°C，培養(yǎng)4天。對于巴氏甲烷八疊球菌，選用CM-M2培養(yǎng)基， Fe (NH4)2 (SO4)2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHC035. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2 0. Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4O. Olg, H3BO3 0. Olg,蒸餾水1. 0L)，維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物素 2. Og,鹽酸吡哆醇1. Og,硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og, 尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于1. 05kg/ cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種巴氏甲烷八疊球菌一級菌種，放置在恒溫箱 中，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)4天。(5)吸附熱纖維梭菌、拜氏梭菌、詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌、沃氏甲烷嗜熱桿菌、嗜熱甲 烷八疊球菌和巴氏甲烷八疊球菌各微生物載體均為經(jīng)粉碎過80目篩并經(jīng)高溫滅菌后的膨 潤土，吸附量為膨潤土干重的20%。在該產(chǎn)甲烷菌劑吸附載體中添加經(jīng)過高溫滅菌并過80 目篩的硫酸鋅、鈣鎂磷肥、硫酸錳和磷酸二氫鉀，混合比例1 5 1 2，添加量占膨潤土 干重的6%。(6)配制微生物菌種按照，熱纖維梭菌拜氏梭菌詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌沃氏 甲烷嗜熱桿菌嗜熱甲烷八疊球菌巴氏甲烷八疊球菌為221112的比例 進行配制。(7)檢測有效活菌數(shù)采用平板計數(shù)法測定。(8)計量包裝采用電子或磅秤計量，誤差500士0. 05ml，1000士0. 1ml。采用不透 明塑料(或玻璃)瓶包裝。為了驗證產(chǎn)甲烷菌劑的效果，我們按照不同的添加量進行沼氣產(chǎn)生量測定，檢測
17結(jié)果見表3。表3沼氣成分檢測結(jié)果 例四熱纖維梭菌拜氏梭菌詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌沃氏甲烷嗜熱桿菌嗜熱甲烷八 疊球菌巴氏甲烷八疊球菌為1:1:1:1:1:4。所述的產(chǎn)甲烷菌劑有6種微生物組成，分別屬于6株微生物，分別是熱纖維梭菌 (Clostridium thermocellum Viljoen et al.)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii Donkeremend. Keis et al.)、詹氏產(chǎn)甲燒石狀菌〔Methanocaldococcus jannaschii (Jones et al. )ffhitman)>i^ ft^ff ^ (Methanothermobacter wolfeii (Winter etal.) Wasserfallen et al·〕、口耆& 甲；^乂Vfti求胃(Methanosarcina thermophila Zinder et al.)和巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkeri Schnellen)。其保藏編號分別是 熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum Viljoen et al.)保存于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保 藏管理中心，其編號為 ACCC00026 ；拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii Donkeremend. Keis et al.)保存于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其編號為ACCC00028;詹氏產(chǎn)甲
(Methanocaldococcus jannaschii (Jones et al.)ffhitman) f^#Τ"Φ H^fe^lk 微生物菌種保藏管理中心，其編號為ACCC00011 ；沃氏甲烷嗜熱桿菌〔Methanothermobact erwolfeii (Winter et al. ) Wasserfallen etal.〕保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理 中心，其編號為 ACCC0007 ；嗜熱甲燒八疊球菌(Methanosarcina thermophila Zinder et al.)保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其編號為ACCC00022巴氏甲烷八疊球菌 (Methanosarcina barkeri Schnellen)保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其編號 為 ACCC00017。所述的產(chǎn)甲烷菌劑，其有效活菌總數(shù)> 10億個/g。所述的一種產(chǎn)甲烷菌劑的制備方法，具體步驟是(1)微生物的選擇本發(fā)明的核心是微生物的選擇。本發(fā)明共有7株微生物，分 別是熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum Viljoen et al·)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii Donkeremend. Keis et al.)、詹氏產(chǎn)甲燒石狀菌〔Methanocaldococcus jannaschii (Jones et al. ) Whitman) > ^夭氏 ￥ !^υ BW If lif (Methanothermobacter wolfeii (Winter et al. )Wasserfallen et al.〕、嗜熱甲燒八疊球菌(Methanosarcina thermophila Zinder et al·)禾口 EL 氏甲；^乂V ft 求胃(Methanosarcina barkeriSchnellen)。均經(jīng)過中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)鑒定并保藏。(2)活化在無菌條件下，用浸過75%酒精的脫脂棉擦凈安醅管，用火焰加熱其 頂端，滴少量無菌水至加熱頂端使其破裂，用鑷子敲下已經(jīng)破裂的安醅管頂端。用無菌吸管 吸取0. 3 0. 5ml適宜的液體培養(yǎng)基，滴入安醅管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀。 吸取全部菌體懸浮液，分別移植于2支斜面培養(yǎng)基試管中，熱纖維梭菌的培養(yǎng)溫度為60°C ； 拜氏梭菌的培養(yǎng)溫度為35°C;詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌的培養(yǎng)溫度為80 85°C;沃氏甲烷嗜熱桿 菌的培養(yǎng)溫度為65°C ；嗜熱甲烷八疊球菌的培養(yǎng)溫度為50°C ；巴氏甲烷八疊球菌的培養(yǎng)溫 度為30°C，使之具有良好的生長繁殖能力。(3) 一級擴大對于熱纖維梭菌，選用CM-M4培養(yǎng)基=KH2PO4 0. 50g, K2HPO4 · 3H20 1. 00g，尿素 2. 0g, MgCl2 · 6H20 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 05g, FeSO4 · 7H20 1. 25g,嗎啉代丙燒 磺酸 10. OOg,刃天青 1. OOg,酵母膏 6. 00g,葡糖糖 5. 00g, cyeteine-HCl -H2O 1. 00g,蒸餾水 1. 0L，pH7. 2，于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌20min。在無菌條件下接種經(jīng)篩選鑒定的熱纖維 梭菌母種，放置在恒溫箱中，保持溫度60°C，厭氧培養(yǎng)72h。對于拜氏梭菌，選用CM-M8培養(yǎng) 基鮮馬鈴薯片200. 0g，葡糖糖6. 0g，碳酸鈣3. 0g，刃天青1. 0g, cyeteine-HCl -H2O 0. 5g， 蒸餾水1. OL0在無菌條件下接種拜氏梭菌母種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度35°C，厭氧培養(yǎng) 72h。對于詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基=Fe (NH4)2(SO4)2 ·7Η20 2. OOgjMgCl2 ·6Η20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H200. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. Og,微量元素溶液 10. 0ml (微 量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g，AlK (SO4)2O. 01g，ZnCl2 0. lg，NaCl 1. OgjNa2MoO4 0. OlgjH3BO3 0. 01g，蒸餾水 1. 0L)， 維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛 酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯 磺酸5. 0g，蒸餾水1.0L)，蒸餾水1.(^，于1.051^/0112，121.31下滅菌301^11。取出后放成 斜面，無菌條件下接種詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌母種，放置在恒溫箱中，保持溫度80 85°C，培養(yǎng) 72h。對于沃氏甲烷嗜熱桿菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4)2 (SO4) 2 ·7Η20 2. OOgjMgCl2 ·6Η20
4.00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H200. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. Og,微量元素溶液 10. 0ml (微 量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20
0.12g, AlK(SO4)2 O.Olg，ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 O.Olg，蒸溜水
1.0L)，維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. Og, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨 基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌 條件下接種沃氏甲烷嗜熱桿菌母種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度65°C，培養(yǎng)72h。對于嗜熱 甲烷八疊球菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4) 2 (SO4) 2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3
5.00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g，NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方 N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, Mn Cl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2 O.Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4O. Olg, H3BO3 0. 01g，蒸餾水 1. 0L)，維生素溶液 10. 0ml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Ogjt辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. 0g，尼克酸5. Og,維生素B12O. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾 水1. 0L)，蒸餾水1. 0L，于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種嗜熱甲烷 八疊球菌母種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度50°C，培養(yǎng)72h。對于巴氏甲烷八疊球菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4)2 (SO4)2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g，刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2OO. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g，NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g， FeCl2 ·4Η20 0. 4g，MnCl2 ·4Η20 0· lg，CoCl2 · 6Η200· 12g，AlK (SO4) 2 0. OlgjZnCl2 0. lg, NaCl 1. 0g, Na2MoO4 0. 01g, H3BO3 0. Olg,蒸餾水1. 0L)，維生素溶液10. Oml (維生素溶液配方生 物素2. 0g，鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. 0g，硫辛酸5. Og,葉酸2. 0g，核黃 酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于 1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種巴氏甲烷八疊球菌母種，放置在恒溫 箱中，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)72h。 (4) 二級擴大對于熱纖維梭菌，選用CM-M4培養(yǎng)基=KH2PO4 0. 50g, K2HPO4 · 3H20
1.00g，尿素 2. 0g, MgCl2 · 6H20 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 05g, FeSO4 · 7H20 1. 25g,嗎啉代丙 烷磺酸 10. 00g，刃天青 1. OOg,酵母膏 6. 00g,葡糖糖 5. 00g, cyeteine-HCl · H2O 1. 00g， 蒸餾水1. 0L, ρΗ7· 2，于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌20min。在無菌條件下接種經(jīng)篩選鑒 定的熱纖維梭菌一級菌種，放置在恒溫箱中，保持溫度60°C，厭氧培養(yǎng)4天。對于拜氏 梭菌，選用CM-M8培養(yǎng)基鮮馬鈴薯片200. Og,葡糖糖6. Og,碳酸鈣3. 0g，刃天青1. Og, cyeteine-HCl · H2O 0. 5g，蒸餾水1. 0L。在無菌條件下接種拜氏梭菌一級菌種，放置在 恒溫箱中，培養(yǎng)溫度35 °C，厭氧培養(yǎng)4天。對于詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌，選用CM-M2培養(yǎng)基 Fe (NH4)2 (SO4)2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6Η204· 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H200. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g, NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g, FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2O. Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 0. 01g，蒸餾水1. 0L)，維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物 素2. Og,鹽酸吡哆醇1. Og,硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸 5.(^，尼克酸5.(^，維生素&2 0. lg，對氨基苯磺酸5.0g，蒸餾水1.0L)，蒸餾水1.0L，于 1.051^/(^2，121.31下滅菌301^11。取出后放成斜面，無菌條件下接種詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌 一級菌種，放置在恒溫箱中，保持溫度80 85°C，培養(yǎng)4天。對于沃氏甲烷嗜熱桿菌，選用 CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e (NH4) 2 (SO4) 2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6Η204· 00g, NaHC035. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g，刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g，NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g， FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2 0. Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 0. Olg,蒸餾水 1. 0L)，維生素溶液 10. 0ml (維生素溶液 配方生物素2. 0g，鹽酸吡哆醇l.Og，硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. 0g，硫辛酸5. Og,葉酸
2.Og,核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾 水1.(^，于1.051^/0112，121.31下滅菌301^11。在無菌條件下接種沃氏甲烷嗜熱桿菌一 級菌種，放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度65°C，培養(yǎng)4天。對于嗜熱甲烷八疊球菌，選用CM-M2 培養(yǎng)基，F(xiàn)e(NH4)2(SO4)2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20
203. 45g，刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl · H2O 0. 50g, CaCl2 · 2H20 0. 14g, Na2S · 9H20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g，NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. Oml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g， FeCl2 · 4H20 0. 4g, MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H20 0. 12g, AlK(SO4)2 0. Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4O. Olg, H3BO3 0. Olg,蒸餾水 1. OL)，維生素溶液 10. Oml (維生素溶液配 方生物素2. 0g，鹽酸吡哆醇1. 0g，硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. 0g，硫辛酸5. Og,葉酸2. Og, 核黃酸5. Og,尼克酸5. Og,維生素B12O. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L, 于1. 05kg/cm2,121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種嗜熱甲烷八疊球菌一級菌種， 放置在恒溫箱中，培養(yǎng)溫度50°C，培養(yǎng)4天。對于巴氏甲烷八疊球菌，選用CM-M2培養(yǎng)基， Fe (NH4) 2 (SO4) 2 · 7H20 2. 00g, MgCl2 · 6H20 4. 00g, NaHCO3 5. 00g, MgSO4 · 7H20 3. 45g,刃天青 0. OOlg, cyeteine-HCl .H2OO. 50g, CaCl2 ·2Η20 0. 14g，Na2S ·9Η20 0. 50g, K2HPO4 0. 14g，NaCl 18. 0g，微量元素溶液 10. 0ml (微量元素溶液配方=N(CH2COOH)3 4. 5g，F(xiàn)eCl2 · 4H20 0. 4g， MnCl2 · 4H20 0. lg, CoCl2 · 6H200. 12g, AlK(SO4)2 0. Olg, ZnCl2 0. lg, NaCl 1. Og, Na2MoO4 0. Olg, H3BO3 0. Olg,蒸餾水1. 0L)，維生素溶液10. 0ml (維生素溶液配方生物素2. Og,鹽 酸吡哆醇1. Og,硫胺素5. 0g, D-泛酸鈣5. Og,硫辛酸5. Og,葉酸2. Og,核黃酸5. 0g，尼克 酸5. Og,維生素B12 0. Ig,對氨基苯磺酸5. Og,蒸餾水1. 0L)，蒸餾水1. 0L,于1. 05kg/cm2, 121. 3°C下滅菌30min。在無菌條件下接種巴氏甲烷八疊球菌一級菌種，放置在恒溫箱中，培 養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)4天。(5)吸附熱纖維梭菌、拜氏梭菌、詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌、沃氏甲烷嗜熱桿菌、嗜熱甲 烷八疊球菌和巴氏甲烷八疊球菌各微生物載體均為經(jīng)粉碎過60目篩并經(jīng)高溫滅菌后的膨 潤土，吸附量為膨潤土干重的40%。在該產(chǎn)甲烷菌劑吸附載體中添加經(jīng)過高溫滅菌并過60 目篩的硫酸鋅、鈣鎂磷肥、硫酸錳和磷酸二氫鉀，混合比例1 5 1 2，添加量占膨潤土 干重的5%。(6)配制微生物菌種按照，熱纖維梭菌拜氏梭菌詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌沃氏 甲烷嗜熱桿菌嗜熱甲烷八疊球菌巴氏甲烷八疊球菌為111114的比例 進行配制。(7)檢測有效活菌數(shù)采用平板計數(shù)法測定。(8)計量包裝采用電子或磅秤計量，誤差500士0.05g，1000士0. lg。采用不透明 塑料(或玻璃)瓶包裝。為了驗證產(chǎn)甲烷菌劑的效果，我們按照不同的添加量進行沼氣產(chǎn)生量測定，檢測 結(jié)果見表4。表4沼氣成分檢測結(jié)果
權(quán)利要求
產(chǎn)甲烷菌劑及其制備技術(shù)，其特征在于以復(fù)合細菌為功能微生物，通過微生物斜面菌種→分別活化→一級擴大→二級擴大→吸附→配制→檢測→包裝→產(chǎn)甲烷菌劑。
2.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)甲烷菌劑及其制備技術(shù)，其特征在于產(chǎn)甲烷菌劑系6株不 同的微生物組成，分屬于熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum Viljoen et al.)保存于中國農(nóng)業(yè)微生物菌 種保藏管理中心，其編號為ACCC00026 ；拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii Donkeremend. Keis et al.)保存于中國農(nóng)業(yè) 微生物菌種保藏管理中心，其編號為ACCC00028 ；^Kzfelif (Methanocaldococcus jannaschii (Jones et al. ) Whitman) i^^f于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其編號為ACCC00011 ；沃氏甲燒嗜熱桿菌〔Methanothermobacter wolfeii (Winter et al. )Wasserfallen etal.〕保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其編號為ACCC0007 ；嗜熱甲燒八疊球菌(Methanosarcina thermophila Zinder et al.)保藏于中國農(nóng)業(yè) 微生物菌種保藏管理中心，其編號為ACCC00022 ；巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkeri Schnellen)保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌 種保藏管理中心，其編號為ACCC00017。
3.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)甲烷菌劑及其制備技術(shù)，其特征在于各微生物均為灰色粉 狀，松散。
4.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)甲烷菌劑及其制備技術(shù)，其特征在于生產(chǎn)設(shè)備包括高壓滅 菌設(shè)備、發(fā)酵罐、真空包裝機。
5.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)甲烷菌劑及其制備技術(shù)，其特征在于熱纖維梭菌拜氏梭 菌詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌沃氏甲烷嗜熱桿菌嗜熱甲烷八疊球菌巴氏甲烷八疊球菌為 2:3:1:1:1: 4的比例進行配制。
6.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)甲烷菌劑及其制備技術(shù)，其特征在于熱纖維梭菌、拜氏梭 菌、詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌、沃氏甲烷嗜熱桿菌、嗜熱甲烷八疊球菌和巴氏甲烷八疊球菌各微生 物載體均為經(jīng)粉碎過60目篩并經(jīng)高溫滅菌后的膨潤土，吸附量為膨潤土干重的40%。
7.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)甲烷菌劑及其制備技術(shù)，其特征在于在該產(chǎn)甲烷菌劑吸附 載體中添加經(jīng)過高溫滅菌并過60目篩的硫酸鋅、鈣鎂磷肥、硫酸錳和磷酸二氫鉀，混合比 例1 5 1 2，添加量占膨潤土干重的5%。
8.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)甲烷菌劑及其制備技術(shù)，其特征在于產(chǎn)甲烷菌劑有效活菌 總數(shù)> 10億個/g。
9.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)甲烷菌劑及其生產(chǎn)技術(shù)，其特征在于真空包裝，常溫下避光保存。
10.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)甲烷菌劑及其制備技術(shù)，其特征在于常溫下保質(zhì)期2年。
全文摘要
本發(fā)明是一種微生物制劑及其制備技術(shù)，屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以熱纖維梭菌、拜氏梭菌、詹氏產(chǎn)甲烷石狀菌、沃氏甲烷嗜熱桿菌、嗜熱甲烷八疊球菌和巴氏甲烷八疊球菌按1～2∶1～3∶1∶1∶1∶1～4的質(zhì)量比配合，其有效活菌總數(shù)為10億個/g。無菌操作，常溫下避光保存。對于家庭式發(fā)酵池需添加產(chǎn)沼氣菌劑，添加量為投料量的0.1％～0.2％。對于半批量(半連續(xù))發(fā)酵方式和連續(xù)發(fā)酵方式，添加量為投料量的0.05％～0.1％。該產(chǎn)甲烷菌劑對溫度適應(yīng)性廣，從30℃到85℃均能持續(xù)產(chǎn)氣，對有機質(zhì)材料要求不嚴。該技術(shù)可應(yīng)用于家庭小型沼氣池和大型工廠化沼氣設(shè)施使用。
文檔編號C12R1/01GK101921707SQ20101024435
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月28日
發(fā)明者劉秀麗 申請人:劉秀麗