專利名稱：血管生長素作為血管瘤血清標志物的應用的制作方法
血管生長素作為血管瘤血清標志物的應用
技術領域：
本發(fā)明涉及血管生長素(AngiogenimANG)作為血管瘤新血清標志物的用途。背景技術：
血管瘤是最常見的嬰幼兒良性腫瘤。在中國，新生兒發(fā)病率為1%，在歐美白人中則不低于3%。其獨特的自然病程，尚不滿意的治療現狀，以及作為獨一無二的人類血管生成天然模型，使之成為國內外學者研究的熱點。目前，已經公認的血管瘤標志物(如葡萄糖轉運蛋白1)主要基于病理標本的研究，必須進行活檢或手術切除，同時，因不同取材部位瘤體的增殖特性不同，勢必影響結果的可靠性和準確性。目前已發(fā)現血管瘤患兒體液中存在異常增高的因子，如外周血循環(huán)中的內皮祖細胞、血清中的雌激素、基質金屬蛋白酶(MMP)以及尿液中的MMP和bFGF等。這些異常增高的因子與血管瘤的發(fā)生發(fā)展機制存在一定的聯系，但無法敏感特異地反映血管瘤的增殖特性，也無法預測瘤體增殖潛能及治療預后。目前除我們新發(fā)現的血管生長素 (Angiogenin, ANG)以外，尚未發(fā)現與血管瘤病程密切相關、特異度敏感度較強的血清標志物。ANG是一種由缺氧誘導的關鍵的分泌型血管生成因子，其作用類似于VEGF，(參見 Russo N，Shapiro R，Acharya KR, Riordan JF, Vallee BLRole ofglutamine-117 in the ribonucleolytic activity of human angiogenin. Proc Natl AcadSci USA. 1994 ； 91(8) :2920- .)參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，具有促進瘤體增殖的作用。在一些腫瘤的臨床早期監(jiān)測和預后判斷中，血清ANG濃度具有反映多種腫瘤細胞增殖及病理性血管生成特性的作用。2009年研究發(fā)現ANG可作為監(jiān)測冠脈硬化致心肌缺血的血清標志物(參見 Patel JViAbraheem A，Chackathayil J，et al. Circulating biomarkers of angiogenesis as indicators of leftventricular systolic dysfunction amongst patients with coronary artery disease. JIntern Med· 2009，265 :562-567.)。

發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題是，提供一種新型的血管瘤血清標志物ANG。為了解決上述問題，本發(fā)明提供了血管生長素ANG在血管瘤血清標志物中的應用。在臨床實踐中，我們觀察到非常奇特的現象多發(fā)性血管瘤，即生后數天內皮膚上出現一個小紅點，之后迅速增大，很短時間內其他部位“不約而同”地出現兩個或多個增殖病灶。這種現象在臨床血管瘤病例中達到20%。受此啟發(fā)，我們認為血清中的一些血管瘤相關因子可能影響或密切伴隨著血管瘤的發(fā)生發(fā)展。在此思路下，本課題組是國內外血管瘤血清學標志物檢測的最早發(fā)現和倡導者之一。最初的實驗中，我們利用cDNA表達譜基因芯片(4096條待測基因)，初步篩選出與血管瘤血管形成密切相關的15個差異表達基因，并發(fā)現增生期血管瘤患兒血清VEGF水平高于退化期及正常水平(參見 Zhang Li, LinXiaoxi, Wang Wei, et al. Circulating Level of Vascular Endothelial Growth Factor inDifferentiating Hemangioma from Vascular Malformation Patients. Plast ReconstrSurg. 2005,116 :200-204.)，該研究結果被國際脈管病研究學會(ISSVA)發(fā)布的分類文件引用(參見Odile Enjolras, Michel Wassef Introduciton :ISSVAclassification. Color atlas of vascular tumors and vascular malformations. Pl-Il，2007，New York, NY, USA.)，這是本課題的重要研究基礎，進一步提示血管瘤患兒血清中可能存在更特異的血清標志物。目前認為，在血管瘤發(fā)生、發(fā)展的復雜過程中，可能存在著一個相互協(xié)調的共表達的基因群體。要了解血管瘤從增生轉變?yōu)橄诉^程中的分子機制，就要研究這一基因群體的動態(tài)變化，由此可篩選出血清標志物，甚至起調控作用的關鍵基因。基因芯片的大規(guī)模、 高通量系統(tǒng)篩查恰恰滿足了這一要求，并能避免對已報道因子進行血清檢測，消除指標選擇上的偏倚(參見Scott CP, Vanffye J,McDonald MD, et al. Technical analysis of cDNA microarrays. PLoSONE. 2009,4 :e4486.)?；蛐酒夹g不斷完善，在血管瘤中的也有應用，但尚未應用于系統(tǒng)全面地篩查血管瘤血清標志物。本課題通過基因芯片檢測取自同一血管瘤患兒的增生期和退化期自身對照標本，獲得較可靠的增生期和退化期間的差異表達基因，再針對其中編碼分泌蛋白的基因進行篩查，從而系統(tǒng)全面地篩查血管瘤血清標志物。腫瘤標志物(tumor marker, TM)是指在腫瘤發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細胞的基因表達而合成、分泌的，或因機體對腫瘤反應而異常產生和(或)升高的反映腫瘤存在和生長的一類物質。這些物質可在腫瘤患者組織、體液、排泄物中檢測出來。較好的血清腫瘤標志物與病程及治療預后相關，特異度、敏感度較強，可作為監(jiān)測病程、評估療效、預防復發(fā)的重要監(jiān)測指標。分泌蛋白是指在細胞內合成并分泌至細胞外發(fā)揮作用的一類蛋白質，如酶、抗體、 細胞因子、神經肽、部分激素等。它僅占人體蛋白的十分之一，是一類功能非常重要的蛋白， 參與了細胞的生長發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、信號傳導、細胞分化凋亡、血管生成、腫瘤發(fā)生等多種過程。由此可見，由瘤體細胞的基因表達而合成分泌于血清的腫瘤標志物，均屬分泌蛋白。本課題針對分泌蛋白篩選血清標志物，創(chuàng)新性實踐了從組織的差異表達基因尋找血清標志物的捷徑，該方法已在同日申請的另一份發(fā)明專利申請“應用基因芯片檢測腫瘤組織篩查腫瘤血清標志物的方法”中公開，將差異表達基因的篩選范圍縮小約10倍，而且提高了血清學驗證的成功率，從而解決了基因篩選過程中工作量大，但準確率較低的難題。此篩選方法對利用基因芯片尋找其他腫瘤血清標志物的研究具借鑒意義。本發(fā)明的優(yōu)點在于，本發(fā)明公開了一種新型的血管瘤血清標志物ANG，其血清濃度與血管瘤病程密切相關，且具有很強的特異度和敏感性，能在不同程度上區(qū)分出增生期血管瘤和正常嬰幼兒、血管瘤和靜脈畸形、以及血管瘤增生期和退化期。ANG作為一種缺氧誘導的分泌型血管生成因子，與腫瘤細胞的增殖、侵襲及血管生成緊密相關，處于血管生成調控網絡的樞紐環(huán)節(jié)，并且由內皮細胞分泌至其血清。因此，檢測患兒外周血ANG水平能在臨床上監(jiān)測血管瘤的增殖特性，有助于臨床監(jiān)測血管瘤增生早期和治療穩(wěn)定期的瘤體增殖潛能，輔助臨床上治療時機、治療方式及停藥時間的決策，平衡臨床治療的有效性和安全性，從而提高血管瘤綜合治療水平。
圖1為血管瘤增生退化期差異表達基因聚類圖，示意新的血清標志物ANG篩選過程(A)表示68個差異表達基因，(B)表示放大顯示含ANG的部分差異表達基因，(C)表示篩出的ANG等4個編碼分泌蛋白的基因。圖2為ELISA法檢測各組血清ANG濃度均值比較增生期組(ΡΗ，η = 46)高于退化期組(IH，n = 23)，退化期組高于正常對照組(control，η = 31)，增生期組和退化期組均高于靜脈畸形組(VM，η = 20)。圖3為ROC曲線分析顯示增生組和其他各組的最佳ANG臨界濃度及相應的敏感度和特異度Α.表示與正常對照組相比，B.表示與靜脈畸形組相比，C.表示與退化組相比。圖4為實時定量RT-PCR驗證ANG在血管瘤組織中mRNA水平上的表達。實驗結果顯示增生期組(ΡΗ，η = 6)血管瘤組織中mRNA水平上ANG的表達高于退化期(ΙΗ，η = 5) 組和正常對照組(control, η = 5) (P < 0. 001)。圖5為免疫組織化學染色驗證ANG蛋白在血管瘤組織中的表達。實驗結果顯示增生期組(上行，η = 26)血管瘤血管內皮細胞呈胞漿內強陽性表達(胞漿內呈現棕黃色顆粒為免疫組化染色陽性)，退化期組(中行，η = 25)血管瘤血管內皮細胞呈胞漿內中等陽性表達，正常對照組(下行，n= 1 呈陰性表達，提示增生期血管瘤組織中蛋白水平上ANG 的表達高于退化期組和正常對照組。圖中左列放大200倍，右列放大400倍。圖6 S^festern blotting驗證ANG蛋白在血管瘤組織中的表達。實驗結果顯示增生期組(PH，n = 7)血管瘤組織中ANG蛋白定量高于退化期組(IH，n = 6)和正常對照組 (control, η = 6) (P < 0. 05)。Α.顯示三組蛋白印跡條帶，B.顯示三組蛋白相對定量統(tǒng)計比較，均以β-actin為內參。
具體實施方式下面結合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式
做詳細說明。實施例1從同一血管瘤增生、退化期自身對照標本的基因芯片結果中，篩查得4個有意義的編碼分泌蛋白的基因(見圖1)。經ELISA法檢測增生、退化期血管瘤、靜脈畸形及正常對照4組血清中各分泌蛋白濃度，發(fā)現增生期組血清ANG濃度高于退化期組(P < 0. 01)，退化期組高于正常對照組(P < 0. 001)，增生期組和退化期組均高于靜脈畸形組(P值分別小于 0. 001,0. 01)(圖2)。ROC曲線分析顯示血清ANG濃度與血管瘤增生退化病程密切相關，且特異性敏感性強(表1，圖3)。之后，以實時定量RT_PCR(圖4)、免疫組織化學(圖5)及flfestern blotting(圖 6)驗證ANG在血管瘤組織中的表達，實驗結果顯示增生期血管瘤組織的mRNA及蛋白水平上 ANG的表達均高于退化期組和正常對照組。上述實驗充分驗證ANG為一種新型的血管瘤血清標志物。表1. ROC曲線分析顯示增生組和其他各組的最佳ANG臨界濃度及相應的敏感度和特異度
組別臨界濃度(ng/ml)敏感度(％)特異度(％)曲線下面積(95%可信區(qū)間)P對照組113.1387.090.30.94(0.88-0.99).000靜脈畸形組116.2584.880.00.87(0.75-0.98)■000退化組133.0769.665.20.70(0.56-0.84).007 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.血管生長素ANG作為血管瘤血清標志物的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了血管生長素(angiogenin，ANG)作為新血管瘤血清標志物的應用，即提供一種新型的血管瘤血清標志物ANG，其與血管瘤病程密切相關，且具有很強的特異度和敏感性，檢測患兒外周血ANG水平能在臨床上監(jiān)測血管瘤的增殖特性，有助于臨床監(jiān)測血管瘤增生早期和治療穩(wěn)定期的瘤體增殖潛能，輔助臨床上治療時機、治療方式及停藥時間的決策，平衡臨床治療的有效性和安全性，從而提高血管瘤綜合治療水平。
文檔編號C12Q1/68GK102344957SQ20101024521
公開日2012年2月8日 申請日期2010年8月4日 優(yōu)先權日2010年8月4日 公開號201010245215.發(fā)明者林曉曦, 江成鴻, 胡曉潔, 金云波, 陳曉東, 陳輝, 陳達, 馬剛 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院