專利名稱：慢病毒介導(dǎo)的豬生長激素單質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明構(gòu)建了慢病毒介導(dǎo)的豬生長激素(pig growth hormone, pGH)單質(zhì)粒誘導(dǎo) 表達(dá)系統(tǒng)，屬于基因工程領(lǐng)域，具體地講該方法的的進(jìn)一步應(yīng)用可以為生產(chǎn)安全的，瘦肉節(jié) 糧且生長速度可調(diào)控的轉(zhuǎn)GH基因豬做好鋪墊。
背景技術(shù)：
(一 )生長激素生長激素(growth hormone)是由腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的單鏈多肽激素，具 有促進(jìn)物質(zhì)代謝與生長發(fā)育的作用，對機(jī)體各器官和組織均有影響，其主要作用是刺激骨、 軟骨細(xì)胞的生長和分化，調(diào)節(jié)糖類、脂類和蛋白質(zhì)三大物質(zhì)代謝。在個體生長發(fā)育過程中，生長激素是起關(guān)鍵作用的激素，幼年動物缺少GH，會出 現(xiàn)生長停滯、身材矮小，在人類表現(xiàn)為侏儒癥；成年動物體內(nèi)的GH會隨著年齡的增長而減 少，其結(jié)果是機(jī)體逐漸衰老，成人GH缺乏癥表現(xiàn)為皮膚菲薄、肌肉重量減輕、脂肪及總體重 增加、骨質(zhì)疏松、心腎功能降低、凝血機(jī)制異常、免疫功能和性功能低下，神經(jīng)興奮降低及精 神抑郁等[1]。幼年動物GH分泌過多，表現(xiàn)為巨人癥；成年動物GH分泌過多，由于骨骺閉 合，長骨不再生長，而肢端短骨、面骨及其軟骨組織則生長異常，以致出現(xiàn)手足粗大、鼻大、 唇厚及內(nèi)臟器官增大的肢端肥大癥。GH的促生長作用主要是通過其誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生生長 素介質(zhì)(somatomedin，SM)來實(shí)現(xiàn)的，SM的化學(xué)結(jié)構(gòu)與胰島素近似，又稱胰島素樣生長因 子(insulin-like growth factor, IGF)。IGF的作用是促進(jìn)軟骨生長，它通過促進(jìn)鈣、磷、 鈉、鉀、硫等多種元素進(jìn)入軟骨組織，以及氨基酸進(jìn)入軟骨細(xì)胞，增強(qiáng)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的 合成，促進(jìn)軟骨組織增殖和骨化，使長骨加長，也能刺激多種組織細(xì)胞有絲分裂。自從1982年I^lmiter等人獲得快速生長的“超級小鼠”后，人們對生長激素的轉(zhuǎn) 移產(chǎn)生了極大的興趣，目前已獲得轉(zhuǎn)GH基因豬、小鼠、兔、魚等動物。有研究報道，Hammer等 將人的生長激素基因?qū)胴i、兔、綿羊后，分別得到三種動物的整合個體，豬和兔體內(nèi)得到 了表達(dá)；史瀛仙等將人生長激素和小鼠MT基因融合注入團(tuán)頭魴和鯉魚的受精卵，經(jīng)檢測表 明hGH基因在受體魚中得到整合、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)，并且具有顯著的促生長效應(yīng)[2]。將豬生長激素(pGH)轉(zhuǎn)入豬、鼠、兔體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)得到的轉(zhuǎn)基因豬、鼠和兔生長速度 均有明顯提高，且得到的轉(zhuǎn)基因陽性豬可以將導(dǎo)入基因部分的遺傳給后代，F(xiàn)l代豬亦表現(xiàn) 出較好的生產(chǎn)性狀。轉(zhuǎn)豬生長激素(PGH)的金魚，不僅pGH基因得到表達(dá)，而且可通過有性 繁殖傳遞給后代。在轉(zhuǎn)牛生長激素(bGH)基因注入小鼠受精卵，結(jié)果轉(zhuǎn)入的GH基因?qū)τ?的轉(zhuǎn)基因小鼠具有明顯的促生長作用，GH基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性。將牛和羊的 生長激素基因?qū)膈庺~受精卵，獲得轉(zhuǎn)基因鯉魚，實(shí)驗(yàn)證明外源基因可以遺傳給后代，并對 受體魚有明顯的促生長作用[3]。目前通過基因重組技術(shù)成功合成了人生長激素(I^hGH)，其結(jié)構(gòu)與人的GH相似，具 有促進(jìn)物質(zhì)代謝和組織細(xì)胞生長、發(fā)育、增殖、分化，調(diào)節(jié)免疫及代謝作用，目前已被廣泛用 于治療慢性肝病、改善嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、慢性阻塞性肺病等疾病領(lǐng)域，在減肥、抗衰老、美容等領(lǐng)域也在迅速增長。GH雖具有的促生長功能以及潛在的價值，但是轉(zhuǎn)GH基因動物還存在諸多問題。難 以控制轉(zhuǎn)入基因在宿主基因組中的行為，以及存在的安全性問題都將是面臨的考驗(yàn)。( 二)Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)GOSSEN等[56]建立的四環(huán)素表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，(Tet基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng))，高效無 毒，具有嚴(yán)密的開關(guān)功能。該系統(tǒng)基礎(chǔ)表達(dá)水平低，誘導(dǎo)表達(dá)水平高；調(diào)控特異性高，宿主 基因不受影響；誘導(dǎo)劑無相關(guān)毒性；適用范圍廣泛，可穿越胎盤屏障和分泌進(jìn)乳汁，尤其 適合轉(zhuǎn)基因研究；存在劑量依賴性，可定時定量誘導(dǎo)表達(dá)。應(yīng)用于大多數(shù)真核細(xì)胞的一般 為雙質(zhì)粒調(diào)控的表達(dá)系統(tǒng)，即由調(diào)節(jié)質(zhì)粒和反應(yīng)質(zhì)粒組成。其中，在四環(huán)素的衍生物強(qiáng)力 霉素(Doxycycline，Dox)存在下，Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)可以誘導(dǎo)插入啟動子下游的目的 基因高效表達(dá)。目前認(rèn)為，Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)是最為理想的真核生物基因誘導(dǎo)表達(dá)系 統(tǒng)，隨著人們對該系統(tǒng)的不斷的研究和改造，該系統(tǒng)的功能和組成都得到了提高和優(yōu)化， pTRE-Tight-BI質(zhì)粒含有兩個受同一 TRE-mod調(diào)控的反向的迷你型CMV啟動子，可同時誘導(dǎo) 兩個不同基因的表達(dá)。(三)慢病毒慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒科的一個屬。按照目前國際病毒分類標(biāo)準(zhǔn)，逆轉(zhuǎn)錄病毒科分 為7個屬α逆轉(zhuǎn)錄病毒屬，β逆轉(zhuǎn)錄病毒屬，Y反轉(zhuǎn)錄病毒屬，δ反轉(zhuǎn)錄病毒屬，ε反 轉(zhuǎn)錄病毒屬，慢病毒屬，泡沫病毒屬。其中的慢病毒屬又分為5個組，包括牛慢病毒組、馬慢 病毒組、貓慢病毒組、羊慢病毒組和人類慢病毒組。我們在實(shí)驗(yàn)所采用的病毒載體是HIV-I 來源的慢病毒，HIV在病毒“大家族”中的定位是逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬中的人類免疫缺陷 病毒組。HIV-I的基因組由兩條相同的正股RNA鏈在5'端通過部分堿基互補(bǔ)配對而成二 聚體。病毒基因組全長約9.81Λ，含有g(shù)ag、p0l、env 3個結(jié)構(gòu)基因以及2個調(diào)節(jié)基因(tat 反式激活因子、rev毒粒蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)子)和4個輔助基因(nef負(fù)調(diào)控因子、vpr病毒r蛋 白、vpu病毒u蛋白和vif毒粒感染性因子)[7]。在病毒基因組的5'端和3'端各有相同 的一段核苷酸序列，稱為長末端重復(fù)序列(long terminal r印eat，LTR)。慢病毒載體的構(gòu) 建原理是將HIV-I基因組中的順式作用元件(如包裝信號、長末端重復(fù)序列)和編碼反式 作用因子的序列進(jìn)行分離，拆分在不同的質(zhì)粒，使各質(zhì)粒不能單獨(dú)形成病毒顆粒，也不具備 感染能力te]。慢病毒載體HIV慢病毒載體系統(tǒng)經(jīng)歷了三個發(fā)展階段，既所謂的三代，本實(shí)驗(yàn) 所采用的第三代慢病毒載體也就是所謂的四質(zhì)粒系統(tǒng)，相比較而言，四質(zhì)粒系統(tǒng)更增加了 載體系統(tǒng)的安全性。之所以選擇慢病毒載體作為轉(zhuǎn)基因的方法，是因?yàn)樗衅渌椒ㄋ鶝]有的優(yōu)勢。 在各種轉(zhuǎn)基因方法中，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的轉(zhuǎn)基因效率是最高的，且為單拷貝隨機(jī)整合。慢 病毒的優(yōu)勢在于其一慢病毒載體既可以轉(zhuǎn)染處于有絲分裂活躍期的細(xì)胞，又可以轉(zhuǎn)染 分裂緩慢及處于分裂終末期的細(xì)胞，包括造血干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞，處于分化終末的神經(jīng) 元，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞等，這是通常使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒所不具備的；其二由慢病毒載體攜帶整合 入宿主基因組的目的基因?qū)D(zhuǎn)錄沉默作用有較強(qiáng)的抵抗能力，在體外培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi) 移植實(shí)驗(yàn)中，由慢病毒載體攜帶導(dǎo)入的目的基因可以在宿主細(xì)胞中得到長期而穩(wěn)定的表 達(dá)；其三慢病毒載體可以兼容多個轉(zhuǎn)錄啟動子，包括細(xì)胞特異性啟動子和在基因組中普遍存在的管家基因的啟動子；其四經(jīng)過改建后的慢病毒載體可以容納約101Λ左右的外源 基因，因此大多數(shù)的cDNA都能被克隆入慢病毒載體M。慢病毒載體的上述優(yōu)點(diǎn)使其成為體 內(nèi)和體外基因轉(zhuǎn)移的一種有效工具。[1]趙東峰，李漢超，王悅?cè)?，?基因工程人生長激素及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].廣 州化工，2010, ) 44-49[2]吳婷婷，史瀛仙，楊弘，等.人生長激素基因在團(tuán)頭魴和鯉中的整合和表達(dá) [J].水產(chǎn)學(xué)報，1994[3]郭時金，周春鳳，張志亭，等.轉(zhuǎn)生長激素基因動物研究概況[J].科研綜述， 2008,6(230) 8-9[4]張雪梅，丁惠國.重組人生長激素在慢性肝臟疾病及改善營養(yǎng)代謝中的作用 [J], Chinese General Practice. 2010,13, (10) :328-331[5]GOSSEN Μ, BUJARD H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1992, 89(12) :5547-5551[6]GOSSEN M,FREUNDLIEB S,BENDER G,et al.Transcriptional activation by tetracycline in mammalian cells[J]. Science,1995,268(5218) :1766-1769[7]陸德源.醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[Μ].第4版，人民衛(wèi)生出版社，1999 :291-298.[8]Bartosch B, Cosset FL. Strategies for retargeted gene delivery using vectors derived from lentiviruses[J]. Curr Gene Ther 2004,4(4) :427-443.[9]Lai Z, Brady R 0. Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinant lentivirus vector[J]. Neurosci Res, 2002,67 :363-371.

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的的單質(zhì)粒的pGH誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，方便轉(zhuǎn)基因細(xì) 胞系的篩選和轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)。慢病毒介導(dǎo)，提高轉(zhuǎn)染效率。在強(qiáng)力霉素(Doxycycline/ Dox,該系統(tǒng)調(diào)控表達(dá)的誘導(dǎo)劑)的誘導(dǎo)下，該系統(tǒng)在豬胎兒成纖維細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)定時，定量 的誘導(dǎo)表達(dá)，可為下一步生產(chǎn)安全的，生長速度可調(diào)控的，節(jié)糧瘦肉型轉(zhuǎn)基因豬做好鋪墊。技術(shù)方案本發(fā)明首先構(gòu)建了 pGH雙質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)(pkt-on Advanced, pTRE-Tight-BI-GH)，其次將雙質(zhì)粒的pGH誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)改造為單質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng) pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 共 4221bp，然后將 pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 質(zhì)粒的功能片段插入慢病毒載體，用于包裝病毒pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced共 8344bp。最后用病毒原液感染豬胎兒成纖維細(xì)胞，采用real-time PCR在轉(zhuǎn)錄水平檢測了 該系統(tǒng)的功能。本發(fā)明所提供的慢病毒介導(dǎo)的pGH單質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，是由以下方法獲得的DpTRE-Tight-BI-GH 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建設(shè)計豬生長激素引物Primerl GTGGATCCCTCAGCTCACCGGC
Pr imer2CAACAGAGTCGACCAGCAACTAGAA劃線部分分別為上游引物和下游引物添加的BamH I和Ml I酶切位點(diǎn)；以豬垂體總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR程序如下94°C預(yù)變性2min，98°C變性10s，57°C復(fù)性15s，72°C延伸30s，30個循環(huán)后， 720C 5min，4°C恒溫，PCR 產(chǎn)物為 696bp ；將PCR擴(kuò)增獲得帶有BamH I和Ml I位點(diǎn)的編碼GH序列的PCR產(chǎn)物和 pTRE-Tight-BI分別用BamH I和Ml I進(jìn)行雙酶切，再次電泳膠純化回收，測定濃度，載體 和插入片段按摩爾比1 4混合于4°C，T4連接酶(購自TAKARA公司)16°C連接過夜，熱 激轉(zhuǎn)化到DH5 α大腸桿菌(購自TIANGEN公司)中37°C培養(yǎng)過夜，利用PCR和酶切篩選陽 性克隆，得到含pTRE-Tight-BI-GH質(zhì)粒的菌液；2)pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建設(shè)計rtTA-Advanced 片段引物Primer3TGACCTCCATAGAAGACACCPr imer4ATGTCTAGATCTTTACTTAGTTACC劃線部分為下游引物添加的BglII酶切位點(diǎn)，在擴(kuò)增產(chǎn)物中47bp處包含EcoR I的 酶切位點(diǎn)，以濃度為Ing/ μ 1 pTet-onAdvanced質(zhì)粒作為模板，擴(kuò)增rtTA-Advanced片段， PCR產(chǎn)物為770bp ；將PCR擴(kuò)增獲得帶有EcoR I和Bgl II位點(diǎn)的編碼rtTA-Advanced序列的PCR產(chǎn) 物和pTRE-Tight-BI-GH分別用EcoR I和Bgl II進(jìn)行雙酶切，再次電泳凝膠純化回收，測 定濃度，載體和插入片段按比例1 3. 5混合于4°C，T4連接酶(購自TAKARA公司)16°C 連接過夜，熱激轉(zhuǎn)化到DH5 α大腸桿菌(購自TIANGEN公司)中37°C培養(yǎng)過夜，利用PCR和 酶切篩選陽性克隆，得到含pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced質(zhì)粒的菌液；3)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 質(zhì)粒的構(gòu)建設(shè)計pLenti骨架引物Primer5GCGACTTCCAGTTCAAPrimer6CTAGACTAGTCTCCACCTTCTTCTTCTAT劃線部分為下游引物添加的Spe I酶切位點(diǎn)，以濃度為Ing/μ 1 pLenti6/V5-Gff/ IacZ質(zhì)粒作為模板，擴(kuò)增pLenti骨架，PCR產(chǎn)物為6M9bp，在擴(kuò)增產(chǎn)物中297bp處包含 SacII的酶切位點(diǎn)；設(shè)計TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 功能片段引物Primer7CTAGACTAGTCCTGACGTCGGCAGTGAAAAPrimer8TCCCCGCGGCGACCAGCAACTAGAAGGCA劃線部分分別為上游引物和下游引物添加的Spe I和SacII酶切位點(diǎn)，以濃度為 Ing/ μ 1 pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 質(zhì)粒作為模板，擴(kuò)增 2109bp的TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段，將產(chǎn)物瓊脂糖電泳分離、切膠回收后 克隆至 pMD-19 載體(購自 TAKARA 公司)。將 2109bp 的 TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced DNA功能片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，pMD-19載體和插入片段按摩爾比1 10混 合于4°C，T4連接酶(購自TAKARA公司)16°C連接過夜，熱激轉(zhuǎn)化到DH5a大腸桿 菌(購自TIANGEN公司)中37°C培養(yǎng)過夜，利用PCR和酶切篩選陽性克隆，得到含pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 質(zhì)粒的菌液；將PCR擴(kuò)增獲得帶有Spe I和McII酶切位點(diǎn)的pLenti質(zhì)粒骨架DNA和 pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced質(zhì)粒分別用Spe I和 c II進(jìn)行雙酶切，將產(chǎn)物瓊脂 糖電泳分離、切膠回收，測定濃度，按1 3比例混合于4°C，T4連接酶(購自TAKARA公 司)16°C連接過夜，熱激轉(zhuǎn)化到DH5ci大腸桿菌(購自TIANGEN公司)中37°C培養(yǎng)過夜，利 用PCR和Nru I酶切篩選鑒定陽性克隆，得到含pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced質(zhì) 粒的菌液，4)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 病毒生產(chǎn)(1)轉(zhuǎn)染前一天，用Iml質(zhì)量比0. 25%胰酶消化細(xì)胞，按1 4的比例傳到 4個T75cm2培養(yǎng)瓶中，加入IOml不含抗生素的培養(yǎng)基，放入37°C含體積比5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；(2)轉(zhuǎn)染當(dāng)天，待細(xì)胞達(dá)到體積比70-90%融合度時，移除培養(yǎng)液，加入6ml無抗生素的培養(yǎng)基；以一個T75cm2培養(yǎng)瓶用量為例制備DNA-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物在一個無菌的15ml 離管中，Mf 9 μ g ViraPower Packaging Mix 及 3· 5 μ g pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Ad vanced質(zhì)粒，共12yg DNA，加入到1.9ml 293FT無血清無雙抗培養(yǎng)基中，輕輕混勻，待用； 取另一無菌15ml離心管，將40 μ 1的脂質(zhì)體Lipofectamine 2000加入1. 9ml 293FT無血 清無雙抗培養(yǎng)基中，輕輕吹吸混勻，迅速與上一步的混合液混合，并輕輕混勻，室溫孵育20 分鐘，以形成DNA-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物；(3)將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入培養(yǎng)瓶中，并來回輕搖以混勻，37°C培養(yǎng)6 12小時 后，換上IOml新的完全無抗生素培養(yǎng)基；(4)轉(zhuǎn)染后72小時收集含病毒的上清到無菌有蓋的15ml的尖底離心管內(nèi)；(5) 40C 3000rpm離心15分鐘，以去除細(xì)胞沉淀；(6)取上清，用0. 45 μ m濾器抽濾；(7)抽濾過的病毒原液經(jīng)4°C保存?zhèn)溆?，即為所獲得的慢病毒介導(dǎo)的pGH單質(zhì)粒誘 導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng) pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 病毒。所述慢病毒介導(dǎo)的pGH單質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可以在調(diào)控生長激素表達(dá)方面的應(yīng) 用。其中TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段也可在調(diào)控生長激素GH基因表達(dá)方面的 得到基因工程應(yīng)用。有益效果1、本發(fā)明首次公開了 pGH雙質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中pTRE-Tight-BI-GH質(zhì)粒序列和 構(gòu)建過程。2、本發(fā)明人首次公開pGH四環(huán)素單質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng) pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 序列及其構(gòu)建過程。3、本發(fā)明人首次公開了攜帶有慢病毒介導(dǎo)的pGH四環(huán)素單質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)pLe nti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 序列及其構(gòu)建過程。4、本發(fā)明人將pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液感染豬胎兒成纖 維細(xì)胞系，通過real-time PCR方法在轉(zhuǎn)錄水平證明了 該系統(tǒng)可以嚴(yán)密，定時，定量的調(diào) 控PGH的表達(dá)，有望用于安全，節(jié)糧瘦肉型轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)。


圖1 :pGH雙質(zhì)粒系統(tǒng)中PiTet-On Advanced質(zhì)粒圖譜。圖2 :pGH雙質(zhì)粒系統(tǒng)中pTRE-Tight-BI-GH質(zhì)粒圖譜。圖3 :pGH四環(huán)素單質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced質(zhì)粒圖■；並圖4 慢病毒介導(dǎo)pGH四環(huán)素單質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-A dvanced質(zhì)粒圖譜。圖5 =PCR擴(kuò)增2109bTRE-GH-rtTA-Advanced功能片段瓊脂糖電泳圖。圖 6 =Spe I 和 c II 對 pLenti 骨架和 pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 酶切 后瓊脂糖電泳圖。l、6M9bp pLenti 骨架酶切產(chǎn)物 2、pTA-TRE-Tight-GH-rtTA_Advanced酶 切產(chǎn)物，較短的條帶為2099bp TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段。圖 7 :pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 酶切鑒定圖。Nru I 酶切該質(zhì)粒后獲 得1840bp、2162bp和4342bp三條驗(yàn)證性條帶。圖8 :pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞后， Real-time PCR產(chǎn)物電泳圖。圖9 :pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞后， GH受調(diào)控表達(dá)量化圖。
具體實(shí)施例方式(一 )豬生長激素(growth hormone) DNA序列的克隆1)豬垂體總RNA的提取取杜洛克豬腦垂體組織0. 3g 首先加入Iml Trizol試劑，吹打均勻，將勻漿室溫 放置5min ；加入200 μ 1氯仿，劇烈震蕩混勻30s，冰上靜置3min ； 12000rpm，4°C離心15min ； 將上清液小心轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml離心管中(取400 μ 1)，加入預(yù)冷的等量體積的異丙醇，上 下顛倒幾次混勻，室溫下放置15min。12000rpm, 4°C離心15min ；小心移去上清液，防止RNA 沉淀丟失。用70%乙醇(DEPC處理的水配制)洗滌1次，加入700 μ 1乙醇，將RNA沉淀彈 起，漂洗。8000rpm，室溫離心IOmin。吸去上清，真空離心干燥3 5分鐘，或放在室溫下使 乙醇完全揮發(fā)掉。沉淀用10 μ 1 DEPC-H2O溶解。如發(fā)現(xiàn)沉淀難溶，68°C處理lOmin。RNA檢 測測定樣品在^Onm和^Onm的吸光值按10D = 40 μ g/ml RNA計算RNA的產(chǎn)量；0擬60/ 世0D280在1. 8-2. 0進(jìn)行甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，確定RNA的完整性和污染情況。2)表達(dá)片段的PCR擴(kuò)增利用豬GH 的 cDNA 序列在 NCBI 網(wǎng)站(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)的基因數(shù) 據(jù)庫中檢索到Sus scrofa(pig) growth hormone CDS AY536527. 1，設(shè)計一對引物，擴(kuò)增豬生 長激素DNA序列。以豬腦垂體組織總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板擴(kuò)增出GH的cDNA序 列。豬生長激素引物PrimerlGTGGATCCCTCAGCTCACCGGCPr imer2CAACAGAGTCGACCAGCAACTAGAA劃線部分分別為上游引物和下游引物添加的BamH I和Ml I酶切位點(diǎn)。
以步驟1)獲得的總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，用高保真酶(Prime Star HS DNA polymerase購自Takara公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序如下94°C預(yù)變性 2min，98°C變性 10s，57°C復(fù)性 15s，72°C延伸 30s，30 個循環(huán)后，72°C 5min，4°C恒溫。PCR 產(chǎn) 物為696bp。瓊脂糖電泳分離、切膠回收用于重組質(zhì)粒的構(gòu)建。(二)重組測序質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定DpTRE-Tight-BI-GH 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將PCR擴(kuò)增獲得帶有BamH I和Ml I位點(diǎn)的編碼GH序列的PCR產(chǎn)物和 pTRE-Tight-BI (購自 Clonetech 公司)分別用 BamH I 和 Sal I (BamH I 和 Sal I 購自 NEffENGLANDBiolabs)進(jìn)行雙酶切，再次電泳膠純化回收，測定濃度，按比例混合于4°C， 16°C連接過夜。熱激轉(zhuǎn)化到DH5ci大腸桿菌(購自TIANGEN公司)中37°C培養(yǎng)過夜，利用 PCR和酶切篩選陽性克隆，得到含pTRE-Tight-GH質(zhì)粒的菌液。2)pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以濃度為(lng/μ l)pTet-on Advanced質(zhì)粒(購自Clonetech公司)作為模板， 擴(kuò)增 rtTA-Advanced 片段，rtTA_Advanced 片段引物
Primer3TGACCTCCATAGAAGACACCPr imer4ATGTCTAGATCTTTACTTAGTTACC劃線部分為下游引物添加的BglII酶切位點(diǎn)，在擴(kuò)增產(chǎn)物中47bp處包含EcoR I 的酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增rtTA-Advanced片段，用高保真酶(Prime Star HS DNA polymerase購 自Takara公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序如下94°C預(yù)變性2min，98°C變性10s，57°C復(fù)性 15s，72°C延伸 30s，30 個循環(huán)后，72°C 5min，4°C恒溫。PCR 產(chǎn)物為 770bp。將PCR擴(kuò)增獲得帶有EcoR I和Bgl II位點(diǎn)的編碼rtTA-Advanced序列的PCR 產(chǎn)物和 pTRE-Tight-BI-GH 分別用 EcoR I 和 Bgl II (EcoR I 和 Bgl II 購自 NEW ENGLAND Biolabs)進(jìn)行雙酶切，再次電泳凝膠純化回收，測定濃度，載體和插入片段按1 5比 例混合于4°C，T4連接酶(購自TAKARA公司)16°C連接過夜。熱激轉(zhuǎn)化到DH5a大腸 桿菌(購自TIANGEN公司)中37 °C培養(yǎng)過夜，利用PCR和酶切篩選陽性克隆，得到含 pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 質(zhì)粒的菌液。3)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 質(zhì)粒的構(gòu)建以濃度為Ing/ μ lpLenti6/V5-Gff/lacZ 質(zhì)粒(購自 invitrogen 公司)作為模板， 擴(kuò)增pLenti骨架，pLenti骨架引物Primer5GCGACTTCCAGTTCAAPrimer6CTAGACTAGTCTCCACCTTCTTCTTCTAT劃線部分為下游引物添加的Spe I酶切位點(diǎn)，在擴(kuò)增產(chǎn)物中297bp處包含SacII 的酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增pLenti骨架，用高保真酶(Prime Star HS DNA polymerase購自Takara 公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序如下:94°〇預(yù)變性21^11，981變性10sJ4°C復(fù)性15s，72°C延 伸 6min，30 個循環(huán)后，72°C 10min，4°C恒溫。PCR 產(chǎn)物為 6549bp。以濃度為 Ing/ μ 1 pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 質(zhì)粒作為模板，擴(kuò)增 TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 功能片段，TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 功能片段引物Primer7CTAGACTAGTCCTGACGTCGGCAGTGAAAAPrimer8TCCCCGCGGCGACCAGGAACTAGAAGGCA
劃線部分分別為上游引物和下游引物添加的Spe I和McII酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增獲得的2109bp TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 功能片段，用 LA Taq (TaKaRa LA Taq購自Takara公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序如下94 °C預(yù)變性2min，94 °C變 性 30s，55 "C 復(fù)性 30s，72 "C 延伸 2min，30 個循環(huán)后，72 °C 7min, 4 "C 恒溫。PCR 產(chǎn)物 為2109bp。將產(chǎn)物瓊脂糖電泳分離、切膠回收后克隆至pMD-19載體(購自Takara公 司)。如果兩個連接產(chǎn)物均為PCR產(chǎn)物則很難實(shí)現(xiàn)連接，又考慮將pLenti骨架連入T載 體較困難，所以將2109bp的TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段進(jìn)行TA克隆得到 pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 質(zhì)粒的菌液(操作方法見 TAKARA 公司 pMD 19-T Vector說明書)。將PCR擴(kuò)增獲得帶有Spe I和Mc II酶切位點(diǎn)的pLenti骨架和 pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 質(zhì)粒分別用 Spe I 和 Sac II (Spe I 和 Sac II 購自 NEffNGLAND Biolabs)進(jìn)行雙酶切，再次電泳膠純化回收，測定濃度，按比例混合于4°C，16°C 連接過夜。熱激轉(zhuǎn)化到DH5ci大腸桿菌(購自TIANGEN公司)中37°C培養(yǎng)過夜，利用PCR 和Nru I酶切篩選鑒定陽性克隆，得到含pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced質(zhì)粒的菌 液。(三)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 病毒生產(chǎn)1)轉(zhuǎn)染前一天，用Iml 0. 25%胰酶消細(xì)胞(購自hvitrogen公司)，按 1 4的比例傳到4個T75cm2培養(yǎng)瓶中，加入約IOml 293FT培養(yǎng)基(不含抗生素)，放入 37°C含5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。2)轉(zhuǎn)染當(dāng)天，待細(xì)胞達(dá)到70-90%融合度時，移除培養(yǎng)液，加入6ml 293FT培養(yǎng)基 (無抗生素)。準(zhǔn)備DNA-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物(以一個T75cm2培養(yǎng)瓶用量為例)A: $ — f $ 胃白勺 15ml ^ f= ψ, M 9 Ug ViraPower Packaging Mix (Invitrogen)及 3· 5 μ gpLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 質(zhì)粒，共 12 μ g DNA,力口 入到1.9ml 293FT無血清無雙抗培養(yǎng)基中，輕輕混勻，待用。B:取另一無菌15ml離心管，將40 μ 1的脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 (Invitrogen)加入1. 9ml293FT無血清無雙抗培養(yǎng)基中，輕輕吹吸混勻。迅速與A步的 混合液混合，并輕輕混勻。C 室溫孵育20分鐘，以形成DNA-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物。3)將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入培養(yǎng)瓶中，并來回輕搖以混勻。37°C培養(yǎng)6 12小時 后，換上IOml新的完全培養(yǎng)基(無抗生素)。4)轉(zhuǎn)染后72小時收集含病毒的上清到無菌有蓋的15ml的尖底離心管內(nèi)。此期注意實(shí)驗(yàn)安全。5) 40C 3000rpm離心15分鐘，以去除細(xì)胞沉淀。6)取上清，用0·45μπι濾器(Millipore)小心地抽濾，不要產(chǎn)生氣泡。7)抽濾過的病毒原液經(jīng)4°C保存?zhèn)溆谩?四)豬胎兒成纖維細(xì)胞系的獲得1)材料的獲取在超凈臺中取出約克夏母豬子宮內(nèi)的30日齡胎兒(不要破壞羊 膜)放入含有200IU/mL青霉素和200 μ g/mL鏈霉素的PBS液中，漂洗2 3遍，用鑷子夾起胎兒，用滅菌眼科剪剪破羊膜使胎兒流出，放入含100IU/mL青霉素和100μ g/mL鏈霉素 的PBS液中，剪去頭、尾、四肢并去除內(nèi)臟，剩余組織在無菌的培養(yǎng)皿中用眼科剪剪切成Imm3 左右的小塊。2)原代的培養(yǎng)向培養(yǎng)皿中加入3mL含0. 25%胰蛋白酶和0. 04% EDTA的消化液， 置于4°C冰箱。冷消化3 4h，吸掉上層胰酶液，剩余胰酶液剛剛沒過組織塊。然后39°C 培養(yǎng)箱繼續(xù)進(jìn)行消化60min，此時加入2mL的含體積比20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止 消化，并用剪口吸頭反復(fù)輕輕吹打松散組織，當(dāng)其順利通過吸管口時，示消化合適。后加入 lmL39°C預(yù)溫的DMEM/F-12培養(yǎng)液(DMEM/F-12培養(yǎng)液含體積比20 %胎牛血清，2mmol/L谷 氨酸胺，100IU/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素)，吹打均勻后，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至 5 X IO5 IX IO6個細(xì)胞/mL。置于39°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 7 后觀察，發(fā)現(xiàn)貼 壁后更換一半或全部培養(yǎng)液，此后每兩天更換一次培養(yǎng)液。3)傳代當(dāng)細(xì)胞原代培養(yǎng)8 9天生長至體積比90%匯合時，吸出培養(yǎng)液，用PBS沖 洗1 2遍，加入Iml的0. 25%胰蛋白酶消化液于39°C消化約2 3min，最好不超過5min。 在顯微鏡下觀察，待大部分細(xì)胞變圓時，立即加入anl DMEM/F-12培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)液含體 積比20%胎牛血清)終止消化，輕輕吸打，制成細(xì)胞懸液，IOOOrpm離心5min后棄上清，接 種于其他培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。原皿中貼壁較緊的上皮細(xì)胞和未消化的成纖維細(xì)胞可繼續(xù)培 養(yǎng)，獲得可以傳代的豬胎兒成纖維細(xì)胞系。4)凍存細(xì)胞鋪滿瓶底后，消化、收集細(xì)胞，離心(1200rpm，5min)，小心吸除上清 液，加入4°C預(yù)冷的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度達(dá)到1 3X106個細(xì)胞/mL，轉(zhuǎn)入細(xì) 胞凍存管中，做好標(biāo)記，放入凍存盒，將凍存盒置于-70°C過夜，，第2d取出凍存管放入液氮 罐中。(五)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液感染豬胎兒成纖維細(xì)胞后， Dox誘導(dǎo)GH在豬胎兒成纖維細(xì)胞中表達(dá)鑒定復(fù)蘇凍存的豬胎兒成纖維細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長至體積比70%匯 合時，對細(xì)胞進(jìn)行不同處理，每個處理設(shè)三個重復(fù)。第一組為pLenti-GFP病毒原液處理組待細(xì)胞生長至體積比70%匯合時將細(xì)胞 培養(yǎng)液換成ImlpLenti-GFP病毒原液，待病毒侵染12個小時后，更換新鮮的DMEM/F-12培 養(yǎng)液(DMEM/F-12培養(yǎng)液含體積比20%胎牛血清，2mmol/L谷氨酸胺，100IU/mL青霉素和 100 μ g/mL 鏈霉素)；第二組為pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液處理組待細(xì)胞生長至 體積比70%匯合時將細(xì)胞培養(yǎng)液換成Iml pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原 液，待病毒侵染12個小時后，更換新鮮的DMEM/F-12培養(yǎng)液；第三組為pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 病毒原液加 Dox (購自 Sigma 公 司)處理組待細(xì)胞生長至體積比70%匯合時將細(xì)胞培養(yǎng)液換成Iml pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液，待病毒侵染12個小時后，更換新鮮的DMEM/F-12誘導(dǎo)培養(yǎng)液 (DMEM/F-12培養(yǎng)液含1000ng/mlDox體積比20%胎牛血清，2mmol/L谷氨酸胺，100IU/mL青 霉素和100 μ g/mL鏈霉素)。提取各組細(xì)胞RNA，并收集細(xì)胞培養(yǎng)液。Real-timePCR結(jié)果顯示，GH基因在胎兒 成纖維細(xì)胞內(nèi)表達(dá)受Dox調(diào)控，第二組GH表達(dá)量是第一組的12. 98倍，而第三組GH表達(dá)量是第一組的130. 28倍。表明該真核表達(dá)系統(tǒng)受Dox嚴(yán)密調(diào)控。豬生長激素定量引物Primer9GTTCCTCAGCAGGGTCTTPr imer1OCCCGCAGGTATGTCTCA內(nèi)參基因HPRT引物Pr imer11CTGGCAAAACAATGCAAACCTPr imer12AAGCTTGCAACCTTGACCATCT
權(quán)利要求
1.慢病毒介導(dǎo)的豬生長激素PGH單質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，是由以下方法獲得的DpTRE-Tight-BI-GH表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建設(shè)計豬生長激素引物PrimerlGTGGATCCCTCAGCTCACCGGCPr imer2CAACAGAGTCGACCAGCAACTAGAA劃線部分分別為上游引物和下游引物添加的BamH I和Ml I酶切位點(diǎn)； 以豬垂體總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR程序如下94°C預(yù)變性2min，98°C變性10s，57°C復(fù)性15s，72°C延伸30s，30個循環(huán)后， 720C 5min，4°C恒溫，PCR 產(chǎn)物為 696bp ；將PCR擴(kuò)增獲得帶有BamH I和Ml I位點(diǎn)的編碼GH序列的PCR產(chǎn)物和pTRE_Tight_BI 分別用BamH I和I進(jìn)行雙酶切，再次電泳膠純化回收，測定濃度，質(zhì)粒和插入片段按摩 爾比1 3混合于4°C，T4連接酶16°C連接過夜，熱激轉(zhuǎn)化到DH5 α大腸桿菌中37°C培養(yǎng) 過夜，利用PCR和酶切篩選陽性克隆，得到含pTRE-Tight-BI-GH質(zhì)粒的菌液；2)pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 設(shè)計rtTA-Advanced片段引物 Primer3TGACCTCCATAGAAGACACCPr imer4ATGTCTAGATCTTTACTTAGTTACC劃線部分為下游引物添加的Bgl II酶切位點(diǎn)，在擴(kuò)增產(chǎn)物中47bp處包含EcoR I的酶 切位點(diǎn)，以濃度為Ing/μ 1 pTet-onAdvanced質(zhì)粒作為模板，擴(kuò)增rtTA-Advanced片段，PCR 產(chǎn)物為770bp ；將PCR擴(kuò)增獲得帶有EcoR I和Bgl II位點(diǎn)的編碼rtTA-Advanced序列的PCR產(chǎn)物和 pTRE-Tight-BI-GH分別用EcoR I和Bgl II進(jìn)行雙酶切，再次電泳凝膠純化回收，測定濃 度，質(zhì)粒和插入片段按摩爾比1 3. 5混合于4°C，T4連接酶(購自TAKARA公司)16°C連 接過夜，熱激轉(zhuǎn)化到DH5 α大腸桿菌中37°C培養(yǎng)過夜，利用PCR和酶切篩選陽性克隆，得到 含 pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 質(zhì)粒的菌液；3)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced質(zhì)粒的構(gòu)建 設(shè)計pLenti骨架引物 Primer5GCGACTTCCAGTTCAA Primer6CTAGACTAGTCTGCACCTTGTTCTTCTAT劃線部分為下游引物添加的Spe I酶切位點(diǎn)，以濃度為Ing/μ 1 PLenti6/V5-GW/lacZ 質(zhì)粒作為模板，擴(kuò)增pLenti骨架，PCR產(chǎn)物為6549bp，在擴(kuò)增產(chǎn)物中處包含McII的 酶切位點(diǎn)；設(shè)計 TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 功能片段引物Primer7CTAGACTAGTCCTGACGTCGGCAGTGAAAAPrimer8TCCCCGCGGCGACCAGCAACTAGAAGGCA劃線部分分別為上游引物和下游引物添加的Spe I和McII酶切位點(diǎn)， 以濃度為 Ing/ μ 1 pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 質(zhì)粒作為模板，擴(kuò)增 2109bp 的TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段，將產(chǎn)物瓊脂糖電泳分離、切膠回收后克隆至 PMD-19載體，熱激轉(zhuǎn)化到DH5 α大腸桿菌中37°C培養(yǎng)過夜，利用PCR和酶切篩選陽性克隆，得到含 pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advan ced 質(zhì)粒的菌液；將PCR擴(kuò)增獲得帶有Spe I和SacII酶切位點(diǎn)的pLenti質(zhì)粒骨架DNA和 pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced質(zhì)粒分別用Spe I和 c II進(jìn)行雙酶切，將產(chǎn)物瓊脂糖 電泳分離、切膠回收，測定濃度，按1 3比例混合于4°C，T4連接酶16°C連接過夜，熱激轉(zhuǎn) 化到DH5ci大腸桿菌中37°C培養(yǎng)過夜，利用PCR和Nru I酶切篩選鑒定陽性克隆，得到含ρ Lenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 質(zhì)粒的菌液；4) pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 病毒生產(chǎn)(1)轉(zhuǎn)染前一天，用Iml質(zhì)量比0.25%胰酶消細(xì)胞，按1 4的比例傳到4個 T75cm2培養(yǎng)瓶中，加入IOml不含抗生素的培養(yǎng)基，放入37°C含體積比5% CO2培養(yǎng) 箱進(jìn)行培養(yǎng)；(2)轉(zhuǎn)染當(dāng)天，待細(xì)胞達(dá)到體積比70-90%融合度時，移除培養(yǎng)液，加入6ml無抗生素的 293FT培養(yǎng)基；以一個T75cm2培養(yǎng)瓶用量為例制備DNA —脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物在一個無菌的15ml離 9μ g ViraPower Packaging Mix 3. 5 μ g pLenti-TRE-T ight-GH-rtTA-Adv anced質(zhì)粒，共12μ gDNA，加入到1. 9ml 293FT無血清無雙抗培養(yǎng)基中，輕輕混勻，待用；取 另一無菌15ml離心管，將40 μ 1的脂質(zhì)體Lipofectamine 2000加入1. 9ml 293FT無血清 無雙抗培養(yǎng)基中，輕輕吹吸混勻，迅速與上一步的混合液混合，并輕輕混勻，室溫孵育20分 鐘，以形成DNA-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物；(3)將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入培養(yǎng)瓶中，并來回輕搖以混勻，37°C培養(yǎng)6 12小時后，換 上IOml新的完全無抗生素培養(yǎng)基；(4)轉(zhuǎn)染后72小時收集含病毒的上清到無菌有蓋的15ml的尖底離心管內(nèi)；(5)40C 3000rpm離心15分鐘，以去除細(xì)胞沉淀；取上清，用0. 45 μ m濾器抽濾；抽濾過 的病毒原液經(jīng)4°C保存?zhèn)溆?，即為所獲得的慢病毒介導(dǎo)的pGH單質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 病毒。
2.權(quán)利要求1所述慢病毒介導(dǎo)的豬生長激素pGH單質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在調(diào)控生長激素 GH基因表達(dá)方面的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段在調(diào)控生長激素GH基因表 達(dá)方面的基因工程應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了慢病毒介導(dǎo)的豬生長激素單質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，可用來制備轉(zhuǎn)基因豬，屬于基因工程領(lǐng)域。豬生長激素(pGH)具有刺激骨及軟骨組織生長、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、脂類和糖類代謝的功能，能顯著提高豬的生長速度、瘦肉率和飼料報酬，但以往的轉(zhuǎn)生長激素基因動物G H在體內(nèi)表達(dá)量和表達(dá)時間不受調(diào)控，結(jié)果導(dǎo)致很多生理性的疾病，得不償失。本發(fā)明首先構(gòu)建了強(qiáng)力霉素調(diào)控的pGH雙質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，其次將雙質(zhì)粒改造為單質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，調(diào)控豬GH定時定量表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因動物中首次報道，其次將單質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中調(diào)控表達(dá)的DNA功能片段插入慢病毒載體，采用慢病毒介導(dǎo)該外源基因進(jìn)入動物細(xì)胞，提高了轉(zhuǎn)基因效率。mRNA分析表明該系統(tǒng)可以使豬的GH基因?qū)崿F(xiàn)嚴(yán)密的誘導(dǎo)表達(dá)。
文檔編號C12N15/867GK102041272SQ20101024791
公開日2011年5月4日 申請日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者劉紅林, 姜保春, 鄒曉龍 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)