專利名稱：檢測(cè)轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆及其深加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成份的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因大豆及其深加工產(chǎn)品，具體而言是一種適用于檢測(cè)轉(zhuǎn) cp4_印sps基因大豆及其深加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成份的方法及試劑盒，屬于食品安全轉(zhuǎn)基因 檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因作物自面世及大規(guī)模推廣種植以來(lái)，就以其自身的優(yōu)勢(shì)為人類社會(huì)創(chuàng)造了 巨大的經(jīng)濟(jì)效益。但轉(zhuǎn)基因作物及其加工產(chǎn)品的生物安全性隱患也是一個(gè)不可忽視的事 實(shí)。面對(duì)這把雙刃劍，世界上許多國(guó)家紛紛出臺(tái)了相應(yīng)的法律法規(guī)來(lái)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及其加 工產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識(shí)管理及安全性評(píng)價(jià)。1983年人類成功培育了世界上第一種轉(zhuǎn)基因植物——含抗生素藥類抗體的煙草。 但直到1994年，具有延熟保鮮功能的轉(zhuǎn)基因番茄才成為首例批準(zhǔn)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基 因植物。此后，轉(zhuǎn)基因作物正式走進(jìn)了大眾的視線，在全球得到了大面積推廣。1996年全 球僅有6個(gè)國(guó)家種植轉(zhuǎn)基因作物，而到2008年數(shù)量激增至25個(gè)國(guó)家；與此同時(shí)，1996年全 球轉(zhuǎn)基因作物種植面積僅有170萬(wàn)公頃，而到2008年則累計(jì)達(dá)到8億公頃(Clive James, 2008)。到目前為止，已經(jīng)有超過(guò)100種以上的轉(zhuǎn)基因植物被商業(yè)化種植，其中最廣泛的 是大豆、玉米、棉花和油菜。例如，2008年全球大豆種植面積約為九千五百萬(wàn)公頃，其中轉(zhuǎn)基 因大豆占 70%份額(Clive James, 2008) 美國(guó)孟山都公司生產(chǎn)的抗草甘膦除草劑轉(zhuǎn)基因大豆(Roundup Ready Soybean), 簡(jiǎn)稱RR大豆，是世界上最早獲準(zhǔn)進(jìn)行商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因大豆品種(1994年5月獲準(zhǔn)在美 國(guó)進(jìn)行商業(yè)化種植)。它的抗草甘膦除草劑特性是通過(guò)轉(zhuǎn)入cp4-印sps基因并正確表達(dá)而 獲得的。大豆類食品制品及相關(guān)產(chǎn)品一直以來(lái)都是為人民群眾所熱愛的?？梢灶A(yù)見，隨著 我國(guó)經(jīng)濟(jì)的進(jìn)一步發(fā)展，人民群眾生活水平的提高，大豆類食品制品及相關(guān)產(chǎn)品的需求量 必然上升。而國(guó)內(nèi)的大豆產(chǎn)量與市場(chǎng)需求間一直存在著一定的差距。自1996年開始，中國(guó) 成為大豆、豆粕和糧油的全面凈進(jìn)口國(guó)，現(xiàn)已是世界上最大的大豆進(jìn)口國(guó)。2008年中國(guó)大豆 總產(chǎn)量為1656萬(wàn)噸，而進(jìn)口量已達(dá)到驚人的3743萬(wàn)噸(羅維燕，2009)。有證據(jù)表明，2008 年，美國(guó)、阿根廷和巴西轉(zhuǎn)基因大豆的種植率分別高達(dá)91.9%、90. 4%和70. 3%，而來(lái)自美 國(guó)、巴西和阿根廷的大豆約占我國(guó)總進(jìn)口大豆份額的90% (梁克紅等，2009)。轉(zhuǎn)基因作物自面世以來(lái)，就其安全性各界一直存在著較大的爭(zhēng)議。我國(guó)于2001和 2002年相繼頒布實(shí)施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》及《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》， 以此來(lái)規(guī)范農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的監(jiān)督監(jiān)管機(jī)制。本發(fā)明不僅為轉(zhuǎn)基因大豆及其深加工產(chǎn)品中 轉(zhuǎn)基因成份的檢測(cè)提供了一種可行性高且可靠的方法，也為食品安全領(lǐng)域中的轉(zhuǎn)基因安全 性評(píng)價(jià)和標(biāo)識(shí)管理提供了有力的支撐，具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的提供一種適用于快速檢測(cè)轉(zhuǎn)cp4_印sps基因大豆及其深加工產(chǎn)品中 轉(zhuǎn)基因成份的方法及試劑盒，以克服蛋白層次檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、成本高和易受產(chǎn)品基質(zhì)影響等 缺點(diǎn)。另外，本發(fā)明以內(nèi)源基因的檢測(cè)結(jié)果為參照來(lái)驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因大豆及其深加工產(chǎn)品中外 源轉(zhuǎn)基因成份檢測(cè)結(jié)果的正確性，在一定程度上能有效避免PCR過(guò)程中的污染及假陽(yáng)性問(wèn) 題，從而能夠更有效的對(duì)檢測(cè)結(jié)果做出科學(xué)和準(zhǔn)確的判斷。本發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)一種檢測(cè)轉(zhuǎn)cp4_印sps基因大豆及其深加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成份的方法，包括提 取樣品中總DNA、PCR擴(kuò)增反應(yīng)、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其特征在于大豆內(nèi)源lectin基因上游引物為SEQ ID N。1，下游引物為SEQ ID N0 2 ；cp4-epsps基因上游引物為SEQ ID N0 :3，下游引物為SEQ ID N0 :4。在本發(fā)明中在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中，PCR反應(yīng)緩沖液、Taq DNA聚合酶、引物和DNA 之間的體積比為50 1 2 1 ；在擴(kuò)增反應(yīng)中，變性94°C 3 IOmin ；擴(kuò)增94°C 30s, 40 65°C 30s, 72°C 20 60s ；循環(huán)30 45 ；后延伸72°C IOmin0在本發(fā)明中PCR反應(yīng)緩沖液由10XPCR buffer、MgCl2、dNTP和dd H2O組成，它們 的體積比為5 3 1 41。在本發(fā)明中所述的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是指制備瓊脂糖凝膠，60 100V恒壓電 泳，30 60min。EB染色后于凝膠成像儀上觀察和拍照。在本發(fā)明中提取樣品中總DNA是指通過(guò)CTAB法、SDS法、酶裂解法、高鹽低pH法 或試劑盒法等方法提取樣品中總DNA。一種實(shí)現(xiàn)上述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的試劑盒，其特征在于包括A液、B液、C液和D液。 其中，A液為PCR反應(yīng)緩沖液，B液為Taq DNA聚合酶，C液為大豆內(nèi)源基因lectin的上游 引物和下游引物，D液為cp4_印sps基因片段的的上游引物和下游引物。所述的PCR反應(yīng) 緩沖液內(nèi)含 10XPCR Buffer、dNTPs、MgCl2 和 ddH20。在所述的試劑盒中大豆內(nèi)源lectin基因上游引物為SEQ ID N。1，下游引物為 SEQ ID N0 2 ；cp4-epsps 基因上游引物為 SEQ ID N0 :3，下游引物為 SEQ ID N0 :4。在所述的試劑盒中PCR反應(yīng)緩沖液中10XPCR buffer、MgCl2, dNTPs、dd H2O的 體積比為5 3 1 41。在所述的試劑盒中A液為50ml，B液為1ml，C液為2ml，D液為2ml。在本發(fā)明中針對(duì)lectin和cp4_印sps基因所設(shè)計(jì)的引物也可以應(yīng)用于實(shí)時(shí)熒光 定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于本發(fā)明提供了一種具有高可行性的能夠快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆及其深加工產(chǎn)品中 轉(zhuǎn)基因成份的方法及試劑盒。lectin基因是大豆的內(nèi)源基因，針對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增可表征 出實(shí)驗(yàn)樣品中是否含有大豆成份，并可對(duì)所提樣品DNA質(zhì)量作出初步的判斷。由此，本發(fā)明 不僅可以根據(jù)lectin基因PCR擴(kuò)增結(jié)果的有無(wú)來(lái)判斷樣品中是否含大豆成份，而且還可以 判斷出不同樣品中DNA提取的質(zhì)量情況。通過(guò)聯(lián)立lectin及cp4-印sps基因PCR擴(kuò)增結(jié) 果，本發(fā)明不僅對(duì)食品中轉(zhuǎn)基因成份有著高檢出率，且通過(guò)PCR檢測(cè)結(jié)果的相互印證能有
4效避免PCR過(guò)程中的污染及假陽(yáng)性問(wèn)題，從而能夠更有效的對(duì)PCR檢測(cè)結(jié)果做出科學(xué)和準(zhǔn) 確的判斷。本發(fā)明不僅為轉(zhuǎn)基因食品安全檢測(cè)提供了一種高可行性的方法，也為食品安全 領(lǐng)域中的轉(zhuǎn)基因安全性評(píng)價(jià)和標(biāo)識(shí)管理提供了有力的支撐，具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。


圖1 本發(fā)明所述PCR體系的有效性及所用引物的特異性檢測(cè)結(jié)果圖。圖中A =Iectin基因引物PCR結(jié)果；B :cp4_印sps基因引物PCR結(jié)果。圖2 用轉(zhuǎn)基因大豆制備的加工食品中轉(zhuǎn)基因成份檢測(cè)結(jié)果圖。圖中A =Iectin基因引物PCR結(jié)果；B :cp4_印sps基因引物PCR結(jié)果。圖3 自由市場(chǎng)所購(gòu)食品樣品中轉(zhuǎn)基因成份檢測(cè)結(jié)果圖。圖中A =Iectin基因引物PCR結(jié)果；B :cp4_印sps基因引物PCR結(jié)果。圖4 食用大豆油與腐乳中轉(zhuǎn)基因成份檢測(cè)結(jié)果圖。圖中A =Iectin基因引物PCR結(jié)果；B :cp4_印sps基因引物PCR結(jié)果。圖5 行標(biāo)引物對(duì)上述實(shí)驗(yàn)所購(gòu)食品樣品中轉(zhuǎn)基因成份檢測(cè)結(jié)果圖。圖中A 對(duì)應(yīng)圖1所用樣品的行標(biāo)cp4_印sps基因引物PCR結(jié)果；B 對(duì)應(yīng)圖2所用樣品的行標(biāo)cp4_印sps基因引物PCR結(jié)果；C 對(duì)應(yīng)圖3所用樣品的行標(biāo)cp4_印sps基因引物PCR結(jié)果；D 對(duì)應(yīng)圖4所用樣品的行標(biāo)cp4_印sps基因引物PCR結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1一、應(yīng)用試劑盒法(TaKaRa D9093)提取Roundup Ready大豆粉和野生型大豆粉中 總 DNA (1)稱取0. 5g左右磨碎的樣品放入Tube中，加入1. 75ml Pretreatment Buffer禾口 200 μ 15Μ Guanidinium Hydrochloride Solution，振蕩混勻后，再加入 50 μ 1 Proteinase K，顛倒混勻后，58°C保溫lh，間隔IOmin顛倒混勻；(2)室溫下 8，OOOrpm 離心 5min，取 500 μ 1 上清放入 1. 5ml Microtube 中；(3)室溫下 14，OOOrpm 離心 lOmin，取 300 μ 1 上清放入 2ml Microtube 中；(4)加入 100 μ 1 Solution I，振蕩混勻后，再加入 200 μ 1 0.2% SDS 以及 Iml Silica GelSolution，輕輕顛倒混勻 5 6min ；(5)室溫下12，OOOrpm離心30s，去上清；(6)加入 300 μ 1 IXffash Solution,充分混勻后，室溫下 12，OOOrpm 離心 30s,去
上清，重復(fù)兩次(最后一次離心3min)；(7)向沉淀中加入70°C預(yù)熱的100 μ 1 TE Buffer,混勻后，室溫靜置5min ；(8)室溫下14，OOOrpm離心3min，取上清，即為樣品DNA溶液。二、PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)緩沖液、上游引物、下游引物、DNA、Taq DNA聚合酶和dd H2O。擴(kuò)增反應(yīng)按下表進(jìn)行
權(quán)利要求
一種檢測(cè)轉(zhuǎn)cp4 epsps基因大豆及其深加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成份的方法，包括樣品中總DNA提取、PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其特征在于大豆內(nèi)源lectin基因上游引物為SEQ ID NO1，下游引物為SEQ ID NO2；cp4 epsps基因上游引物為SEQ ID NO3，下游引物為SEQ ID NO4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)轉(zhuǎn)cp4-印sps基因大豆及其深加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成份的 方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的體系為PCR反應(yīng)緩沖液、Taq DNA聚合酶、引物、DNA 之間的體積比為50 1 2 1 ；在擴(kuò)增反應(yīng)中，變性94°C 3 IOmin ；擴(kuò)增94°C 30s， 40 65°C 30s, 72°C 20 60s ；循環(huán)30 45 ；后延伸72°C IOmin ；所述Taq DNA聚合酶的濃度為3 IOU/μ 1，所述引物的濃度為15 40 μ Μ。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)轉(zhuǎn)cp4-印sps基因大豆及其深加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成份的 方法，其特征在于PCR反應(yīng)緩沖液由10XPCR buffer、MgCl2、dNTPs和dd H2O組成，它們的 體積比為5 3 1 41 ；所述MgCl2的濃度為15 35mM，所述dNTPs的濃度為5 15mM each。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的檢測(cè)轉(zhuǎn)cp4-印sps基因大豆及其深加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成份 的方法，其特征在于PCR擴(kuò)增反應(yīng)后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；所述的瓊脂糖凝膠電泳檢 測(cè)是指制備瓊脂糖凝膠，60 100V恒壓電泳，30 60min ；EB染色后于凝膠成像儀上觀察 和拍照。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)轉(zhuǎn)cp4-印sps基因大豆及其深加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成份的 方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)為Real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5之一所述的檢測(cè)轉(zhuǎn)cp4-印sps基因大豆及其深加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基 因成份的方法，其特征在于樣品中總DNA是指通過(guò)CTAB法，或SDS法，或酶裂解法，或高鹽 低PH法，或試劑盒法提取。
7.一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1 3之一所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的試劑盒，其特征在于包括A液、 B液、C液和D液；其中，A液為PCR反應(yīng)緩沖液，B液為Taq DNA聚合酶，C液為大豆內(nèi)源 lectin基因上游引物和下游引物，D液為cp4_印sps基因上游引物和下游引物；所述的PCR 反應(yīng)緩沖液內(nèi)含 10XPCR Buffer、dNTPs、MgCl2 和 ddH20。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的試劑盒，其特征在于所述的大豆內(nèi)源lectin 基因上游引物為SEQ ID N。1，下游引物為SEQ ID N。2 ;cp4_印sps基因上游引物為SEQ ID N0 :3，下游引物為SEQ ID N0 :4。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的試劑盒，其特征在于所述的PCR反應(yīng)緩沖液 中 10XPCR buffer、MgCl2、dNTPs、dd H2O 的體積比為 5 3 1 41。
10.根據(jù)權(quán)利要求7 9之一所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的試劑盒，其特征在于A液為50ml，B 液為lml, C液為2ml, D液為2ml。
全文摘要
本發(fā)明是一種適用于檢測(cè)加工食品中轉(zhuǎn)cp4-epsps基因成份的方法及試劑盒。具體方法樣品DNA提??；PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其中PCR擴(kuò)增的兩對(duì)引物為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2；SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。所述試劑盒包括A液PCR反應(yīng)緩沖液；B液Taq DNA聚合酶；C液大豆內(nèi)源lectin基因的上游引物和下游引物SEQ ID NO1和SEQ ID NO2；D液為cp4-epsps基因的上游引物和下游引物SEQ ID NO3，下游引物為SEQ ID NO4。本發(fā)明對(duì)加工食品中轉(zhuǎn)基因成份檢出率高，能有效避免污染與假陽(yáng)性等問(wèn)題，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值高。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101935701SQ201010249480
公開日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月10日
發(fā)明者何健, 吳洪洪, 周光宏, 周興虎, 徐晟 , 沈文飚, 肖笑, 謝彥杰, 黃明 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)