專利名稱：一種富含釀酒酵母的葡甘露低聚糖飼料添加劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種富含釀酒酵母的葡甘露低聚糖飼料添加劑的制備方法，屬于應(yīng)用 微生物飼料添加劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)今動(dòng)物生產(chǎn)的經(jīng)營(yíng)方式已經(jīng)從供給消費(fèi)者所能生產(chǎn)的動(dòng)物產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)消 費(fèi)者想要的動(dòng)物產(chǎn)品上來(lái)，越來(lái)越多的消費(fèi)者希望不使用促生長(zhǎng)抗生素的產(chǎn)品。主要是擔(dān) 心使用抗生素來(lái)提高動(dòng)物產(chǎn)品的產(chǎn)量和飼料利用效率最終會(huì)導(dǎo)致人產(chǎn)生對(duì)抗生素的耐藥 性。為了保證消費(fèi)者的要求，政府正在通過(guò)立法嚴(yán)格限制或完全禁止使用促生長(zhǎng)抗生素。歐 盟經(jīng)過(guò)激烈的辯論，關(guān)于在動(dòng)物飼料中添加四種抗生素的禁令已經(jīng)生效。美國(guó)的食品和藥 物管理署正考慮在食用動(dòng)物的生產(chǎn)中限制使用飼料級(jí)抗生素。如何尋找抗生素的替代品已 是各國(guó)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家最為關(guān)注的問(wèn)題。其中具有作為抗生素替代品潛力的天然飼料添加劑 葡甘露低聚糖已逐漸被各國(guó)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家關(guān)注。大量研究表明，葡甘露低聚糖提供的富含 甘露糖的吸附源能結(jié)合細(xì)菌，避免它們吸附在腸壁上，能與被吸附的病原菌一起通過(guò)腸道， 防止它們?cè)谀c道內(nèi)集結(jié)；葡甘露低聚糖具有免疫原性，刺激機(jī)體免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作 用，減緩抗原的吸收，增加抗原的效價(jià)，從而增強(qiáng)動(dòng)物體的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)；葡甘露低 聚糖能調(diào)控動(dòng)物的胃腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)和繁殖，抑制有害物質(zhì)在腸道的 粘附和定植，維持正常的腸道群。葡甘露低聚糖在提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能的同時(shí)，作為一種天 然的飼料添加劑，不會(huì)帶來(lái)污染、耐藥性和殘留等問(wèn)題，作為抗生素飼料添加劑的替代品， 將有廣闊的應(yīng)用前景。釀酒酵母用作飼料補(bǔ)充料可促進(jìn)反芻動(dòng)物生長(zhǎng)，隨著畜牧業(yè)的日益 發(fā)展，酵母菌被開(kāi)發(fā)成多種形式的產(chǎn)品，目前飼料酵母作為良好的蛋白原料被應(yīng)用于各種 動(dòng)物。葡甘露聚糖是魔芋塊莖的主要成分，目前，雖然研究者對(duì)如何從魔芋精粉中酶法 提取甘露寡糖的制備方法進(jìn)行了研究，但由于酶解需要的β -甘露聚糖酶活力較低，生產(chǎn) 成本高，不能大規(guī)模的用作飼料添加劑，而且生產(chǎn)的葡甘露寡糖需要經(jīng)過(guò)后續(xù)精制，工藝繁 瑣，沒(méi)有充分利用酶解過(guò)后所產(chǎn)生的葡萄糖和甘露糖，同時(shí)生產(chǎn)甘露寡糖和釀酒酵母，將其 應(yīng)用于飼料添加劑領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是，利用魔芋精粉這種富含葡甘露聚糖的廉價(jià)原料，應(yīng)用微生物酶工 程技術(shù)，酶法生產(chǎn)甘露寡糖，然后利用釀酒酵母對(duì)葡甘露低聚糖生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的葡萄糖 和甘露糖進(jìn)行發(fā)酵，最后將發(fā)酵液冷凍干燥，得到即含葡甘露低聚糖又含釀酒酵母的新型 的飼料添加劑，應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，替代抗生素，具有優(yōu)良效果。本發(fā)明的方法通過(guò)對(duì)現(xiàn)有 過(guò)程中的一些方法和實(shí)驗(yàn)參數(shù)加以改進(jìn)，可以不需要購(gòu)買額外昂貴的化學(xué)試劑就可以進(jìn)行 大規(guī)模的工廠化生產(chǎn)，節(jié)約了成本，提高了生產(chǎn)效率；同時(shí)化學(xué)添加試劑的減少增強(qiáng)了飼料 的環(huán)保作用，降低這些化學(xué)試劑對(duì)動(dòng)物可能存在潛在的不利影響，本發(fā)明幾乎用純生物制作工藝完成，幾乎不會(huì)對(duì)動(dòng)物體產(chǎn)生不利的影響。本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)。一方面，本發(fā)明提供一種動(dòng)物飼料添加劑，它包括質(zhì)量含量大于20%以上的葡 甘露低聚糖；5X105cfu/g以上的釀酒酵母。另一方面，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)富含釀酒酵母的葡甘露低聚糖飼料添加劑的制備 方法，該方法包括以下步驟(a)、黑曲霉MA-56酸性β -甘露聚糖酶粗酶液的制備稱取固體酶樣1份，加入 16-20份蒸餾水，40-50°C水浴抽提1-池，過(guò)濾，得到酸性β -甘露聚糖酶粗酶液，適當(dāng)稀釋， 使酶活力達(dá)100IU/mL。其中酸性β-甘露聚糖酶固體酶的制備可采用已有技術(shù)，如2009年 7月15日公開(kāi)的CN101481674A說(shuō)明書(shū)第5頁(yè)。該專利作為全部應(yīng)用作為本發(fā)明的一部分。 黑曲霉(Aspergillus niger)菌株MA-56，本申請(qǐng)人于2008年10月M日保藏于北京市朝 陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 保藏號(hào)為 CGMCC No. 2722。(b)、魔芋精粉酶解液的獲得，它包括以下步驟(1)、pH3. 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的配制稱取磷酸氫二鈉21. 74g，檸檬酸 14. 63g，加入800mL蒸餾水加熱溶解，最后用容量瓶定容至1000mL。(2)、魔芋精粉水溶液的配制將步驟(1)的緩沖液加熱到50-60°C，加入魔芋精粉 (過(guò)40-140目篩)配制100-180g/L的魔芋精粉溶液，期間用高速攪拌機(jī)100-120r/min不 斷攪拌，避免魔芋精粉結(jié)成包塊。(3)、葡甘露低聚糖酶解樣品的制備將β -甘露聚糖酶粗酶液加入步驟O)的魔 芋精粉溶液，加酶量為30-40IU/g魔芋精粉，酶解水浴溫度為50-65°C，酶解時(shí)間為4_6h。獲 得魔芋精粉酶解液。酶解過(guò)后，酶解液的糖中既含有20-25%的葡萄糖和甘露糖單糖，也含 有75-80%葡甘露低聚糖。(c)、釀酒酵母發(fā)酵液的獲得。釀酒酵母于2010年7月購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種 保藏管理中心，保藏編號(hào)CICC31015。它包括以下各級(jí)培養(yǎng)基的配制①斜面種子培養(yǎng)基去皮馬鈴薯200g/L，蔗糖20g/L，瓊脂20g/L，自然pH，經(jīng) 0. IMpa 滅菌 20min ；②釀酒酵母斜面種子制備將釀酒酵母劃線接種在步驟(4)①斜面種子培養(yǎng)基 上，于下恒溫培養(yǎng)5d后，放置4°C冰箱內(nèi)保存，備用；(d)、發(fā)酵培養(yǎng)。包括以下步驟；①酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)基的制備將步驟(b)中獲得的魔芋粉酶解液不添加任何其他 營(yíng)養(yǎng)成分，自然pH，經(jīng)0. IMpa滅菌20min。②酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)將步驟②中斜面種子用無(wú)菌蒸餾水制備成濃度為IXlO7-IO8 個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液，按2-5% (ν/ν)接種比例接入③中的菌種發(fā)酵培養(yǎng)基中，置搖床 200r/min，培養(yǎng)時(shí)間 16h。(e)、冷凍干燥制成成品將步驟(d)得到的發(fā)酵液裝入淺盤中，用保鮮膜封口， 置_70°C冰箱預(yù)冷2h，于托盤式冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48h。最后，把富含釀酒酵母的葡甘 露低聚糖樣品經(jīng)高壓液相色譜檢測(cè)和菌落計(jì)數(shù)，將葡甘露低聚糖含量達(dá)到20%以上，釀酒 酵母5X105cfu/g以上的樣品包裝、封口即成本發(fā)明產(chǎn)品。
在一個(gè)優(yōu)選的方式中，還可以在步驟(d)后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行薄層層析檢測(cè)以葡萄 糖做為標(biāo)準(zhǔn)品，將魔芋精粉酶解液經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵前后的樣品進(jìn)行薄層層析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未 經(jīng)過(guò)發(fā)酵的樣品中的葡萄糖和甘露糖等單糖經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵后幾乎已被酵母菌利用完全， 發(fā)酵后的樣品中糖類為100%的葡甘露低聚糖。本發(fā)明的有益效果是(1)集酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)于一體，發(fā)明產(chǎn)品具有活菌制劑和雙岐因子的 雙重功能。葡甘露低聚糖含量20-25%，釀酒酵母菌含量5-6X105cfu/g。(2)釀酒酵母的發(fā)酵，直接利用魔芋粉酶解液，即充分利用了酶解過(guò)程產(chǎn)生的單 糖，又提高了葡甘露低聚糖的含量，還可以使產(chǎn)品中富含釀酒酵母活菌。(3)另外，整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程無(wú)需添加其他價(jià)格昂貴的試劑，使生產(chǎn)成本較低；特別適 合大規(guī)模生產(chǎn)。在本發(fā)明的方法中，特別在制備酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)基的步驟中，不需要添加其 它價(jià)格昂貴的輔助化學(xué)成分就可以獲得純度較高的制備葡甘露低聚糖，同時(shí)除去產(chǎn)品中的 單糖。(4)同時(shí)，冷凍干燥出來(lái)的產(chǎn)品可作為飼料添加劑直接添加使用，無(wú)需增加后提取 工藝，更進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本。


圖1為葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，將葡甘露低聚糖酶解液經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵前后的樣品進(jìn)行薄 層層析圖，其中ι為葡萄糖樣品；2為發(fā)酵前樣品；3為發(fā)酵后樣品。
具體實(shí)施例方式通過(guò)以下具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的具體說(shuō)明，但應(yīng)該理解本發(fā)明并不受這些內(nèi)容所限止。實(shí)施例1 β -甘露聚糖酶粗酶液的生產(chǎn)制備本例β -甘露聚糖酶按以下步驟制備(1)黑曲霉菌株 MA_56 (黑曲霉(Aspergillus niger)菌株 MA-56，于 2008 年 10 月24日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo. 2722)各級(jí)培養(yǎng)基的配制包括，①斜面種子培養(yǎng)基去皮馬鈴薯200g/l，蔗糖20g/l，瓊脂20g/l，自然pH，經(jīng) 0. IMpa 滅菌 20min ；②固體種子培養(yǎng)基300ml三角瓶中裝入由麩皮、豆粕和魔芋粉按重量份 80 19 1比例配制而成的培養(yǎng)基10g，按與固形物重量1 1比例加入自來(lái)水，攪拌均 勻，經(jīng) 0. IMpa 滅菌 30min ；③固體生產(chǎn)培養(yǎng)基先將麩皮、豆粕和魔芋粉按重量份75 23 3比例配制成 固體培養(yǎng)基；再將該固體培養(yǎng)基與水按重量1 1.3比例加水并攪拌均勻裝入布袋中，經(jīng) 0. IMpa滅菌30min，冷卻后均勻置于曲盤中，發(fā)酵物料厚度為2-3cm ；(2)斜面種子制備將黑曲霉菌株MA-56劃線接種在步驟(1)①斜面種子培養(yǎng)基 上，于觀°C下恒溫培養(yǎng)5d后，放置4°C冰箱內(nèi)保存，備用；(3)固體種子制備將步驟( 斜面種子用無(wú)菌蒸餾水制備成濃度為IXlO7-IO8 個(gè)/ml的孢子懸浮液后，吸取2ml接入步驟(1)②固體種子培養(yǎng)基中，于下恒溫培養(yǎng)3d，再與無(wú)菌蒸餾水按重量1 100比例攪拌混合后，用雙層紗布在無(wú)菌條件下過(guò)濾，得到 濃度為IX IO7-IO8個(gè)/ml固體種子孢子懸浮液，待用；(4)發(fā)酵生產(chǎn)將步驟(3)固體種子孢子懸浮液與步驟(1)③固體生產(chǎn)培養(yǎng)基按 重量份20 100比例混合均勻后，置曲房中發(fā)酵培養(yǎng)5 得飼用β-甘露聚糖酶酶 曲；(5)酶曲的后處理與質(zhì)量檢測(cè)將步驟(4)酶曲置40°C鼓風(fēng)條件下烘干10h、粉 碎、過(guò)80目篩，得酶干曲；將經(jīng)飼用β-甘露聚糖酶活力檢測(cè)達(dá)到IX IO5-L 3 X 105U/g的酶 干曲包裝、封口即成產(chǎn)品。(6)稱取步驟(5)中的固體酶樣1份，加入18份蒸餾水，45°C水浴抽提池，板框過(guò)濾，得到酸性β-甘露聚糖酶粗酶液，適當(dāng)稀釋，使酶活力達(dá)100IU/mLo實(shí)施例2 富含釀酒酵母的葡甘露低聚糖的生產(chǎn)制備1本例富含釀酒酵母的葡甘露低聚糖按以下步驟制備(1)ρΗ3. 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的配制稱取磷酸氫二鈉21. 74g，檸檬酸 14. 63g，加入800mL蒸餾水加熱溶解，最后用容量瓶定容至1000mL。(2)魔芋精粉水溶液的配制將步驟(1)的緩沖液加熱到50°C，加入魔芋精粉配制 100g/L的魔芋精粉溶液，期間用高速攪拌機(jī)lOOr/min不斷攪拌，避免魔芋精粉結(jié)成包塊。(3)葡甘露低聚糖酶解樣品的制備將β -甘露聚糖酶粗酶液(實(shí)施例1中的步 驟6獲得的)加入步驟O)的魔芋精粉溶液，加酶量為30IU/g魔芋精粉，酶解水浴溫度為 50 0C，酶解時(shí)間為4h。酶解過(guò)后，經(jīng)高壓液相色譜檢測(cè)，酶解液?jiǎn)翁侵泻?1 %的葡萄糖和 甘露糖，79%的葡甘露低聚糖(質(zhì)量百分比)。(4)釀酒酵母(釀酒酵母于2010年7月購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心， 保藏編號(hào)CICC310M)各級(jí)培養(yǎng)基的配制包括，①斜面種子培養(yǎng)基去皮馬鈴薯200g/L，蔗 糖20g/L，瓊脂20g/L，自然pH，經(jīng)0. IMpa滅菌20min ；②菌種發(fā)酵培養(yǎng)基魔芋精粉酶解液 不添加任何其他營(yíng)養(yǎng)成分，自然PH，經(jīng)0. IMpa滅菌20min。(5)釀酒酵母斜面種子制備將釀酒酵母劃線接種在步驟(4)①斜面種子培養(yǎng)基 上，于觀 30°C下恒溫培養(yǎng)5d后，放置4°C冰箱內(nèi)保存，備用。(6)酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)將步驟( 斜面種子用無(wú)菌蒸餾水制備成濃度為1 X IO7個(gè) /ml的細(xì)胞懸浮液，按2% (ν/ν)接種比例接入(4)②中，置搖床200r/min，培養(yǎng)時(shí)間 16h。(7)薄層層析檢測(cè)以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，將葡甘露低聚糖酶解液經(jīng)釀酒酵母發(fā) 酵前后的樣品進(jìn)行薄層層析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品中的單糖經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵后已基本利用完全， 樣品中為100%的葡甘露低聚糖。(見(jiàn)圖1 ;1為葡萄糖樣品；2為發(fā)酵前樣品；3為發(fā)酵后 樣品)(8)冷凍干燥制成成品將步驟(6)得到的發(fā)酵液裝入淺盤中，用保鮮膜封口， 置_70°C冰箱預(yù)冷2h，于托盤式冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48h。最后，把富含釀酒酵母的葡甘 露低聚糖樣品經(jīng)高壓液相色譜檢測(cè)和菌落計(jì)數(shù)，獲得的葡甘露低聚糖含量為20% (質(zhì)量百 分比)，釀酒酵母菌含量5. 2X105cfu/g的樣品包裝、封口即成本發(fā)明產(chǎn)品。實(shí)施例3 富含釀酒酵母的葡甘露低聚糖的生產(chǎn)制備)
其余工藝步驟按實(shí)施例2 ；本例中與實(shí)施例2中的不同在于步驟( 魔芋精粉水溶液的配制將步驟(1)的緩沖液加熱到60°C，加入魔芋精 粉配制180g/L的魔芋精粉溶液，期間用高速攪拌機(jī)120r/min不斷攪拌，避免魔芋精粉結(jié)成 包塊。步驟( 葡甘露低聚糖酶解樣品的制備將β -甘露聚糖酶粗酶液加入步驟(2) 的魔芋精粉溶液，加酶量為40IU/g魔芋精粉，酶解水浴溫度為65°C，酶解時(shí)間為他。酶解 過(guò)后，酶解液?jiǎn)翁侵泻?3%的葡萄糖和甘露糖，77%的葡甘露低聚糖。步驟(6)酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)將步驟(5)斜面種子用無(wú)菌蒸餾水制備成濃度為 IX IO8個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液，按5% (ν/ν)接種比例接入(4)②中，置搖床200r/min， 培養(yǎng)時(shí)間16h。最后經(jīng)過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)25%的葡萄糖和甘露糖全部轉(zhuǎn)換成葡甘露低聚糖。最后獲得的混合物質(zhì)中葡甘露低聚糖含量為23% (質(zhì)量百分比)，釀酒酵母菌含 量為 6. 0X105cfu/go實(shí)施例4 富含釀酒酵母的葡甘露低聚糖的生產(chǎn)制備其余工藝步驟按實(shí)施例2 ；本例中與實(shí)施例2中的不同在于步驟( 魔芋精粉水溶液的配制將步驟(1)的緩沖液加熱到55°C，加入魔芋精 粉配制140g/L的魔芋精粉溶液，期間用高速攪拌機(jī)120r/min不斷攪拌，避免魔芋精粉結(jié)成 包塊。步驟( 葡甘露低聚糖酶解樣品的制備將β -甘露聚糖酶粗酶液加入步驟(2) 的魔芋精粉溶液，加酶量為40IU/g魔芋精粉，酶解水浴溫度為65°C，酶解時(shí)間為他。酶解 過(guò)后，酶解液?jiǎn)翁侵泻?5%的葡萄糖和甘露糖，75%的葡甘露低聚糖。步驟(6)酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)將步驟(5)斜面種子用無(wú)菌蒸餾水制備成濃度為 IX IO8個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液，按5% (ν/ν)接種比例接入(4)②中，置搖床200r/min， 培養(yǎng)時(shí)間16h。最后經(jīng)過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)25%的葡萄糖和甘露糖全部轉(zhuǎn)換成葡甘露低聚糖。最后獲得的混合物質(zhì)中葡甘露低聚糖含量為23%，釀酒酵母菌含量為 5. 0X105cfu/g。
權(quán)利要求
1.一種動(dòng)物飼料添加劑，其特征在于，它包括質(zhì)量含量大于20%以上的葡甘露低聚 糖；5X105cfu/g以上的釀酒酵母。
2.如權(quán)利要求1所述的飼料添加劑，其特征在于，所述的葡甘露低聚糖的質(zhì)量含量大 于 25%。
3.—種生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的飼料添加劑，包括以下方法(a)、制備酶活力100IU/mL的黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶粗酶液(b)、魔芋粉酶解液的制備，它包括以下步驟(1)ρΗ3.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液 的配制稱取磷酸氫二鈉21. 74g，檸檬酸14. 63g，加入SOOmL蒸餾水加熱溶解，最后用容量 瓶定容至IOOOmL ；⑵魔芋粉水溶液的配制將步驟(1)的緩沖液加熱到50-60°C，加入魔 芋粉配制100-180g/L的魔芋粉溶液，期間用高速攪拌機(jī)100-120r/min不斷攪拌，避免魔芋 粉結(jié)成包塊；C3)葡甘露低聚糖酶解樣品的制備將步驟(a)中的甘露聚糖酶粗酶液加 入步驟( 的魔芋粉溶液，加酶量為30-40IU/g魔芋粉，酶解水浴溫度為50-65°C，酶解時(shí)間 為 4-6h ；(c)、酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)基的制備將步驟(b)中獲得的魔芋粉酶解液不添加任何其他營(yíng) 養(yǎng)成分，自然PH，經(jīng)0. IMpa滅菌20min ；(d)、將酵母菌種子用無(wú)菌蒸餾水制備成濃度為IXIO7-IO8個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液，按 2-5% (ν/ν)接種比例接入(c)中的菌種發(fā)酵培養(yǎng)基中，置搖床200r/min，培養(yǎng)時(shí)間 16h ；(e)、冷凍干燥制成成品將步驟(d)得到的發(fā)酵液裝入淺盤中，用保鮮膜封口， 置-70°C冰箱預(yù)冷2h，于托盤式冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48h ；最后，把富含釀酒酵母的葡甘露低聚糖樣品經(jīng)高壓液相色譜檢測(cè)和菌落計(jì)數(shù)，將葡甘 露低聚糖含量達(dá)到20%以上，釀酒酵母5X105cfu/g以上的樣品包裝、封口即成明產(chǎn)品。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中黑曲霉為包藏號(hào)為CGMCC2722的菌株。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中酵母菌為保藏編號(hào)CICC31015的菌株。
6.如權(quán)利要求1-5之一所述的方法，其中，步驟(a)還包括以下步驟(1)、黑曲霉各級(jí)培養(yǎng)基的配制包括，①斜面種子培養(yǎng)基去皮馬鈴薯200g/l，蔗糖 20g/l，瓊脂20g/l，自然pH，經(jīng)0. IMpa滅菌20min ；②固體種子培養(yǎng)基300ml三角瓶中裝入 由麩皮、豆粕和魔芋粉按重量份80 19 1比例配制而成的培養(yǎng)基10g，按與固形物重量 1 1比例加入自來(lái)水，攪拌均勻，經(jīng)0. IMpa滅菌30min;③固體生產(chǎn)培養(yǎng)基先將麩皮、豆 粕和魔芋粉按重量份75 23 3比例配制成固體培養(yǎng)基；再將該固體培養(yǎng)基與水按重量 1 1.3比例加水并攪拌均勻裝入布袋中，經(jīng)0. IMpa滅菌30min，冷卻后均勻置于曲盤中， 發(fā)酵物料厚度為2-3cm ；O)、斜面種子制備將黑曲霉菌株MA-56劃線接種在步驟(1)①斜面種子培養(yǎng)基上，于下恒溫培養(yǎng)5d后，放置4°C冰箱內(nèi)保存，備用；(3)、固體種子制備將步驟( 斜面種子用無(wú)菌蒸餾水制備成濃度為IXlO7-IO8A/ ml的孢子懸浮液后，吸取2ml接入步驟(1)②固體種子培養(yǎng)基中，于下恒溫培養(yǎng)3d，再 與無(wú)菌蒸餾水按重量1 100比例攪拌混合后，用雙層紗布在無(wú)菌條件下過(guò)濾，得到濃度為 1 X IO7-IO8個(gè)/ml固體種子孢子懸浮液，待用；份20 100比例混合均勻后，置曲房中發(fā)酵培養(yǎng)5 得飼用β-甘露聚糖酶酶曲；(5)、酶曲的后處理與質(zhì)量檢測(cè)將步驟(4)酶曲置40°C鼓風(fēng)條件下烘干10h、粉碎、過(guò) 80目篩，得酶干曲；將經(jīng)飼用β-甘露聚糖酶活力檢測(cè)達(dá)到IX IO5-L 3 X 105U/g的酶干曲 包裝、封口即成產(chǎn)品；(6)、稱取固體酶樣1份，加入18份蒸餾水，45°C水浴抽提池，板框過(guò)濾，得到酸性 β -甘露聚糖酶粗酶液，適當(dāng)稀釋，使酶活力達(dá)100IU/mL。
全文摘要
本發(fā)明提供一種動(dòng)物飼料添加劑，其特征在于，它包括質(zhì)量含量大于20％以上的葡甘露低聚糖；5×105cfu/g以上的釀酒酵母。在一個(gè)優(yōu)選的方式中，所述的葡甘露低聚糖的質(zhì)量含量大于25％。同時(shí)本發(fā)明一種生產(chǎn)富含釀酒酵母的葡甘露低聚糖飼料添加劑的制備方法。本發(fā)明集酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)于一體，發(fā)明產(chǎn)品具有活菌制劑和雙岐因子的雙重功能，同時(shí)該方法生產(chǎn)成本低廉、簡(jiǎn)單；另外采用冷凍干燥出來(lái)的產(chǎn)品可作為飼料添加劑直接添加使用，無(wú)需增加后提取工藝，更進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12P19/14GK102048029SQ20101025143
公開(kāi)日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2010年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月10日
發(fā)明者李艷麗, 柳永, 許少春, 許堯興 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院