專利名稱：瓊脂平板篩選降解林可霉素好氧細(xì)菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及林可霉素降解菌的篩選，具體的說是一種以固體培養(yǎng)方式，在瓊脂平 板中篩選降解林可霉素好氧細(xì)菌的方法。
背景技術(shù)：
抗生素生產(chǎn)廢水、廢渣有微量抗生素殘留，具有長期殘留性、生物蓄積性，易引起 耐藥性并存在各種安全隱患。微生物在治理環(huán)境污染中扮演著重要的角色，是抗生素在環(huán) 境中降解的重要途徑之一。微生物降解已廣泛應(yīng)用于抗生素廢水的治理，但利用微生物治 理抗生素廢渣的研究較少，林可霉素生產(chǎn)廢渣的降解菌研究更是尚未見報(bào)道。從自然界中分離篩選微生物菌株，主要包括采樣、純種分離、篩選等幾個(gè)步驟，通 常純種分離是在瓊脂平板中進(jìn)行，而篩選是在接種搖瓶進(jìn)行。具體地說，瓊脂平板的主要作 用是分離微生物菌株，對(duì)微生物菌株進(jìn)行定性，接種搖瓶的主要作用是對(duì)微生物菌株的生 產(chǎn)性能或降解性能進(jìn)行定量，從而篩選出最優(yōu)菌株。篩選出降解林可霉素的好氧細(xì)菌，其主要目的是用于降解廢渣中林可霉素殘留， 在后期的應(yīng)用中宜采用固體培養(yǎng)的方式，若采用液體培養(yǎng)的方式，存在設(shè)備投資大、耗水量 大，產(chǎn)生二次污染等問題。基于降解林可霉素的好氧細(xì)菌在后期應(yīng)用的考慮，降解林可霉素 的好氧細(xì)菌篩選不宜在接種搖瓶中進(jìn)行，而應(yīng)在瓊脂平板，通過固體培養(yǎng)的方式進(jìn)行。綜上，本發(fā)明提供一種以固體培養(yǎng)方式，在瓊脂平板中篩選降解林可霉素好氧細(xì) 菌的方法，為實(shí)現(xiàn)利用微生物降解林可霉素生產(chǎn)廢渣中的抗生素殘留，開發(fā)廢渣生產(chǎn)飼料、 有機(jī)肥等奠定基礎(chǔ)，為抗生素降解菌的篩選提供一定參考。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種采用固體培養(yǎng)方式，以瓊脂平板篩選降解林可霉素好 氧細(xì)菌的方法，具體步驟如下(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基瓊脂平板的制備按下列濃度配制培養(yǎng)基，K2HP041. Og/L, KH2P04 0. 2g/L, MgS04 7H20 0. 2g/L, CaCl2 2H20 0. 04g/L, FeCl3 6H200. 005g/L, NH4N03 0. 25g/ L，瓊脂15 20g/L，于121 °C滅菌15min，以10ml/個(gè)培養(yǎng)皿分裝培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻凝固 后在其表面均勻添加一定量的林可霉素水溶液，靜置至表面干燥即可；(2)瓊脂中林可霉素測定方法采用酸溶加熱的方式溶解瓊脂平板，通過紫外分 光光度法測定林可霉素含量，對(duì)瓊脂平板中林可霉素進(jìn)行定量分析，為林可霉素降解菌的 篩選奠定基礎(chǔ)；(3)樣品采集采集林可霉素生產(chǎn)廢渣堆放處的土壤，利用無菌水配制成土壤稀 釋液用于菌種的分離；(4)菌種分離取0. 2mL 土壤稀釋液涂布含0. 015g林可霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基瓊脂平 板，30°C下培養(yǎng)5天，經(jīng)稀釋涂布分離單菌落，獲得能夠以林可霉素為唯一碳源和能源生長 的菌株并保存試管中；
(5)菌種篩選無菌水將分離得到的菌株配成菌懸液，0D值0. 8，取0. 2mL涂布含 0. 02g林可霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基瓊脂平板中，以不接種的相同平板為空白對(duì)照，在30°C培養(yǎng)7 天后，在優(yōu)化得到的最佳酸溶解工藝條件下測定樣品，并根據(jù)線性回歸方程測定出瓊脂平 板中林可霉素的含量，以林可霉素降解率為指標(biāo)，篩選林可霉素降解菌。所述步驟(2)酸溶加熱的條件為鹽酸濃度1. 14mol/L，加鹽酸量3mL，加熱時(shí)間 70s。所述步驟(2)測定瓊脂平板中林可霉素的標(biāo)準(zhǔn)方程為y = 0. 01533+0. 00299x, 其中x表示林可霉素濃度(ug/ml)，y表示吸光值，方程的相關(guān)系數(shù)r = 0.99935，濃度范 圍為0 250ug/mL，待測定的樣品在靜置30min后，該方法測定是穩(wěn)定的，在30 120min 內(nèi)，RSD為0. 13756%，精密度的RSD為0. 2654%，重復(fù)性的RSD為0. 4328%，樣品回收率 94. 8858%。該瓊脂平板篩選降解林可霉素好氧細(xì)菌的方法是從林可霉素生產(chǎn)廢渣堆放處的 土壤取樣，通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加一定量林可霉素，以稀釋涂布分離單菌落，獲得能夠以 林可霉素為唯一碳源和能源生長的菌株。目前，林可霉素的定量測定有紫外分光光度法、高 效液相色譜法和旋光法等，這些方法均需要林可霉素樣品為液態(tài)。而瓊脂平板中林可霉素 的樣品為固態(tài)，瓊脂在100°c時(shí)才融化，在常溫下瓊脂很快會(huì)固化，因此，瓊脂平板中林可霉 素含量難以進(jìn)行定量分析。發(fā)明采用酸溶加熱的方式處理瓊脂平板，利用紫外分光光度法 測定瓊脂平板中林可霉素含量，優(yōu)化了酸溶加熱工藝并對(duì)瓊脂中林可霉素的測定方法進(jìn)行 了考察。利用已建立的瓊脂平板中林可霉素測定方法，發(fā)明采用固體培養(yǎng)方式，考察分離得 到的各菌株在瓊脂平板中的林可霉素降解率，篩選菌株。在瓊脂平板中篩選林可霉素降解 菌的技術(shù)，具有操作方便、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。下面通過實(shí)驗(yàn)來加以說明(1)瓊脂平板中林可霉素測定研究①酸溶加熱條件的優(yōu)化在含10mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的瓊脂平板表面添加0. 5ml濃度為40mg/mL的林可霉素 水溶液，待表層干燥后，添加一定體積和濃度的鹽酸，水浴加熱溶化一定時(shí)間，溶液定容體 積至15mL,靜止12h，在10000r/min條件下離心15min后，取上清液1. 5mL,加0. 5mL濃 度0. 02mol/L氯化鈀溶液，以lmol/L鹽酸定容為10mL混合均勻后，靜止lOmin，測定其在 380nm處的吸光強(qiáng)度，記為~。以不含瓊脂的10ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液加0. 5ml濃度為40mg/ mL的林可霉素水溶液為空白對(duì)照，同上處理，測定其在380nm處的吸光強(qiáng)度，記為A。。以式 (1)計(jì)算相對(duì)回收率相對(duì)回收率(％) = A/AoX 100% (式 1)設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方案(見表1)研究工藝參數(shù)鹽酸濃度、酸加量及加熱時(shí)間 對(duì)測定瓊脂平板中林可霉素含量的影響，以相對(duì)回收率為指標(biāo)，確定最佳工藝組合。表1實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼表1
— -10 1 一X,鹽酸濃度/mol/L(15L01.5
X2酸加量/mL 1 3 5 X,加熱時(shí)間/min1. 0L5_2.0
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表2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果表權(quán)利要求
一種瓊脂平板篩選降解林可霉素好氧細(xì)菌的方法，其特征在于按下述步驟制備(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基瓊脂平板的制備按下列濃度配制培養(yǎng)基，K2HPO4 1.0g/L，KH2PO4 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，CaCl2·2H2O 0.04g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.005g/L，NH4NO3 0.25g/L，瓊脂15～20g/L，于121℃滅菌15min，以10ml/個(gè)培養(yǎng)皿分裝培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻凝固后在其表面均勻添加一定量的林可霉素水溶液，靜置至表面干燥即可；(2)瓊脂中林可霉素測定方法采用酸溶加熱的方式溶解瓊脂平板，通過紫外分光光度法測定林可霉素含量，對(duì)瓊脂平板中林可霉素進(jìn)行定量分析，為林可霉素降解菌的篩選奠定基礎(chǔ)；(3)樣品采集從林可霉素生產(chǎn)廢渣堆放處的土壤取樣，利用無菌水配制成土壤稀釋液用于菌種的分離；(4)菌種分離取0.2mL土壤稀釋液涂布于含0.015g林可霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基固體瓊脂平板，30℃下培養(yǎng)5天，經(jīng)稀釋涂布分離單菌落，獲得能夠以林可霉素為唯一碳源和能源生長的菌株并保存試管中；(5)菌種篩選無菌水將分離得到的菌種配成菌懸液，OD值0.8，取0.2mL涂布含0.02g林可霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基瓊脂平板中，以不接種的相同平板為空白對(duì)照，在30℃培養(yǎng)7天后，在優(yōu)化得到的最佳酸溶解工藝條件下測定樣品，并根據(jù)線性回歸方程測定出瓊脂平板中林可霉素的含量，以林可霉素降解率為指標(biāo)，篩選林可霉素降解菌。
2.按照權(quán)利要求1所述的瓊脂平板篩選降解林可霉素好氧細(xì)菌的方法，其特征在于 步驟(2)酸溶加熱的條件為鹽酸濃度1. 14mol/L，加鹽酸量3mL，加熱時(shí)間70s。
3.按照權(quán)利要求1所述的瓊脂平板篩選降解林可霉素好氧細(xì)菌的方法，其特征在于 步驟(2)定瓊脂平板中林可霉素的標(biāo)準(zhǔn)方程為y = 0. 01533+0. 00299x，其中χ表示林可霉 素濃度(ug/ml)，y表示吸光值，方程的相關(guān)系數(shù)r = 0. 99935，濃度范圍為0 250ug/mL，待 測定的樣品在靜置30min后，該方法測定是穩(wěn)定的，在30 120min內(nèi)，RSD為0. 13756%, 精密度的RSD為0. 2654%，重復(fù)性的RSD為0. 4328%，樣品回收率94. 8858%。
全文摘要
本發(fā)明涉及林可霉素降解菌的篩選，具體的說是一種在瓊脂平板中篩選降解林可霉素的好氧細(xì)菌，本發(fā)明基于降解菌后期將應(yīng)用于降解林可霉素生產(chǎn)廢渣中抗生素殘留的考慮，研究在瓊脂平板中以固體培養(yǎng)方式篩選菌株。本發(fā)明具體方案包括瓊脂平板中林可霉素測定方法建立、樣品采集和菌種分離、瓊脂平板中篩選菌株。在利用酸溶加熱方式解決了瓊脂平板中林可霉素定量測定的基礎(chǔ)上，提供了一種以固體培養(yǎng)方式，在瓊脂平板中篩選林可霉素降解菌的技術(shù)，具有操作方便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。通過本方法篩選出降解林可霉素的好氧細(xì)菌，可應(yīng)用于降解林可霉素生產(chǎn)廢渣的抗生素殘留，為實(shí)現(xiàn)廢渣的資源化利用奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101948765SQ201010252489
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者何際芳, 劉鳳霞, 周凱, 李慧星, 王瑩, 薛剛, 許彬, 郭書賢 申請(qǐng)人:南陽理工學(xué)院