專利名稱：一種制備基因傳輸載體碳酸鈣納米的方法
技術領域：
該方法制備的納米是一種無毒、生物相容性好、可生物降解，并能夠用作基因傳輸 載體，適用于生物制藥及腫瘤基因治療領域。
背景技術：
載體問題一直是基因治療中亟待解決的關鍵問題之一，理想的轉染載體應具有安 全性、高效性及穩(wěn)定性①安全性一方面是指載體本身不具備免疫原性，對機體無毒，另一 方面指載體不會隨機與宿主的染色體整合，誘發(fā)突變等；②高效性是指可將目的基因靶向 輸送到腫瘤組織且能感染大量的細胞；③穩(wěn)定性是指載體可介導目的基因整合至宿主染色 體的特異位點或能以附加體形式穩(wěn)定存在，目的基因可長期表達而不需反復轉染。目前基因治療的臨床試驗多是利用病毒載體，雖然轉染率高，但存在其自身的缺 陷，如最初使用的逆轉錄病毒載體，不能裝載大片段DNA，且可隨機整合至宿主的染色體，利 用逆轉錄病毒為載體介導的基因治療曾導致多起白血病的發(fā)生；現(xiàn)在臨床試驗中常用的腺 病毒，雖然不會隨機整合到宿主基因組中，不具備致瘤性，但是其編碼蛋白可激活機體免疫 反應，且由于不整合到染色體組，隨著細胞的分裂而丟失，不能長期穩(wěn)定表達。此外尚有腺 相關病毒載體、慢病毒載體等，都有一定的局限性。目前有關非病毒載體的研究越來越廣泛，非病毒性載體雖然轉染效率不如病毒載 體高，但是安全、制備簡單，且攜帶外源基因的容量較大。非病毒載體包括脂質體、陽離子多 聚物及納米顆粒等。脂質體性質穩(wěn)定，無插入突變的危險，它在將核酸導入細胞后即被降 解，因而無毒性，無免疫原性，可在體內多次重復使用而不引起機體的免疫反應，而且制備 容易、成本較低；但其缺點是體內轉染效率低，臨床應用受到一定限制，鑒于現(xiàn)有病毒載體 和非病毒載體存在的缺陷，研制新型的非病毒載體已經(jīng)成為了研究的熱點，納米顆粒因為 具有小尺寸效應，表面效應，隨著顆粒直徑變小，比表面積將會顯著增大，故具有很高的化 學活性，因而納米成為了最有應用前景的非病毒載體。研究表明，納米顆粒在體內的循環(huán)時 間明顯長于普通大小的顆粒，在短時間內，不會很快被吞噬細胞清除，從而更多的滲出到血 管外，組織間隙，延長與細胞的接觸時間，提高轉染效率；通常質粒DNA進入血管后很快被 核酸酶消化降解，但納米基因載體有濃縮，保護DNA功能，與DNA形成一致密的結構，使DNA 不被核酸酶消化降解。目前，采用的納米生物材料大致分為有機材料和無機材料兩大類，前者有多聚糖、 高分子聚合物等，后者主要集中在對石英、羥基磷灰石、磁鐵粉、陶瓷、碳粒、硅氧化物及各 種金屬或合金的研究。高分子聚合材料作為納米載體的研究越來越受到重視，其在基因的 輸送中有許多的優(yōu)越性，如能保護核苷酸的降解、有助于核苷酸轉染細胞，并可起到定位作 用，能靶向輸送核苷酸，且可控制DNA的釋放速率，延長其在體內的作用時間等。生物降解 性是藥物載體或基因載體的重要特征之一，通過降解，載體與藥物/基因片段定向進入靶 細胞之后，表層的載體被生物降解，芯部的藥物釋放出來發(fā)揮療效，避免了藥物在其他組織 中釋放。

發(fā)明內容
本項目利用化學方法制備一種50nm左右大小、分散均勻的碳酸鈣納米顆粒，碳酸 鈣納米顆粒能與質粒DNA有效結合，通過復合體吸附在細胞膜上并進入細胞內，增加進入 細胞內DNA量，提高基因轉染的效率，并且質粒DNA與納米顆粒形成的復合體能有效的抵 抗血清中酶類對DNA分子的降解，有效的保護DNA分子的完整性。本新型納米所采用的技術方案本技術采用在表面活性劑作用下，(氯化鈣與碳酸鈉)的濃度比例為2 1，溫度 控制在30°C，攪拌速度為350rpm，化學合成制備的碳酸鈣納米顆粒大小在50nm左右，分散 較好，本方法制備的過程中工藝要求較高；在改變各反應物的濃度、反應過程中的溫度會改 變生成顆粒的大小及均勻度，以及反應合成時間、攪拌的速度的改變也同樣影響制備碳酸 鈣納米的特性，我們經(jīng)過反復的制備和檢測后，已基本形成較完善的制備工藝。本新型載體的有益效果作為基因轉染的載體必須要求載體能與DNA結合，并且能帶上完整的DNA進入細 胞內，使外源基因得到有效的表達。碳酸鈣納米顆粒與帶負電荷的DNA結合；在中性的環(huán)境 下，DNA能與碳酸鈣顆粒形成復合體，并且DNA與顆粒的結合形成復合體后能保護DNA不被 血清降解，這對于體外細胞的培養(yǎng)及體內多酶環(huán)境具有重要的意義；作為基因轉染的載體 要求對細胞、機體無毒。人體骨骼的主要組成成份為鈣、磷，碳酸鈣是可降解的無機材料，在 體內可降解為鈣與磷，被骨質吸收，對機體基本無毒。應此該碳酸鈣納米可能作為基因轉染 的有效載體之一，在腫瘤的基因治療中有著重要的意義，為臨床基因治療提供新的思路。
具體實施例方式用0.05mol/L CaCl2 溶液與微環(huán)境(1 % SDS 5ml，1 % F_685ml，正丁醇，水等)， 室溫反應并攪拌(300rpm) 24h,形成液體A，再將0. 025mol/L Na2CO3,0. 025mol/L檸檬酸 鈉(SodiumCitrate)溶液與微環(huán)境(1% SDSlOml, 1 % F-68 10ml，水等)，室溫反應并攪拌 (300rpm)Mh，形成液體B小時后將B液以每小時15毫升的速度滴入到A液中并以 350rpm速度攪拌混合，溫度控制為30°C，充分攪拌48小時，(3)分別以IOml丙酮，25ml乙 醇重懸，13500rpm離心25min，室溫(25°C )，洗滌，超聲分散lh，凍干，即得平均粒經(jīng)為50nm 碳酸鈣納米。


如圖碳酸鈣納米顆粒在透射電子顯微鏡下的照片(15000x)如圖碳酸鈣納米顆粒在透 射電子顯微鏡下的照片(15000x)，平均粒經(jīng)為50nm。
權利要求
1.用0.05mol/L CaCl2 溶液與微環(huán)境(1 % SDS 5ml，1 % F_685ml，正丁醇，水等)，室 溫反應并攪拌(300rpm) 24h,形成液體A，再將0. 025mol/L Na2CO3,0. 025mol/L檸檬酸鈉 (Sodium Citrate)溶液與微環(huán)境(1% SDS 10ml，1 % F_6810ml，水等)，室溫反應并攪拌 (300rpm)Mh，形成液體 B ；
2.24小時后將B液以每小時15毫升的速度滴入到A液中并以350rpm速度攪拌混合， 溫度控制為30°C，充分攪拌48小時
3.分別以IOml丙酮，25ml乙醇重懸，13500rpm離心25min，室溫(25°C)，洗滌，超聲分 散lh，凍干，即得平均粒經(jīng)為50nm碳酸鈣納米。
全文摘要
一種基因傳輸載體碳酸鈣納米顆粒的制備方法其特征是利用化學合成的方法，分別將氯化鈣與碳酸鈉與表面活性劑混合，各經(jīng)強力攪拌，然后再將以上兩種物質緩慢混合并攪拌，反應一定時間后，產(chǎn)品經(jīng)用乙醇和水分別洗滌、超聲分散，并凍干后得到碳酸鈣納米顆粒。本發(fā)明工藝簡單、成本較低、易于產(chǎn)業(yè)化；所生產(chǎn)的碳酸鈣納米顆粒帶有正電荷，具有高效，無毒，可生物降解；本發(fā)明提供的方法制備出的納米粒子分布均勻，粒徑大部分分布在50nm左右，是理想的基因傳輸載體之一；如圖zetasize DELSA-400檢測碳酸鈣納米粒徑。
文檔編號C12N15/63GK102070171SQ201010252878
公開日2011年5月25日 申請日期2010年8月13日 優(yōu)先權日2010年8月13日
發(fā)明者劉輝, 劉霆, 張桂英, 張鴿文, 賀孝文, 陶一明 申請人:劉霆, 張鴿文, 陶一明