專利名稱：一種假單胞菌da10菌株及其獲得方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于假單胞菌菌株及其應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種假單胞菌DAlO菌株及其 獲得方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
亞麻纖維天然古樸、色彩柔和，具有獨(dú)特的涼爽舒適性，是化學(xué)纖維所不具 備，其它天然纖維不可比擬的，被譽(yù)為“植物纖維中的皇后”。亞麻產(chǎn)品具有手感滑 爽、紋理自然、色調(diào)柔和、結(jié)實(shí)耐用等風(fēng)格，并且具有殺毒抗菌、防紫外線、低靜電、 低磁場(chǎng)效應(yīng)等天然功能，在風(fēng)格與功能上獨(dú)樹(shù)一幟，具有“綠色保健”的特點(diǎn)，因此倍 受消費(fèi)者青睞，是國(guó)際市場(chǎng)上最受歡迎的紡織商品之一。目前，生產(chǎn)上普遍采用傳統(tǒng)的亞麻溫水慪麻、雨露慪麻及天然水慪麻等方法， 均利用天然微生物及其酶對(duì)亞麻的果膠、半纖維素和木質(zhì)素等膠質(zhì)進(jìn)行降解，菌株混 雜，難以進(jìn)行有效的控制，導(dǎo)致脫膠時(shí)間長(zhǎng)(溫水慪麻約為4d;雨露慪麻為15-20d;天 然水慪麻5-7d)、綜合長(zhǎng)麻率低、質(zhì)量不穩(wěn)定(束纖維強(qiáng)力低)和環(huán)境污染重等諸多問(wèn) 題，嚴(yán)重制約著亞麻產(chǎn)業(yè)的大力發(fā)展。盡管20世紀(jì)以來(lái)，微生物學(xué)得到了迅速發(fā)展，麻 類作物中微生物工程技術(shù)的研究也取得了較大的進(jìn)展。雖然將微生物及其產(chǎn)生的酶類應(yīng) 用于亞麻脫膠不僅可以提高纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)，耗能少、使用安全，可減輕對(duì)環(huán)境的污 染，具有良好的前景，但是其產(chǎn)業(yè)化一直未能實(shí)現(xiàn)。因此，篩選、分離亞麻脫膠優(yōu)勢(shì)菌 群并將其應(yīng)用于亞麻脫膠以實(shí)現(xiàn)亞麻微生物快速脫膠非常重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種假單胞菌DAlO菌株及其獲得方法和應(yīng) 用，本發(fā)明提供菌株及培養(yǎng)系統(tǒng)能夠直接用于亞麻脫膠，具有脫膠周期短，纖維分散率 達(dá)100%，脫膠效率達(dá)95%;與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有工藝簡(jiǎn)單、適合大規(guī)模工業(yè)化 生產(chǎn)等特點(diǎn)，對(duì)于探索假單胞菌菌株在堿性條件下進(jìn)行亞麻脫膠具有潛在的理論和實(shí)踐意義。本發(fā)明的一種假單胞菌DAlO菌株(CGMCC No.3851)，其特征在于該菌株具 有產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶能力，具有亞麻脫膠活性。本發(fā)明的一種假單胞菌DAlO菌株的獲得方法，包括(1)從東海舟山海域取樣腐爛海草，先將海草與富集培養(yǎng)基按Ig 20ml的比例 于富集培養(yǎng)基中室溫靜置培養(yǎng)30天，然后取0.1ml富集培養(yǎng)基涂布于分離培養(yǎng)基，37°C 靜置培養(yǎng)1 4天，獲得自野生型脫膠優(yōu)勢(shì)菌株；其中，富集培養(yǎng)基配方為亞麻粉5g，無(wú)菌水200ml，pH自然；分離培養(yǎng)基配 方為亞麻粉 5g，(NH4)2SO4 5g, K2HPO4Ig, MgSO4 0.5g，KCl 0.5g, FeSO4 0.01，瓊 月旨20g，水lOOOmL，用NaOH將pH調(diào)節(jié)到9 ；(2)將步驟(1)中得到的菌株接種到果膠營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)72h，帶菌落形成后，加入0.2%剛果紅水溶液染色4h，倒去表面剩余剛果紅溶液，加入少量蒸餾水蕩 去薄層表面剛果紅，對(duì)光即可見(jiàn)明顯的絳紅色水解圈，在菌落周圍出現(xiàn)絳紅色水解圈者 即為果膠分解菌(測(cè)量果膠瓊脂平板上菌周圍的透明圈直徑和菌落直徑，水解圈與菌落 直徑之比大者一般有較高果膠酶活力)；然后將果膠分解菌接種到半纖維素營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)72h，即可見(jiàn)水解圈 (測(cè)量水解圈和菌苔大小，并計(jì)算二者大小之比，水解圈與菌落直徑之比大者一般有較高 半纖維素酶活力)；(3)通過(guò)透明圈法從上述培養(yǎng)基中選擇出具有產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶能力的菌 株。所述步驟(2)中的果膠營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，其組分包括果膠2gNAN033gK2HP040.5gMgS041g瓊脂20g水1000mLpH自然，7.0-7.2半纖維素營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，其組分包括半纖維素(自制)20gNH4N032gK2HP042gMgS040.2g酵母膏5g瓊脂20g水IOOOmLpH7.2。本發(fā)明的一種假單胞菌DAlO菌株在亞麻脫膠中的應(yīng)用，包括(1)假單胞菌DAlO保存于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，37°C 200rpm培養(yǎng)24h，添加凍存緩沖液；(2)在滅菌冷卻后的50mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接入上述斜面培養(yǎng)24h的菌一 環(huán)，在轉(zhuǎn)速200r/min、溫度40°C條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24h ；(3)將50ml搖瓶培養(yǎng)后培養(yǎng)基接種入亞麻發(fā)酵培養(yǎng)基5L，在轉(zhuǎn)速200r/min、 溫度40°C條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24h得到發(fā)酵菌液；其中，亞麻發(fā)酵培養(yǎng)基配方為亞麻原麻 5g，KC10.05g,磷酸氫二鉀 O.lg，MgSO4 0.05g, FeSO4 O.OOlg, (NH4)2SO4 0.5g,補(bǔ)水至 100ml定容(5L發(fā)酵培養(yǎng)基等同增加各組分用量)；將發(fā)酵菌液于4°C，SOOOr/min離心，取上清液即為所得酶液，然后經(jīng)DNS比 色法測(cè)定，酶液中果膠酶酶活力為240.62U/mL，木聚糖酶酶活力為300.58U/ml，其在 pH6.5-9.0, 50°C以下酶活較穩(wěn)定；(4)將滅菌后的亞麻原莖與步驟3所得發(fā)酵菌液按浴比1 20混合，在40°C， 200rpm搖床中分別脫膠1 4天，脫膠時(shí)間到時(shí)，除去脫膠液，在沸水浴中煮沸5min，用自來(lái)水沖洗數(shù)次以去除亞麻上的細(xì)菌，停止脫膠。所述步驟(1)中的凍存緩沖液由磷酸二氫鉀0.0627g，磷酸氫二鉀0.0177g，檸檬 酸鈉0.0588g，七水合硫酸鎂0.02645g，甘油10ml，加水定容至IOOml制得。本發(fā)明的一種假單胞菌DAlO菌株在亞麻紗線前處理中的應(yīng)用，包括步驟(1) (3)與權(quán)利要求4相同；(4)將滅菌后的亞麻紗線與步驟3所得發(fā)酵菌液按浴比1 20混合，在40°C， 200rpm搖床中分別脫膠1 4天，脫膠時(shí)間到時(shí)，除去脫膠液，在沸水浴中煮沸5min， 用自來(lái)水沖洗數(shù)次以去除亞麻上的細(xì)菌，停止脫膠；其中，亞麻紗線為亞麻粗紗或亞麻二粗。本發(fā)明的一種假單胞菌DAlO菌株在亞麻織物煮練中的應(yīng)用，包括步驟(1) (3)與權(quán)利要求4相同；(4)將滅菌后的亞麻織物與步驟3所得發(fā)酵菌液按浴比1 20混合，在40°C， 200rpm搖床中分別脫膠1 4天，脫膠時(shí)間到時(shí)，除去脫膠液，在沸水浴中煮沸5min， 用自來(lái)水沖洗數(shù)次以去除亞麻上的細(xì)菌，停止脫膠。該菌株除可以用于黃麻、大麻等韌皮纖維脫膠及其織物前處理外等。根據(jù)16sR DNA測(cè)序Blast及聚類分析結(jié)果，該菌與假單胞菌Pseudomonas sp相 似性為99%，結(jié)合生理生化試驗(yàn)結(jié)果和鏡檢分析，命名此菌株為假單胞菌(Pseudomonas sp)DA10 菌株。本發(fā)明所提供的具有亞麻脫膠活性的假單胞菌已于2010年5月17日保藏在中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1 號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為CGMCCNo.3851。本發(fā)明提供的假單胞菌菌株P(guān)seudomonas sp DAlO特征如下(附

圖1、圖2)
權(quán)利要求
1.一種假單胞菌DAlO菌株(CGMCC No.3851)，其特征在于該菌株具有產(chǎn)果膠酶 和半纖維素酶能力，具有亞麻脫膠活性；其16SrRNA序列，如下GGGCGCGCAGTGATTCGAGCTCGGTACCGTAATACGACTCACTATAGGGCGACAT ATGATCGATGATATCCCATGGGCGGCCGCCTGCAGACCAGGTCTGGTTACCTTGTTAC GACTTCACCCCAGTCATCGGCCACACCGTGGCAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCCA CCTGCTTCTGGTGCAACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGG GAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGA GTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGGACTGAGATAGGGTTTCTGGGATTGGCTTACCGTC GCCGGCTTGCAGCCCTCTGTCCCTACCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAG GGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCGGTCTCCT TAGAGTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGG ACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTCG AGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCGACATGTCAAGGCCAGGTA AGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCG TCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGCGAACTTAACGCG TTAGCTTCGATACTGCGTGCCAAATTGCACCCAACATCCAGTTCGCATCGTTTAGGGC GTGGACTACCAGGGTATCTAACCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCCTCAGTGTCA GTGTTGGTCCAGGTAGCTGCCTTCGCCATGGATGTTCCTCCTGATCTCTACGCATTTCA CTGCTACACCAGGAATTCCGCTACCCTCTACCACACTCTAGTCGCCCAGTATCCACTGC AGTTCCCAGGTTGAGCCCAGGGCTTTCACAACGGACTTAAACGACCACCTACGCACG CTTTACGCCCAGTAATTCCGAGTAACGCTTGCACCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGG CACGAAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTTGGGTACCGTCATCCCAACCGGGTATTAGCCA GCTGGATTTCTTTCCCAACAAAAGGGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACCCACGC GGTATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGT AGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTAC GGATCGTCGCCTTGGTGGGCCTTTACCCCGCCAACTAGCTAATCCGACATCGGCTCAT TCAATCGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCACCCGTAGGTCGTATGCGGTATTA GCGTAAGTTTCCCTACGTTATCCCCCACGAAAAAGTAGATTCCGATGTATTCCTCACCC GTCCGCCACTCGCCACCCAGAGAGCAAGCTCTCCTGTGCTGCCGTTCGACTTGCATG TGTTAGGCCTACCGCCAGCGTTCACTCTGAGCCAGGATCAAACTCT。
2.一種假單胞菌DAlO菌株的獲得方法，包括(1)從東海舟山海域取樣腐爛海草，先將海草與富集培養(yǎng)基按Ig 20ml的比例于富 集培養(yǎng)基中室溫靜置培養(yǎng)30天，然后取0.1ml富集培養(yǎng)基涂布于分離培養(yǎng)基，37°C靜置 培養(yǎng)1 4天，獲得自野生型脫膠優(yōu)勢(shì)菌株；其中，富集培養(yǎng)基配方為亞麻粉5g，無(wú)菌水200ml，pH自然；分離培養(yǎng)基配方 為亞麻粉 5g，(NH4)2SO4 5g, K2HPO4Ig, MgSO4 0.5g，KCl 0.5g, FeSO4 0.01，瓊脂 20g，水 1 OOOmL，用 NaOH 將 pH 調(diào)節(jié)到 9 ；(2)將步驟(1)中得到的菌株接種到果膠營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)72h，帶菌落形成 后，加入0.2%剛果紅水溶液染色4h，倒去表面剩余剛果紅溶液，加入少量蒸餾水蕩去薄層表面剛果紅，對(duì)光即可見(jiàn)明顯的絳紅色水解圈，在菌落周圍出現(xiàn)絳紅色水解圈者即為 果膠分解菌；然后將果膠分解菌接種到半纖維素營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)72h，即可見(jiàn) 水解圈；(3)通過(guò)透明圈法從上述培養(yǎng)基中選擇出具有產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶能力的菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種假單胞菌DAlO菌株的獲得方法，其特征在于所述步 驟(2)中的果膠營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，其組分包括果膠2gNAN033gK2HP040.5gMgS04Ig瓊脂20g水IOOOmLpH自然，7.0-7.2半纖維素營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，其組分包括 半纖維素(自制)20g NH4N032gK2HP042gMgS040.2g酵母膏5g瓊脂20g水IOOOmLpH7.2。
4.一種假單胞菌DAlO菌株在亞麻脫膠中的應(yīng)用，包括(1)假單胞菌DAlO菌株保存于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，37°C200rpm培養(yǎng)24h，添加凍 存緩沖液；(2)在滅菌冷卻后的50mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接入上述斜面培養(yǎng)24h的菌一環(huán)，在 轉(zhuǎn)速200r/min、溫度40°C條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24h ；(3)將50ml搖瓶培養(yǎng)后培養(yǎng)基接種入亞麻發(fā)酵培養(yǎng)基5L，在轉(zhuǎn)速200r/min、溫度 40°C條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24h得到發(fā)酵菌液；其中，亞麻發(fā)酵培養(yǎng)基配方為亞麻原麻5g， KC10.05g,磷酸氫二鉀 O.lg，MgSO4 0.05g, FeSO4 O.OOlg, (NH4)2SO4 0.5g,補(bǔ)水至 100ml定容；(4)將滅菌后的亞麻原莖與步驟3所得發(fā)酵菌液按浴比1 20混合，在40°C，200rpm 搖床中分別脫膠1 4天，脫膠時(shí)間到時(shí)，除去脫膠液，在沸水浴中煮沸5min，用自來(lái) 水沖洗數(shù)次以去除亞麻上的細(xì)菌，停止脫膠。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種假單胞菌DAlO菌株在亞麻脫膠中的應(yīng)用，其特征在 于所述步驟(1)中的凍存緩沖液由磷酸二氫鉀0.0627g，磷酸氫二鉀0.0177g，檸檬酸鈉 0.0588g，七水合硫酸鎂0.02645g，甘油10ml，加水定容至IOOml制得。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種假單胞菌DAlO菌株在亞麻脫膠中的應(yīng)用，其特征在 于將步驟(3)所得發(fā)酵菌液于4°C，SOOOr/min離心，取上清液即為所得酶液，然后經(jīng)DNS比色法測(cè)定，酶液中果膠酶酶活力為240.62U/mL，木聚糖酶酶活力為300.58U/ ml,其在pH6.5-9.0，50°C以下酶活較穩(wěn)定。
7.一種假單胞菌DAlO菌株在亞麻紗線前處理中的應(yīng)用，包括步驟⑴ ⑶與權(quán)利要求4相同；(4)將滅菌后的亞麻紗線與步驟3所得發(fā)酵菌液按浴比1 20混合，在40°C，200rpm 搖床中分別脫膠1 4天，脫膠時(shí)間到時(shí)，除去脫膠液，在沸水浴中煮沸5min，用自來(lái) 水沖洗數(shù)次以去除亞麻上的細(xì)菌，停止脫膠。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種假單胞菌DAlO菌株在亞麻紗線前處理中的應(yīng)用，其特 征在于所述的亞麻紗線為亞麻粗紗或亞麻二粗。
9.一種假單胞菌DAlO菌株在亞麻織物煮練中的應(yīng)用，包括步驟⑴ ⑶與權(quán)利要求4相同；(4)將滅菌后的亞麻織物與步驟3所得發(fā)酵菌液按浴比1 20混合，在40°C，200rpm 搖床中分別脫膠1 4天，脫膠時(shí)間到時(shí)，除去脫膠液，在沸水浴中煮沸5min，用自來(lái) 水沖洗數(shù)次以去除亞麻上的細(xì)菌，停止脫膠。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種假單胞菌DA10菌株及其獲得方法和應(yīng)用，該菌株具有產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶能力，具有亞麻脫膠活性。本發(fā)明提供菌株及培養(yǎng)系統(tǒng)能夠直接用于亞麻脫膠，具有脫膠周期短，纖維分散率達(dá)100％，脫膠效率達(dá)95％，菌種不易被污染，處理成本低，纖維質(zhì)量好，脫膠條件溫和，抗污染能力強(qiáng)，耐熱性能好，無(wú)環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)；與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有工藝簡(jiǎn)單、適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)，對(duì)于探索假單胞菌菌株在堿性條件下進(jìn)行亞麻脫膠具有潛在的理論和實(shí)踐意義。
文檔編號(hào)C12S11/00GK102010837SQ20101025318
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者丁若垚, 張興群, 董政娥, 郁崇文 申請(qǐng)人:東華大學(xué)