專利名稱:登革病毒病毒樣顆粒的制備方法及應用的制作方法
技術(shù)領域:
本發(fā)明涉及基因工程領域,具體地說,涉及登革病毒病毒樣顆粒的制備方法及應 用。
背景技術(shù):
登革病毒(DENV)感染是當今人類中流行最廣的蟲媒病毒病。登革病毒通過伊蚊 傳播,如今幾乎在所有的熱帶、亞熱帶地區(qū)都有分布。據(jù)WHO估計,全球有25 30億人口 面臨感染登革病毒的危險,每年大約有5千萬到1億登革熱(Dengue fever DF)病例發(fā)生, 患者表現(xiàn)出高熱、頭痛、肌痛、關節(jié)痛及皮疹等癥狀;這其中有50萬例發(fā)展成更為嚴重的登 革出血熱(Dengue hemorrhagic fever DHF)禾口登革休克綜合征(Dengue shock syndrome DSS),每年因登革病毒感染死亡的人數(shù)是2. 5萬。近年來隨著全球氣候變暖及旅游事業(yè)的 發(fā)展,其傳播媒介伊蚊的地理分布范圍不斷擴大,登革病毒感染在全世界范圍內(nèi)廣泛播散, 已成為世界上分布最廣、發(fā)病人數(shù)最多、危害最大的重要蟲媒病毒病之一。但是,關于登革病毒及其感染還有許多迄今未了解和解決的問題,以至登革病毒 感染的防治缺乏非常有效的措施,特別是登革病毒疫苗研究沒有取得重大進展。登革病毒 有4個血清型,4種血清型病毒都可以導致發(fā)病。目前的研究表明,針對登革病毒某一血清 型的抗體對其他血清型無長期保護作用,當再次感染異型病毒時,會由于抗體依賴增強作 用(antibody-cbpendent enhancement, ADE)而使患者產(chǎn)生更為嚴重的登革出血熱和登革 休克綜合征。所以一種成功的登革疫苗必須對4型登革病毒都能夠產(chǎn)生保護性免疫,能夠 預防登革病毒感染所引起的疾病。WHO已將登革病毒疫苗確立為優(yōu)先發(fā)展的疫苗之一。而登 革病毒疫苗也一直是各國學者關注的焦點,將近60年來,研制登革疫苗的努力從未停止, 但目前仍沒有登革疫苗用于臨床。伴隨著分子生物學的飛速發(fā)展,產(chǎn)生了一些研究登革疫苗的新思路,病毒樣顆粒 疫苗就是其中的一種。病毒樣顆粒(VLPs)是一種不含病毒核酸的假病毒顆粒,完全沒有感 染性成分,只是具有滅活病毒或減毒活疫苗病毒顆粒衣殼的真實構(gòu)象,它以一個更接近真 實構(gòu)象的形式呈遞病毒抗原,更容易被機體免疫系統(tǒng)識別,并且沒有病毒毒力回復或病毒 基因重組或重配的可能。正由于它具有很強的免疫原性及很好的安全性,因而被認為是一 個非常好的疫苗候選物。登革病毒為黃病毒科黃病毒屬的成員,為單股正鏈RNA病毒,基因組長約1 lkb,含 有一條單一的開放讀碼框?;蚺帕许樞驗?' -NCR-C-PrM/M-E-NSl-NS2A-NS2B-NS3-NS4 A-NS4B-NS5-NCR-3',共編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白。其中E基因編碼的E蛋白 為病毒表面包膜糖蛋白,具有與細胞表面受體結(jié)合,介導膜融合,誘導產(chǎn)生中和抗體等重要 生物學功能,是病毒最重要的抗原成份。PrM基因編碼的PrM/M蛋白也被認為是誘導產(chǎn)生中 和抗體的抗原成分。非結(jié)構(gòu)基因及非編碼區(qū)主要與病毒復制及蛋白翻譯有關。有報道稱, 對于黃病毒屬成員,共同表達PrM蛋白及E蛋白可形成病毒樣顆粒。由于prM蛋白及E蛋白均為糖蛋白,而E. coli表達系統(tǒng)本身具有局限性,即缺少蛋白質(zhì)后修飾功能,使得表達產(chǎn)物不能糖基化。因此,在真核表達系統(tǒng)中表達PrM蛋白及E 蛋白有利于蛋白功能的實現(xiàn)。目前,國內(nèi)研究中尚未發(fā)現(xiàn)有在真核系統(tǒng)中分泌表達四型登 革病毒病毒樣顆粒研究的報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供登革病毒病毒樣顆粒的制備方法。本發(fā)明的另一目的是提供可分泌表達DENV1-4病毒樣顆粒的真核系統(tǒng)重組載體。本發(fā)明的進一步目的是提供登革病毒病毒樣顆粒在預防登革病毒所引起的疾病 中的應用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的,本發(fā)明的編碼登革病毒病毒樣顆粒的基因,其具有Seq ID No. 1、Seq ID No. 2、Seq ID No. 3、Seq ID No. 4 或 SeqID No. 5 所示的核苷酸序列或該序 列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個核苷酸形成的具有編碼同等功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。 例如在SeqIDNo. 1-5中編碼JESS信號肽序列的區(qū)段,將編碼第20_24位氨基酸序列的 GCTTGTGCAGGAGCC 替換為 CCACAGGCACAGGCC。本發(fā)明還提供含有編碼登革病毒病毒樣顆粒的基因的載體。優(yōu)選地,所述載體為 真核系統(tǒng)表達載體。更優(yōu)選地,所述載體為PCDNA5/FRT。本發(fā)明還提供含有上述重組載體的宿主細胞。優(yōu)選地,所述宿主細胞為哺乳動物 宿主細胞。更優(yōu)選地,所述宿主細胞為293T細胞。本發(fā)明還提供上述基因編碼的登革病毒病毒樣顆粒的制備方法,其包括步驟1)采用 RT-PCR 技術(shù)從 DENV-I GZ01/95 株、DENV-2 ZS01/01 株、DENV-3 H87 株以 及DENV-4 H241株中分別獲得四個型別的登革病毒prM-E基因元件;2)通過融合PCR技術(shù) 分別對四個型別的登革病毒PrM-E基因元件進行改造,即在各型別prM-E基因前增加一段 來自日本腦炎病毒SA14-14-2株的信號肽序列和/或?qū)⒏餍蛣eprM-E基因C末端的20% 基因序列替換為日本腦炎病毒SA14-14-2株E基因的相應序列;3)將四個型別的登革病毒 prM-E基因改造元件分別克隆入真核系統(tǒng)表達載體中;4)用3)中得到的重組表達載體分別 轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞,并使其分泌表達登革病毒病毒樣顆粒;5) ELISA檢測登革病毒病毒樣 顆粒的免疫原性。本發(fā)明進一步提供上述基因編碼的登革病毒病毒樣顆粒在預防登革病毒所引起 的疾病中的應用。具體地,本發(fā)明一方面提供了經(jīng)基因特性分析和分泌表達設計而改造的四個型別 登革病毒的PrM-E基因元件。其是采用RT-PCR技術(shù)獲得了 DENV-I GZ01/95株、DENV-2 ZS01/01株、DENV-3 H87株以及DENV-4H241株的prM_E蛋白編碼基因序列。為了實現(xiàn)登 革病毒VLPs的分泌表達,本發(fā)明對四個型別登革病毒的prM-E基因元件進行分泌表達設計 并通過融合PCR技術(shù)對prM-E基因進行改造。考慮到在哺乳動物細胞表達體系中形成登 革病毒VLPs的關鍵是prM-E蛋白在表達細胞中的正確合成、轉(zhuǎn)運、切割、包裝及構(gòu)象形成, PrM基因N端的信號肽序列對其有直接影響,而E基因C末端的20%區(qū)域為跨膜區(qū)及螺旋 區(qū),對于登革病毒VLPs的形成起到了至關重要的作用。因此上述表達元件的改造包括在 DENV1-4 prM-E基因前增加一段來自日本腦炎病毒(JEV) SA14-14-2株的信號肽序列,以及 將DENV1-4E基因C末端的20%基因序列缺失或替換為JEV SA14-14-2株E基因的相應序列。改造后的四型登革病毒prM-E基因元件分別命名為JDlprME, JDlprME Δ 20%, JDlprME Δ 20% JEV ;JD2prME、JD2prME Δ 20%, JD2prME Δ 20% JEV ;JD3prME、JD3prME Δ 20%, JD3prME A 20% JEV ;
JD4prME、JD4prME Δ 20%, JD4prME A 20% JEV。本發(fā)明的另一方面,提供了能夠分泌表達四個型別登革病毒病毒樣顆粒的重組載 體。其是通過特異的限制性酶切位點NheI及NotI,分別將上述的四個型別登革病毒prM-E 基因改造元件克隆入真核系統(tǒng)表達載體pcDNA5/FRT中。分別命名為ρJDlprME, ρJDIprME Δ 20%, ρJDIprME Δ 20% JEV ;pJD2prME、pJD2prME Δ 20%, pJD2prME A 20% JEV ;pJD3prME、pJD3prME Δ 20%, pJD3prME A 20% JEV ;pJD4prME、pJD4prME Δ 20%, pJD4prME A 20% JEV0進一步地,本發(fā)明將上述重組表達載體轉(zhuǎn)染293T細胞,48小時后收獲轉(zhuǎn)染細胞及 表達上清。經(jīng)IFA檢測,DENV1-4 prM_E基因在細胞內(nèi)均獲得高效表達。通過Western blot 檢測表達上清,其中,pJD2-4prME未檢測到明顯目的條帶,pJDl_4prME Δ 20%檢測到蛋白分 泌,但為不完整的prM-E蛋白分泌,而對于pJDlprME及pJDl_4prME Δ 20 % JEV,在約60KD 處觀察到目的條帶,證實DENV1-4VLPS全部有效分泌到上清中。根據(jù)上述結(jié)果,本發(fā)明將pJDlprME及pJDl_4prMEA20% JEV列為能夠分泌表達登
革病毒病毒樣顆粒的重組載體。本發(fā)明的再一方面,提供了一種登革病毒病毒樣顆粒的制備方法。其是將上述的 五個重組表達載體大量轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞,表達上清經(jīng)高倍濃縮后,采用15-60%蔗糖密度 梯度離心法對DENVl-4VLPs進行純化,并利用SDS-PAGE及Western blot對純化的VLPs進 行鑒定。進一步地,本發(fā)明分別用DENV-I VLPs和DENV-2 VLPs免疫Balb/c小鼠,能產(chǎn)生 抗DENV rEIII蛋白的特異IgG抗體,且抗體具有一定的中和活性,為登革病毒疫苗研制奠 定了基石出。本發(fā)明首次在真核表達系統(tǒng)中分泌表達四型登革病毒病毒樣顆粒,并對DENV-I VLPs和DENV-2 VLPs的免疫效果進行初步研究,為登革病毒VLPs多價疫苗的研制奠定了基 石出。
圖Ia是本發(fā)明帶有日本腦炎信號肽及prM-E基因全長的pJDl_4prME重組載體結(jié) 構(gòu)示意圖。圖Ib是本發(fā)明帶有日本腦炎信號肽及缺失E基因C末端20%基因的 ρJDl-4prME Δ 20 %重組載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖Ic是本發(fā)明帶有日本腦炎信號肽及將E基因C末端20%基因替換為日本腦炎 相應區(qū)域的pJDl-4prMEA20% JEV重組載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖2a是本發(fā)明含有pJDl_4prME細胞的免疫熒光鑒定圖,其中A、B、C、D分別代表
5pJDlprME、pJD2prME、pJD3prME、pJD4prME瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞后,與登革E蛋白特異性抗體 DEl的反應結(jié)果。圖2b是本發(fā)明含有pJDl_4prMEA20%的細胞的免疫熒光鑒定圖,其中A、B、C、D 分別代表 ρJDIprME Δ 20%, pJD2prME Δ 20%, pJD3prME Δ 20%, pJD4prME Δ 20% 瞬時轉(zhuǎn)染 293Τ細胞后,與登革E蛋白特異性抗體DEl的反應結(jié)果。圖2c是本發(fā)明含有pJDl_4prMEA20% JEV細胞的免疫熒光鑒定圖,其中A、B、C、D 分別代表PJDlprME Δ 20% JEV、pJD2prME Δ 20% JEV、pJD3prME Δ 20% JEV、pJD4prME Δ 20% JEV瞬時轉(zhuǎn)染293Τ細胞后,與登革E蛋白特異性抗體DEl的反應結(jié)果。圖 3a 是本發(fā)明 pJDlprME、ρJDIprME Δ 20%, pJDlprMEA20% JEV 轉(zhuǎn)染 293T 細胞 后的表達上清經(jīng)濃縮后與重組DVl EIII蛋白兔免疫血清反應結(jié)果的western blot鑒定圖, 其中 1、2、3、4 分別代表 pJDlprME、pJDlprME Δ 20%、pJDlprME Δ 20% JEV 以及 pcDNA5/FRT 瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞48小時后,收獲表達上清,濃縮約20倍后與重組DVl E III蛋白兔免疫 血清的反應結(jié)果。圖 3b 是本發(fā)明 pJD2prME、pJD2prME Δ 20%, pJD2prME Δ 20% JEV 轉(zhuǎn)染 293Τ 細胞 后的表達上清經(jīng)濃縮后與重組DV2 EIII蛋白兔免疫血清反應結(jié)果的western blot鑒定圖, 其中1、2、3、4分別代表?邛2口『]\^、口貝2口『]\^八20%、口貝2口『]\^八20% JEV以及pcDNA5/FRT 瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞48小時后,收獲表達上清,濃縮約20倍后與重組DV2 E III蛋白兔免疫 血清的反應結(jié)果。圖 3c 是本發(fā)明 pJD3prME、pJD3prME Δ 20%, pJD3prME Δ 20% JEV 轉(zhuǎn)染 293Τ 細胞 后的表達上清經(jīng)濃縮后與重組DV3 EIII蛋白兔免疫血清反應結(jié)果的western blot鑒定圖, 其中1、2、3、4分別代表?邛3口『]\^、口貝3口『]\^八20%、口貝3口『]\^八20% JEV以及pcDNA5/FRT 瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞48小時后,收獲表達上清,濃縮約20倍后與重組DV3 E III蛋白兔免疫 血清的反應結(jié)果。圖 3d 是本發(fā)明 pJD4prME、ρJD4prME Δ 20 %, pJD4prMEA20% JEV 轉(zhuǎn)染 293T 細胞 后的表達上清經(jīng)濃縮后與重組DV4 EIII蛋白兔免疫血清反應結(jié)果的western blot鑒定圖, 其中1、2、3、4分別代表?貝4口『]\^邛邛4口『]\^八20%邛邛4口『]\^八20% JEV以及pcDNA5/FRT 瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞48小時后,收獲表達上清,濃縮約20倍后與重組DV4 E III蛋白兔免疫 血清的反應結(jié)果。圖4是本發(fā)明超速離心純化后DENV-I及DENV-2 VLPs的SDS-PAGE鑒定圖,其中 M為蛋白marker,1為超離后的上清層,2為20%蔗糖層,3為pJDlprME超離亮帶層,4為 pJD2prMEA20% JEV超離亮帶層,5為60%蔗糖層,6為pcDNA5/FRT超離后的上清層,7為 pcDNA5/FRT的20%蔗糖層,8為pcDNA5/FRT的亮帶層,9為pcDNA5/FRT的60%蔗糖層。圖5是本發(fā)明超速離心純化后DENV-I及DENV-2 VLPs的Western blot鑒定圖,其 中1為超離后的上清層,2為20%蔗糖層,3為pJDlprME超離亮帶層,4為pJD2prME Δ 20% JEV超離亮帶層,5為60%蔗糖層,6為pcDNA5/FRT超離后的上清層,7為pcDNA5/FRT的 20%蔗糖層,8為pcDNA5/FRT的亮帶層,9為pcDNA5/FRT的60%蔗糖層;反應抗體為重組 DV E III蛋白兔免疫血清。圖6是本發(fā)明DENV-I VLPs、DENV_2 VLPs及PBS免疫Balb/C小鼠后,小鼠血清抗 rEIII蛋白IgG檢測結(jié)果比較,PBS為PBS免疫Balb/C小鼠陰性對照,Dl VLPs代表DENV-IVLPs 免疫 Balb/C 小鼠,D2 VLPs 代表 DENV-2 VLPs 免疫 Balb/C 小鼠。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明,但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1 DENVl_4prME基因元件的改造一、DENV1-4, JEV的培養(yǎng)及細胞總RNA提取將DENV-I GZ01/95 株、DENV-2 ZS01/01 株、DENV-3 H87 株及 DENV-4 H241 株、 JEV SA14-14-2株(成都生物制品研究所)毒種液分別接種于貼壁長滿的C6/36細胞,待 細胞病變達+++ ++++時,采用Trizol試劑法提取細胞總RNA。Trizol LS試劑為美國 Invitrogen公司產(chǎn)品。二、DENV1-4 prME基因元件的改造采用ThermoScript RT-PCR System(美國 Invitrogen)將 DENV 1-4 以及 JEV 的 RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。通過融合PCR的方法對DENV1-4的prM_E基因進行改造⑴ 第一輪PCR分別擴增來自日本腦炎病毒SA14-14-2株的信號肽序列JESS、DENV1-4 prME、 DENVl-4prMEA20%以及JEV E基因C末端的20%基因;(2)融合PCR以第一輪PCR產(chǎn)物為 模板,分別擴增JDlprME, JDlprME Δ 20%, JDlprME Δ 20% JEV ;JD2prME、JD2prME Δ 20%, JD2prME Δ 20% JEV ;JD3prME、JD3prME Δ 20%, JD3prME A 20% JEV ;JD4prME、JD4prME Δ 20%, JD4prME A 20% JEV0酶切位點均為NheI (GCTAGC)及 NotI (GCGGCCGC)。第一輪PCR所用引物如下JESS-F 5 ‘ -gggcGCTAGCCGCCGCCGCCATGGGAAAACGGTCAGCGGGCTCAATCATGTGG C-3'JESS-R 5‘ -GGCTCCTGCACAAGCTATG-3‘DENV-I prME-F(DENV-1 prMEΔ 20%-F) 5' -CATAGCTTGTGCAGGAGCCTTCCATCTGAC CACCCGAGG-3‘DENV-I prME-R 5' -tgtgGCGGCCGCttaCGCCTGGACCATGACTCCTAGG-3‘
DENV-I prMEΔ 20% -R 5' -tgtgGCGGCCGCttaACTGCTTCCCTTCTTGAACC-3‘r DENV-I prME Δ 20 % -R 5 ‘ -GTTGAAAAGGCCTTGCCCAGACTGCTTCCCTTCTTGAAC C-3'DENV-2prM E-F(DENV-2 prMEΔ 20%-F) 5' -CATAGCTTGTGCAGGAGCCTTCCATTTAAC CACACGCAACG-3‘DENV-2 prME-R 5' -tgtgGCGGCCGCttaGGCCTGCACCATGACTCCC-3‘DENV-2 prMEΔ 20% -R 5' -tgtgGCGGCCGCttaAGAGCTTCCTTTCTTAAACC-3‘r DENV-2 prME Δ 20 % -R 5 ' -GTTGAAAAGGCCTTGCCCAGAGAGCTTCCTTTCTTAAAC C-3'DENV-3prM E-F(DENV-3 prME Δ 20%-F) 5' -CATAGCTTGTGCAGGAGCCTTCCACTTAAC TTCACGAGATGG-3 ‘
DENV-3 prME-R -tgtgGCGGCCGCttaAGCTTGCACCACGACCCCCAG-3‘DENV-3 prMEΔ 20% -R 5' -tgtgGCGGCCGCttaCGAGCTTCCCTTCCTGTACC-3‘r DENV-3 prME Δ 20 % -R 5 ‘ -GTTGAAAAGGCCTTGCCCAGCGAGCTTCCCTTCCTGTAC C-3'DENV-4 prM E_F(DENV_4 prMEΔ 20%-F) 5' -CATAGCTTGTGCAGGAGCCTTTCACTTGT CAACAAGAGATGG-3‘DENV-4 prME-R -tgtgGCGGCCGCttaTGCGTGAACTGTGAAACCCAG-3‘DENV-4 prMEΔ 20% -R 5' -tgtgGCGGCCGCttaGGAACTCCCTTTCCTGAACCAATGG-3‘r DENV-4 prME Δ 20 % -R 5 ‘ -GTTGAAAAGGCCTTGCCCAGGGAACTCCCTTTCCTGAAC C-3'JEV E20% -F 5' -CTGGGCAAGGCCTTTTCAAC-3‘JEV E20% -R 5' -tgtgGCGGCCGCttaAGCATGCACATTGGTCGCTAAG-3‘第一輪PCR體系及條件(采用羅氏試劑盒PCR Grade Nucleotide Mix)1.分別擴增JESS及JEV E基因C末端的20%基因PCR體系ddH20 36 μ 1 ;10X 緩沖液5μ1 ; DMSO 2. 5μ 1 ;dNTPl μ 1 ;引物 F、R各 2μ1 ;模板 1 μ 1 ;酶 0.5 μ 1。條件95°C 2min
權(quán)利要求
編碼登革病毒病毒樣顆粒的基因,其特征在于,其具有Seq IDNo.1、Seq ID No.2、Seq ID No.3、Seq ID No.4或Seq ID No.5所示的核苷酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個核苷酸形成的具有編碼同等功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述基因的載體。
3.含有權(quán)利要求2所述載體的宿主細胞。
4.如權(quán)利要求3所述的宿主細胞,其為哺乳動物宿主細胞。
5.權(quán)利要求1所述基因編碼的登革病毒病毒樣顆粒的制備方法,其特征在于,包括步驟1)采用RT-PCR 技術(shù)從 DENV-I GZ01/95 株、DENV-2 ZS01/01 株、DENV-3 H87 株以及 DENV-4 H241株中分別獲得四個型別的登革病毒prM_E基因元件;2)通過融合PCR技術(shù)分別對四個型別的登革病毒prM-E基因元件進行改造,即在各型 別prM-E基因前增加一段來自日本腦炎病毒SA14-14-2株的信號肽序列和/或?qū)⒏餍蛣e prM-Ε基因C末端的20%基因序列替換為日本腦炎病毒SA14-14-2株E基因的相應序列;3)將四個型別的登革病毒prM-E基因改造元件分別克隆入真核系統(tǒng)表達載體中;4)用3)中得到的重組表達載體分別轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞,并使其分泌表達登革病毒病 毒樣顆粒;5)ELISA檢測登革病毒病毒樣顆粒的免疫原性。
6.如權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,所述真核系統(tǒng)表達載體為pcDNA5/FRT。
7.如權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,所述哺乳動物細胞為293T細胞。
8.權(quán)利要求1所述基因編碼的登革病毒病毒樣顆粒在制備預防登革病毒所引起的疾 病的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及登革病毒病毒樣顆粒的制備方法及應用,其是通過融合PCR技術(shù)分別對四個型別的登革病毒(DENV)prM-E基因元件進行改造,然后將四個型別的登革病毒prM-E基因改造元件分別克隆入真核系統(tǒng)表達載體中,再將該重組表達載體分別轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞,并使其分泌表達登革病毒病毒樣顆粒(VLPs)。另外,本發(fā)明對DENV-1 VLPs和DENV-2 VLPs的免疫效果進行初步研究,為登革病毒VLPs多價疫苗的研制奠定了基礎。
文檔編號C12N7/04GK101948850SQ20101025410
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者張碩, 李川, 李德新, 梁米芳, 苗芳, 顧雯 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所