專利名稱：一種泥蚶線粒體coi基因擴增引物的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種泥紺線粒體cytochrome c oxidase subunit I (COI)基因擴增引 物的篩選方法。
背景技術(shù)：
泥蚶(Tegillarca granosa)俗稱血蚶，屬軟體動物門(Mollusca)，瓣鰓綱 (Lanellibranchia), |ξ| (Taxodonta), (Arcidae), ΜΜ Μ (TegillarcaIredale), 是一種生活在潮間帶泥質(zhì)沉積區(qū)的雙殼貝類，在全國沿海各省市均有分布。泥蚶作為四大養(yǎng)殖貝類之一，肉味鮮美，可鮮食，也可制成干品，蚶肉富含蛋白質(zhì) 和維生素。泥蚶作為大眾化的海鮮品，在我國河北、山東、南方各省市均有人工養(yǎng)殖，產(chǎn)量 頗豐。關(guān)于泥蚶人工育苗、繁殖與生長、生理生化等方面的研究已有較多報道，但是基于分 子標(biāo)記的遺傳多樣性的研究開展較少，這種現(xiàn)狀極大的阻礙了對泥蚶種質(zhì)資源的開發(fā)利用 和保護。線粒體脫氧核糖核酸(Mitochondrial DNA，即mtDNA)因其單親遺傳、無重組、中 性進化等特性，在分子遺傳學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。其中，COI基因作為進化速率相對較 快的區(qū)域，在無脊椎動物系統(tǒng)分類、種類鑒別、群體遺傳多樣性和分子進化方面得到廣泛應(yīng) 用。由于Folmer (1994)設(shè)計的通用引物C0IL1490和C0IH2198在泥蚶中擴增結(jié)果不理想， 即瓊脂糖凝膠電泳檢測大部分個體無擴增條帶，以往應(yīng)用線粒體COI基因?qū)δ囹赖倪z傳分 化研究采用了克隆測序的方法。這種方法雖能得到較精確的測序結(jié)果，但費時費力，且成本 很高，不適合大規(guī)模的泥蚶群體遺傳學(xué)研究。開發(fā)適用性好的COI基因擴增引物可有效的 解決這些問題，同時為泥蚶的資源保護和利用、多樣性評估、遺傳育種等方面奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種泥蚶線粒體COI基因擴增引物的篩選方法，它能滿足現(xiàn) 有技術(shù)的上述需求。一種泥蚶線粒體COI基因擴增引物的篩選方法，其特征是a、登陸美國國立生 物技術(shù)信息中心，下載已有的泥蚶線粒體COI序列；b、將下載的序列用BioEdit軟件比 對分析，確定序列兩端保守區(qū)域；c、在確定的保守區(qū)域用引物設(shè)計軟件PrimerPremier 5設(shè)計多對引物，送交上海生工生物技術(shù)有限公司合成；d、將泥蚶個體提取DNA，然后分 別和合成的多對引物在反應(yīng)體系下進行PCR反應(yīng)，檢測引物的擴增情況；e、進行瓊脂 糖凝膠電泳檢測，篩選出條帶單一、擴增效率高的一對引物COINF和COINR =COINF為 5，TTGATAGGGATCTGTTTAAGA3，；COINR 為 5，GCCAATACAGGCAAAGAAA3，。本發(fā)明篩選出一對用于擴增泥蚶線粒體部分COI序列的引物COINF和C0INR，并確 定了其反應(yīng)體系和PCR擴增條件，經(jīng)實驗證明該引物具有條帶單—、擴增效率高(> 90% )的特點，能夠滿足泥蚶遺傳多樣性研究的需要。
具體實施例方式實施本發(fā)明的泥蚶線粒體COI基因擴增引物的篩選方法時，分以下五步a、登陸美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)， 下載已有的39條泥蚶線粒體COI序列(Genbank登錄號為EF583524_583540和 FJ411459-411480)。b、用序歹Ij 處理軟件 BioEdit (http://www.mbio. ncsu.edu/BioEdit/bioedit. html)對上述序列進行多重比對分析，確定出前后端較保守區(qū)域。C、經(jīng)比對后在前后端各100個堿基對的較保守區(qū)域內(nèi)，用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5 (http://www. premierbiosoft. com/primerdesign/index, html)設(shè)計弓丨物，設(shè)計 引物時盡量避免發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物二聚體的出現(xiàn)。設(shè)計的多對引物交由上海生工生物技術(shù)有 限公司合成。d、對采自山東威海和福建霞浦的泥蚶(個體數(shù)均為15個，共30個)用苯酚-氯 仿法提取DNA，加雙蒸水稀釋為lOOng/μ 1的工作液備用。e、在10 μ 1 PCR反應(yīng)體系中用合成的多對引物分別擴增這30個泥蚶個體的COI 片段，該體系包括100ng 模板 DNA，0. 25U Taq 聚合酶(Takara)，1 XPCR buffer,0. 2mM dNTPs, 1. 5mM Mgcl2,引物各 1 μ Μ。PCR 擴增條件為94°C預(yù)變性 3min，94°C變性 lmin,52°C 退火溫度lmin，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)，最后72°C延伸5min。本實驗擴增出的產(chǎn)物用質(zhì)量百分數(shù)濃度為1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出 條帶單一，擴增效率高的一對引物COINF和COINR 該引物的產(chǎn)物片段長度約500bp，28個 個體有明亮條帶，擴增效率大于90%。用ABI PRISM 3130測序儀(Applied Biosystems) 雙向測序。序列用BioEdi t軟件拼接后，和NCBI上下載的39條泥蚶COI序列進行多重比 對分析，確定所得序列為泥蚶線粒體COI序列。
權(quán)利要求
一種泥蚶線粒體COI基因擴增引物的篩選方法，其特征是a、登陸美國國立生物技術(shù)信息中心，下載已有的泥蚶線粒體COI序列；b、將下載的序列用BioEdit軟件比對分析，確定序列兩端保守區(qū)域；c、在確定的保守區(qū)域用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5設(shè)計多對引物，送交上海生工生物技術(shù)有限公司合成；d、將泥蚶個體提取DNA，然后分別和合成的多對引物在反應(yīng)體系下進行PCR反應(yīng)，檢測引物的擴增情況；e、進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出條帶單一、擴增效率高的一對引物COINF和COINRCOINF為5’TTGATAGGGATCTGTTTAAGA 3’；COINR為5’GCCAATACAGGCAAAGAAA 3’。
2.如權(quán)利要求1所述的泥蚶線粒體COI基因擴增引物的篩選方法，其特征是所述的泥 紺線粒體 COI 序列的 Genbank 登錄號為 EF583524-583540 和 FJ411459-411480。
3.如權(quán)利要求1所述的泥蚶線粒體COI基因擴增引物的篩選方法，其特征是所述的 PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min，94°C變性lmin，52°C退火溫度lmin，72°C延伸Imin，共35 個循環(huán)，最后72°C延伸5min。
4.如權(quán)利要求1所述的泥蚶線粒體COI基因擴增引物的篩選方法，其特征是所述的瓊 脂糖凝膠電泳用的瓊脂糖質(zhì)量百分數(shù)濃度為1.5%。
5.如權(quán)利要求1所述的泥蚶線粒體COI基因擴增引物的篩選方法，其特征是所述的擴 增效率高的一對引物COINF和COINR的擴增效率大于90%。
全文摘要
本發(fā)明篩選了一對用于泥蚶線粒體COI序列擴增的引物，其方法是利用美國國立生物技術(shù)信息中心上已有的泥蚶線粒體COI序列，下載后用BioEdit軟件比對分析，在確定的保守區(qū)域后用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5設(shè)計多對引物。用泥蚶個體的DNA分別和合成的多對引物在反應(yīng)體系下進行PCR反應(yīng)，最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出一對引物COINF和COINR。經(jīng)實驗證明，該對引物具有條帶單一、擴增效率大于90％的優(yōu)點，能夠滿足泥蚶遺傳多樣性研究的需要，對泥蚶的資源保護和利用、多樣性評估、遺傳育種等方面將起到重要作用。
文檔編號C12N15/10GK101942432SQ201010254700
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月12日
發(fā)明者倪剛, 孔令鋒, 李琪 申請人:中國海洋大學(xué)