專利名稱：一種快速確定鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)物中細菌數(shù)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鴨疫里默氏桿菌的細菌計數(shù)，特別涉及利用紫外分光光度計來檢測鴨 疫里默氏桿菌培養(yǎng)物中鴨疫里默氏桿菌細菌數(shù)量的方法。
背景技術(shù)：
鴨傳染性漿膜炎是發(fā)生于家鴨、鵝、火雞和多種禽類的一種接觸性傳染病，又稱鴨 疫里默氏桿菌病、鴨疫巴氏桿菌病、鴨敗血癥、鴨疫綜合癥、鴨疫敗血癥和新鴨病，其病原為 鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestife^RA)。該病呈急性敗血癥或慢性感染，臨床上 主要表現(xiàn)為咳嗽、喘氣、下痢、眼鼻分泌物增多、共濟失調(diào)和頭頸震顫，少數(shù)慢性病例出現(xiàn)頭 頸歪斜等癥狀；典型病變?yōu)槔w維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎和干酪性輸卵管炎。該 病一年四季均可發(fā)生，以冬季發(fā)病嚴重，主要經(jīng)污染的飼料、飲水、飛沫等傳播；1-8周齡的 鴨高度敏感，尤以2-3周齡的雛鴨發(fā)病率較高，可達90% ；死亡率受多種因素的影響，差別 較大，常為10-20%，但也有的高達60-75%。應(yīng)激因素如飼養(yǎng)密度過大、通風不暢、衛(wèi)生條 件差、氣候突變等，可誘發(fā)該病的發(fā)生，死亡率大大提高；耐過鴨可表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，生長發(fā)育 緩慢、消瘦，飼料報酬下降，嚴重影響生產(chǎn)成績，造成嚴重的經(jīng)濟損失。鴨傳染性漿膜炎是目前對世界各國養(yǎng)鴨業(yè)造成危害最為嚴重的傳染病之一，在世 界范圍內(nèi)分布，幾乎在所有采用集約化養(yǎng)鴨生產(chǎn)的國家都有發(fā)現(xiàn)，給世界養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨 大的經(jīng)濟損失。我國是一個養(yǎng)鴨大國，養(yǎng)鴨業(yè)在我國的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中占有著重要的地位，也是 人們生活所需肉蛋的重要來源之一，鴨傳染性漿膜炎在我國各養(yǎng)鴨地區(qū)的流行較嚴重，是 我國養(yǎng)鴨場(特別是商品鴨場)最難于對付、造成養(yǎng)鴨業(yè)經(jīng)濟損失的最主要傳染病之一，加 之RA的耐藥性逐漸增強，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。由于鴨傳染性漿膜炎給養(yǎng)鴨業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失，有關(guān)鴨疫里默氏菌的研究引 起了越來越多的關(guān)注。其中鴨疫里默氏菌的細菌計數(shù)是鴨疫里默氏菌及鴨傳染性漿膜炎防 治有關(guān)研究的基礎(chǔ)，如研究鴨疫里默氏菌的培養(yǎng)條件、增殖特性、致病劑量、疫苗含菌量等 等均離不開鴨疫里默氏菌的細菌計數(shù)。細菌計數(shù)的方法有計數(shù)器測定法、電子計數(shù)器計數(shù) 法、平板菌落計數(shù)法、比濁法、測定細胞重量法、測定細胞總氮量或總碳量、顏色改變單位法 等，其中比濁法和菌落計數(shù)法可滿足絕大多數(shù)細菌的計數(shù)且也是最常用的方法。菌落計數(shù)法是根據(jù)每個活的細菌能培養(yǎng)長出一個菌落的原理設(shè)計的，不需要特殊 儀器，操作簡單，測定時取一定容量的菌懸液作一系列的倍比稀釋，然后將定量的稀釋液進 行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，可算出培養(yǎng)物中的活菌數(shù)，此法靈敏度高，是一種檢測 活菌數(shù)的好方法，但該法費時，至少需24小時才能出結(jié)果，且需判斷選擇好適宜的稀釋度 (一般選取菌落數(shù)在30 300之間的平板進行計數(shù)，過多或過少均不準確)，對鴨疫里默 氏菌來說，由于其培養(yǎng)條件較苛刻(如需特殊培養(yǎng)基或加入血、CO2等)，因此其操作的復(fù)雜 性、花費及時間等均增大。比濁法是根據(jù)菌懸液的透光量間接地測定細菌的數(shù)量。細菌懸浮液的濃度在一 定范圍內(nèi)與透光度成反比，與光密度成正比，所以，可用光電比色計測定菌液，用光密度(0D值)表示樣品菌液濃度。但光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細胞大小、形 態(tài)、培養(yǎng)液成分以及所采用的光波長等因素的影響，且通常只能檢測含有大量細菌的懸浮 液，得出相對的細菌數(shù)目，對顏色太深的樣品或組織樣品等，不能用此法測定，但此法簡便 快捷。比濁法測定細菌的數(shù)量主要的關(guān)鍵是如何排除樣品中的干擾物、所采用的光波波長 的確定和測定的OD值與細菌數(shù)量間對應(yīng)關(guān)系，否則只能判斷出相對的細菌數(shù)目而不能確 定出準確的細菌數(shù)目。目前，利用紫外分光光度計來測定鴨疫里默氏桿菌數(shù)量還需摸索。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速確定鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)物中鴨疫里默氏桿菌 數(shù)量的方法，涉及所用的檢測儀器種類、檢測過程中所采用的光波波長、檢測步驟及OD值 與鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)物中鴨疫里默氏桿菌數(shù)量間的換算關(guān)系。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種快速確定鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)物中細菌數(shù)量的方法，包括以下步驟①取樣； ②離心洗滌以3000 5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘后，用生理鹽水連續(xù)離心洗滌3次，每 次離心洗滌5-10分鐘，轉(zhuǎn)速3000 5000轉(zhuǎn)/分鐘；③稀釋用生理鹽水作N倍稀釋；④檢 測于紫外分光光度計下測定560nm處OD值；⑤計算按照以下公式計算鴨疫里默氏桿菌 的數(shù)量，含菌總數(shù)(CFU/ml) = OD56tlnm 值 XNX2X109CFU/ml。所述的方法，所述取樣步驟中，液體培養(yǎng)物或菌液直接定量取樣。所述的方法，所述取樣步驟中，固體培養(yǎng)物用生理鹽水將平板上的菌沖洗下后定 量取樣。由于本發(fā)明測定鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)物中鴨疫里默氏桿菌細菌數(shù)目的方法摸索 出了符合鴨疫里默氏桿菌細菌濃度在與光密度具有良好線性關(guān)系的光波波長，且確定出OD 值與鴨疫里默氏桿菌數(shù)量間對應(yīng)關(guān)系，利用該方法可準確、快速地測定出鴨疫里默氏桿菌 培養(yǎng)物中鴨疫里默氏桿菌的細菌數(shù)，在涉及鴨疫里默氏桿菌細菌計數(shù)相關(guān)領(lǐng)域(如研究鴨 疫里默默氏菌的最適培養(yǎng)條件、增殖特性、致病劑量、疫苗含菌量等)中具有極大的優(yōu)勢或 不可替代的作用。一、實現(xiàn)了利用儀器自動化檢測和計數(shù)。傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)計數(shù)是人工操作，因此 結(jié)果的可靠性與檢測人員的業(yè)務(wù)素質(zhì)有較大的影響，儀器自動化檢測表明了檢測方法的進步。二、簡便。傳統(tǒng)的細菌計數(shù)涉及培養(yǎng)試劑選擇與準備、培養(yǎng)基的制備、培養(yǎng)條件的 準備、多步驟的人工操作等，因此操作復(fù)雜，需要具有微生物學知識特別是要掌握鴨疫里默 氏菌的培養(yǎng)特性。本發(fā)明操作簡便，無微生物學和鴨疫里默氏菌知識的人員根據(jù)操作步驟 即可測定。三、快速。傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)計數(shù)不僅操作復(fù)雜，且培養(yǎng)時間需24-48小時，而本發(fā) 明可在1小時出結(jié)果，大大地縮短了檢測時間四、確定了檢測所采用的光波波長和所測定的OD值與鴨疫里默氏桿菌數(shù)量間的 對應(yīng)關(guān)系，結(jié)果準確。理論上細菌懸液的透光量可反映細菌的數(shù)量，但目前未見到底多少波 長的透光量可準確地反映鴨疫里默氏菌的細菌數(shù)量，他們之間的準確的數(shù)值關(guān)系是多少。本發(fā)明根據(jù)菌懸液的透光量可反映測定樣品中的細菌的數(shù)量，對比濁法測定細菌的數(shù)量的兩個主要的關(guān)鍵一測定所采用的光波波長和所測定的OD值與鴨疫里默氏桿菌數(shù) 量間對應(yīng)關(guān)系進行了摸索，確定了 OD值與鴨疫里默氏桿菌數(shù)量間對應(yīng)關(guān)系，同時，本發(fā)明 通過用生理鹽水連續(xù)離心洗滌所測定的菌液，除去樣品中的干擾物，結(jié)果準確。因此利用該 方法可準確、快速地測定出鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)物中鴨疫里默氏桿菌的細菌數(shù)，填補了利 用紫外分光光度計準確測定鴨疫里默氏桿菌的細菌數(shù)這一空白。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。實施例1①取樣液體培養(yǎng)物或菌液直接定量取樣；②離心洗滌以3000 5000轉(zhuǎn)/分鐘 離心5-10分鐘后，用生理鹽水連續(xù)離心(3000 5000轉(zhuǎn)/分鐘，5-10分鐘)洗滌3次；③ 稀釋用生理鹽水作適當稀釋；④檢測于紫外分光光度計下測定560nm處OD值(注意用生 理鹽水調(diào)0)；⑤計算根據(jù)以下公式計算出菌液含菌量，含菌總數(shù)(CFU/ml) = OD56tlnm值X 稀釋倍數(shù) X2X109CFU/ml。例如血清I型鴨疫里默氏桿菌RA-CH-I株用N-J合成培養(yǎng)基35-40°C通氣發(fā)酵 24小時后，檢測發(fā)酵液中鴨疫里默氏桿菌的含菌數(shù)，具體步驟為①取樣取發(fā)酵菌液Iml ；②離心洗滌以3000 5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5_10分鐘 后，用生理鹽水連續(xù)離心(3000 5000轉(zhuǎn)/分鐘，5-10分鐘)洗滌3次；③稀釋用生理鹽 水50ml溶解和稀釋沉淀(即50倍稀釋)；④檢測于紫外分光光度計下測定560nm處OD 值(注意用生理鹽水調(diào)0)，測得OD56tlnmSO. 568 ；⑤計算根據(jù)以下公式計算出菌液含菌量， 含菌總數(shù)(CFU/ml) = OD56tlnm 值 X 稀釋倍數(shù) X2X109CFU/ml = 0. 568X50X2X 109CFU/ml =5. 68X1010CFU/ml。即每毫升該發(fā)酵液中鴨疫里默氏桿菌的含菌數(shù)為568億個。實施例2本實施例列舉一個固體培養(yǎng)物的具體操作例子.例如血清I型鴨疫里默氏桿菌RA-CH-I株用胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基在12em培養(yǎng)皿 于35-40°C燭缸中培養(yǎng)24-48小時后，沖洗培養(yǎng)皿中鴨疫里默氏桿菌進行其他研究，若需要 對其含菌數(shù)檢測，則具體步驟為①取樣在培養(yǎng)皿中加入生理鹽水5ml，用移液管吸取生理鹽水沖洗生長于瓊脂 表面的鴨疫里默氏桿菌，將洗下的菌液倒入15ml離心管中；另加生理鹽水5ml重復(fù)沖洗瓊 脂板1次，共獲得菌液IOml ；②離心洗滌以3000 5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5_10分鐘后，用生 理鹽水連續(xù)離心(3000 5000轉(zhuǎn)/分鐘，5-10分鐘)洗滌3次；③稀釋用生理鹽水IOml 溶解沉淀(即不稀釋)；④檢測于紫外分光光度計下測定560nm處OD值(注意用生理鹽水 調(diào)0)，測得OD56tlnm為0. 211 ；⑤計算根據(jù)以下公式計算出菌液含菌量，含菌總數(shù)(CFU/ml) =OD560nm 值 X 稀釋倍數(shù) X2X 109CFU/ml = 0. 2X 1 X2X 109CFU/ml = 2. IlX 108CFU/ml。即每毫升平板沖洗菌液中鴨疫里默氏桿菌的含菌數(shù)為211000000個。應(yīng)當理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換， 而所有這些改進和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。
權(quán)利要求
一種快速確定鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)物中細菌數(shù)量的方法，其特征在于，包括以下步驟①取樣；②離心洗滌以3000～5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5 10分鐘后，用生理鹽水連續(xù)離心洗滌3次，每次離心洗滌5 10分鐘，轉(zhuǎn)速3000～5000轉(zhuǎn)/分鐘；③稀釋用生理鹽水作N倍稀釋；④檢測于紫外分光光度計下測定560nm處OD值；⑤計算按照以下公式計算鴨疫里默氏桿菌的數(shù)量，含菌總數(shù)(CFU/ml)＝OD560nm值×N×2×109CFU/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟①中，液體培養(yǎng)物或菌液直接定 量取樣。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟①中，固體培養(yǎng)物用生理鹽水將 平板上的菌沖洗下后定量取樣。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速確定鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)物中細菌數(shù)量的方法，包括以下步驟①取樣；②離心洗滌以3000～5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘后，用生理鹽水連續(xù)離心洗滌3次，每次離心洗滌5-10分鐘，轉(zhuǎn)速3000～5000轉(zhuǎn)/分鐘；③稀釋用生理鹽水作N倍稀釋；④檢測于紫外分光光度計下測定560nm處OD值；⑤計算按照以下公式計算鴨疫里默氏桿菌的數(shù)量，含菌總數(shù)(CFU/ml)＝OD560nm值×N×2×109CFU/ml。
文檔編號C12Q1/06GK101936890SQ201010256430
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者朱德康, 汪銘書, 程安春, 陳孝躍 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學實驗動物工程技術(shù)中心