專利名稱：在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生衣康酸(itaconic acid)的方法，且特別涉及一種以甘油為 基質(zhì)在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸(itaconic acid)的方法。
背景技術(shù)：
在化學(xué)工業(yè)中高度需要的衣康酸(itaconic acid, ΙΑ)為前體化合物一般使用于 多種產(chǎn)品的制造，例如丙烯酸系纖維(acrylic fiber)、橡膠、人工鉆石與鏡片。特定絲狀 真菌(filamentous fungi)(例如黑穗菌(Ustilago)、膏藥病菌(Helicobasidium)與曲 菌(Aspergillus))將單糖轉(zhuǎn)換為此化合物。已發(fā)現(xiàn)順烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase, CAD)在衣康酸的生物合成中扮演關(guān)鍵角色。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)，當將經(jīng)基因修飾表達順烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)的解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)細胞培養(yǎng)在含甘油的培養(yǎng)基 中時，其高度產(chǎn)生衣康酸(itaconicacid)。因此，本發(fā)明以使用甘油作為基質(zhì)在酵母細胞中產(chǎn)生衣康酸的方法為特征。 此方法包括(i)提供經(jīng)基因修飾的酵母菌宿主細胞，其包含第一表達框(expression cassette)，第一表達框包括第一酵母菌啟動子(promoter)，第一酵母菌啟動子可操作地被 連結(jié)至編碼順烏頭酸脫羧酶的核苷酸序列，(ii)在允許甘油轉(zhuǎn)換為衣康酸的適合條件下， 培養(yǎng)酵母菌宿主細胞于含有甘油濃度為5至700g/L(例如，5至250g/L)的培養(yǎng)基中，以及 (iii)收集此培養(yǎng)基以分離衣康酸。在此方法中，甘油可為合成衣康酸的唯一基質(zhì)。酵母菌 宿主細胞(例如，解脂耶氏酵母)可還包含第二表達框，與視需要包含第三表達框，其各包 括酵母菌啟動子，被操作地連結(jié)至編碼檸檬酸合成酶(citrate synthase, CS)或烏頭酸酶 (aconitase，Aco)的核苷酸序列。上述的任何酵母菌啟動子可為hp4d、pTEF、pRPS7或pG3P。 三個表達框的每一個可包括引導(dǎo)序列(Ieadersequence)于編碼順烏頭酸脫羧酶、檸檬酸 合成酶或烏頭酸酶的核甘酸序列的上游且讀碼框定向(in-frame with)至編碼順烏頭酸脫 羧酶、檸檬酸合成酶或烏頭酸酶的核甘酸序列。在一個例子中，引導(dǎo)序列編碼MSAILSTTSKS FLSRGSTRQCQ匪QKALFALLNARHYS的氨基酸序列。在另一例子中，其編碼MKLATAFTILTAVLA。本發(fā)明也包括核酸序列，其包括第一、第二，與視需要而定第三表達框，各表達框 包含酵母菌啟動子，其與編碼衣康酸合成相關(guān)的酶的核苷酸序列操作性連結(jié)。在一個例子 中，核酸包含兩個表達框，編碼順烏頭酸脫羧酶的第一表達框與編碼檸檬酸合成酶或烏頭 酸酶的第二表達框。在另一實施例中，核酸包含編碼編碼順烏頭酸脫羧酶、檸檬酸合成酶與 烏頭酸酶的三個表達框。為了讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征、和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施 例，并配合所附圖示，作詳細說明如下。


圖1為圖式，其顯示在表達順烏頭酸脫羧酶、檸檬酸合成酶與烏頭酸酶的經(jīng)基因 修飾的解脂耶氏酵母細胞中甘油至衣康酸的轉(zhuǎn)變。圖2A為圖式，其顯示表達順烏頭酸脫羧酶(框a)、順烏頭酸脫羧酶與檸檬酸合成 酶(框b)、順烏頭酸脫羧酶與烏頭酸酶(框c)，及順烏頭酸脫羧酶、檸檬酸合成酶與烏頭酸 酶(框d)的DNA框。圖2B為表達載體pYLE的圖譜。Sal I與Cla I為克隆上述讀碼框的限制位點。圖3為曲線圖，其顯示在不同時間點，在含甘油與葡萄糖的培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的衣 康酸濃度。在上述圖中101表示甘油；103表示經(jīng)基因工程的酵母細胞；105表示發(fā)酵作用；107表示衣康酸
具體實施例方式此處所述為使用甘油(可為生質(zhì)柴油副產(chǎn)品)101作為基質(zhì)在經(jīng)基因工程的酵母 細胞103中(經(jīng)發(fā)酵作用105)產(chǎn)生衣康酸(itaconicacid) 107 (生物材料的構(gòu)成要素)的 方法。參見圖1。設(shè)計經(jīng)基因修飾的酵母菌(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵 母(Saccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)與 Pseudozyma antarctica)以高禾呈 度表達順烏頭酸脫羧酶，與視需要而定以高程度表達檸檬酸合成酶及/或烏頭酸酶。此處使用的術(shù)語“順烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase) ”或 “CAD”意指自然發(fā)生的順烏頭酸脫羧酶(例如，敘述在Dwiarti et al. , J. Bioscience and Bioengineering,94(l) :29_33，2002 and W02009/014437 中的土曲菌(Aspergillus terreus)順烏頭酸脫羧酶)與其功能等同物(functional equivalent)。以下提供為示范 的土曲菌(Aspergillusterreus)順烏頭酸脫羧酶的核甘酸序列(序列標識號1)與氨基 酸序列(序列標識號2)土曲菌(Aspergillus terreus)順烏頭酸脫羧酶atgaccaagcagtctgctgattccaacgcgaagtctggtgtgacctctgagatctgtcacMTKQ SADSNAKSGVT SEICHtgggcgtctaatctcgccactgatgatatcccgagcgacgttctggagcgtgcaaaatacWASN LATDDIPSDVL ERAKYctgatcctggatggtatcgcgtgcgcgtgggtaggtgctcgtgtcccatggtctgaaaaaLILD GIACAffVGARV PffSEKtacgttcaagcgaccatgtctttcgaacctccgggtgcgtgtcgtgtcatcggttacggcYVQA TMSFEPPGACR VIGYGcagaaactgggtccggtagcggctgccatgacgaactctgcatttattcaggcgaccgaa
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ctgaattgtccggttaaatccccactggtttaaLNCPVKSP LV-此處使用的術(shù)語“檸檬酸合成酶”與“烏頭酸酶”分別將意指將草酰乙酸 (oxaloacetate)轉(zhuǎn)換為檸檬酸(citrate)，與將檸檬酸或異檸檬酸(isocitrate)轉(zhuǎn)換為烏 頭酸的酶，其包括兩者自然發(fā)生的酶與其功能等同物(functional equivalent)。以下提供 為大腸桿菌(Escherichia coli)檸檬酸合成酶(citrate synthase)的核甘酸序列(序列 標識號3)與氨基酸序列(序列標識號4)、烏頭酸酶A(aC0nitase Α)的核甘酸序列(序 列標識號5)與氨基酸序列(序列標識號6)以及烏頭酸酶B(aC0nitase B)的核甘酸序列 (序列標識號7)與氨基酸序列(序列標識號8)大腸桿菌(Escherichia coli)檸檬酸合成酶atggctgatacaaaagcaaaactcaccctcaacggggatacagctgttgaactggatgtgMADTKAKL TLNGDTAV ELDVctgaaaggcacgctgggtcaagatgttattgatatccgtactctcggttcaaaaggtgtgLKGTLGQD V I D I R T L G SKGVttcacctttgacccaggcttcacttcaaccgcatcctgcgaatctaaaattacttttattFTFDPGFT STASCESK ITFIgatggtgatgaaggtattttgctgcaccgcggtttcccgatcgatcagctggcgaccgatD G D E G I L L H R G F P I D Q LATDtctaactacctggaagtttgttacatcctgctgaatggtgaaaaaccgactcaggaacagSNYLEVC Y I L L N G E K PTQEQtatgacgaatttaaaactacggtgacccgtcataccatgatccacgagcagattacccgtYDEFKTT V T R H T M I H EQITRctgttccatgctttccgtcgcgactcgcatccaatggcagtcatgtgtggtattaccggcLFHAFRR DSHPMAVM CGITGgcgctggcggcgttctatcacgactcgctggatgttaacaatcctcgtcaccgtgaaattALAAFYH DSLDVNNP RHREIgccgcgttccgcctgctgtcgaaaatgccgaccatggccgcgatgtgttacaagtattccAAFRLLS KMPTMAAM CYKYSattggtcagccatttgtttacccgcgcaacgatctctcctacgccggtaacttcctgaatIGQPFVY PRNDLSYA GNFLNatgatgttctccacgccgtgcgaaccgtatgaagttaatccgattctggaacgtgctatgMMFSTPC E P Y E V N P I LERAMgaccgtattctgatcctgcacgctgaccatgaacagaacgcctctacctccaccgtgcgtDRILILH ADHEQNAS TSTVRaccgctggctcttcgggtgcgaacccgtttgcctgtatcgcagcaggtattgcttcactgTAGSSGA N P F A C I A A GIASLtggggacctgcgcacggcggtgctaacgaagcggcgctgaaaatgctggaagaaatcagcWGPAHGG ANEAALKM LEEIStccgttaaacacattccggaatttgttcgtcgtgcgaaagacaaaaatgattctttccgc
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大腸桿菌(Escherichia coli)烏頭酸酶 B (aconitase B)
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其它檸檬酸合成酶與烏頭酸酶的例子列在下方表1中表1、示范的檸檬酸合成酶與烏頭酸酶的GenBank登錄號(GenBankAccession Numner)
權(quán)利要求
一種在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，包括提供經(jīng)基因修飾的酵母菌宿主細胞，該宿主細胞包含第一表達框，其包括第一酵母菌啟動子，該第一酵母菌啟動子可操作地被連結(jié)至編碼順烏頭酸脫羧酶的核苷酸序列；在含有甘油濃度為5 700g/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該酵母菌宿主細胞；以及收集該培養(yǎng)基以分離衣康酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中該經(jīng)基因修飾的酵母菌 宿主細胞還包含第二表達框，其包括第二酵母菌啟動子，該第二酵母菌啟動子可操作地被 連結(jié)至編碼檸檬酸合成酶或烏頭酸酶的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中在該第二表達框中的該 核苷酸序列編碼檸檬酸合成酶，且該經(jīng)基因修飾的酵母菌宿主細胞還包含第三表達框，該 第三表達框由第三啟動子所組成，該第三啟動子可操作地被連結(jié)至編碼烏頭酸酶的核苷酸 序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中該甘油為產(chǎn)生衣康酸的唯一基質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中該培養(yǎng)基含有甘油濃度 為 5-250g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中該第一酵母菌啟動子選 自由hp4d、pTEF、pRPS7與pG3P所組成的群組。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中該第一酵母菌啟動子為 pTEF，且該第二啟動子為pRPS7。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中該第一酵母菌啟動子為 pTEF、該第二酵母菌啟動子為pRPS7，且該第三酵母菌啟動子為pG3P。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中該第一表達框在編碼順 烏頭酸脫羧酶的該核苷酸序列的上游還包括引導(dǎo)序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中該引導(dǎo)序列編碼MSAIL STTSKSFLSRGSTRQCQ匪QKALFALLNARHYS 或 MKLATAFTILTAVLA 的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中該酵母菌宿主細胞為 解脂耶氏酵母細胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中該酵母菌啟動子選自 由hp4d、pTEF、pRPS7與pG3P所組成的群組。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中該解脂耶氏酵母細胞 還包含第二表達框，其包括第二酵母菌啟動子，該第二酵母菌啟動子可操作地被連結(jié)至編 碼檸檬酸合成酶或烏頭酸酶的核苷酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中該第一酵母菌啟動子 為pTEF，且該第二啟動子為pRPS7。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中在該第二表達框中的 該核苷酸序列編碼檸檬酸合成酶，且該解脂耶氏酵母細胞還包含第三表達框，該第三表達 框由第三酵母菌啟動子與編碼烏頭酸酶的核苷酸序列所組成。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中該第一酵母菌啟動子為pTEF、該第二酵母菌啟動子為pRPS7，且該第三酵母菌啟動子為pG3P。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中該甘油為產(chǎn)生衣康酸 的唯一基質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中該培養(yǎng)基含有甘油濃 度為 5-250g/L。
19.根據(jù)權(quán)利要求11所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中該第一表達框在編碼 順烏頭酸脫羧酶的該核苷酸序列的上游還包括引導(dǎo)序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其中該引導(dǎo)序列編碼MSAI LSTTSKSFLSRGSTRQCQ匪QKALFALLNARHYS 或 MKLATAFTILTAVLA 的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及在酵母菌中產(chǎn)生衣康酸的方法，其使用甘油作為基質(zhì)在酵母細胞中產(chǎn)生衣康酸(itaconic acid)。酵母細胞高度表達順烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase)且是需要高度表達檸檬酸合成酶(citrate synthase)及/或烏頭酸酶(aconitase)。
文檔編號C12P7/44GK101993899SQ201010263379
公開日2011年3月30日 申請日期2010年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月25日
發(fā)明者王嘉宏, 蔡書憲, 鄧克立 申請人:財團法人工業(yè)技術(shù)研究院