專利名稱：基因異位表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控水稻株型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。涉及一種控制水稻株型的方法，即通過(guò)GAL4-UAS 異位表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控水稻0Sa-miR156e基因或其同源基因的表達(dá)，達(dá)到調(diào)控水稻株型的目 的，以及該方法在轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因水稻種子中的應(yīng)用。本發(fā)明第一次采用分子設(shè)計(jì)育 種的方法調(diào)控水稻株型，有望在水稻株型育種中應(yīng)用，塑造理想株型，達(dá)到增產(chǎn)的目的。
背景技術(shù)：
水稻作為重要的糧食作物，是世界三分之一以上的人以其為主食。為解決人口增 長(zhǎng)與耕地面積減少的矛盾，提高水稻單位面積產(chǎn)量仍是人們面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。近年來(lái)，隨著 水稻功能基因組研究的深入，許多控制水稻產(chǎn)量的功能基因被分離克隆。水稻產(chǎn)量性狀的 遺傳改良取決于穗型、粒型、分蘗數(shù)、株型等一系列因素。株型育種被認(rèn)為是提高水稻產(chǎn)量 的重要方法，50,60年代的矮化育種就是株型育種在提高產(chǎn)量方面的一個(gè)很好的例子。早在 1994年，國(guó)際水稻所(IRRI)提出了水稻理想株型育種，即基于減少分蘗總數(shù)、提高成穗率、 株型緊湊、塑造穗大粒多等等的一類新株型(NPT)的指導(dǎo)思想(Khush G S. Breaking the yield frontier of rice. Geojournal，1995，35 (3) :329_332)。我國(guó)的“水稻超高產(chǎn)育種 計(jì)劃”實(shí)質(zhì)也離不開(kāi)株型問(wèn)題。水稻的單株分蘗數(shù)是影響水稻株型的重要因子，而在產(chǎn)量構(gòu)成的三要素即穗數(shù)、 每穗粒數(shù)和粒重中，穗數(shù)的多少在很大程度上受制于分蘗的發(fā)生量，因而分蘗是影響水稻 和小麥等主要農(nóng)作物單株產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一。水稻分蘗是一個(gè)復(fù)雜的農(nóng)藝性狀。 一般認(rèn)為，分蘗數(shù)目是受多基因控制的數(shù)量性狀，其遺傳力較低，光照、灌溉、肥料、溫度等 都環(huán)境因素對(duì)它也會(huì)有很大影響。Wu等應(yīng)用動(dòng)態(tài)基因定位法在重組自交系群體中定位 7 5 ^^fiti^j^^ (quantitative trait locus, QTL) (Wu ff R et al. ， Time-Related Mapping of Quantitative Trait Loci Underlying Tiller Number in Rice. Genetics, 1999,151 =297-303) 至今已發(fā)現(xiàn)了大量的影響分蘗數(shù)目的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTLs)，但大部 分只是初步定位，只有少部分基因被分離克隆。John Doebley等在1997年利用轉(zhuǎn)座子標(biāo) 簽法分離到一個(gè)玉米主莖腋生分枝數(shù)相關(guān)基因TBI (John Doebley et al. ,The evolution of apical dominance in maize. Nature, 1997,386 485-488 ；Martienssen R. ,The origin of maize branches out. Nature，1997，386 :443.)。SchumacherK 等 1999 年克隆到了控 制番爺側(cè)枝發(fā)生基因 LS (Schumacher K et al. , The lateral suppressor (LS) gene of tomato encodes a new member of the VHIID protein family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999,96 =290-295) 2003年Greb T等克隆到擬南芥的側(cè)枝抑制基因LAS (Greb T et al. , Molecular analysis of the LATERAL SUPPRESSOR gene in Arabidopsis reveals a conserved control mechanism for axillary meristem formation. Genes Dev. , 2003, 17 :1175-1178.)。而水稻分蘗控制基因M0C1的克隆是近年來(lái)在植物形態(tài)建成特別是側(cè)枝 形成研究領(lǐng)域中最重要的進(jìn)展之一 (Li et al. ,Control of tillering in rice. Nature, 2003,422 :618-621)。此外，株高、穗大小、成穗率、莖桿強(qiáng)度、分蘗角度和葉片夾角等也是衡
3量水稻等農(nóng)作物株型的指標(biāo)。研究表明，編碼小分子RNA的基因miR156在擬南芥、玉米、水稻生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中 發(fā)揮著重要的作用。組成型超量表達(dá)miR156基因，植株頂端優(yōu)勢(shì)變?nèi)?，花器官發(fā)育異常， 花序(穗)變小，株高矮化，分枝增多，加速葉片生長(zhǎng)速度和葉片數(shù)量形成一個(gè)叢生的表 型，延緩生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，推遲開(kāi)花等(Xie et al.，Genomic organization, differential expression, and interaction of SQUAMOSA promoter—binding—like transcription factors and microRNA156 in rice. Plant Physiol, 2006，142 :280_293)。由此可見(jiàn)， miR156基因在調(diào)控植物的株型方面發(fā)揮了重要作用。雖然0Sa-miR156e基因超量表達(dá)可以提高水稻的分蘗數(shù)，但是分蘗數(shù)太多會(huì)影 響結(jié)實(shí)率等性狀，難以達(dá)到分蘗數(shù)適中、育性正常、產(chǎn)量提高的理想株型。同時(shí)，組成型超 量表達(dá)0Sa-miR156e基因還會(huì)影響水稻的穗型，穗型變小，從而造成減產(chǎn)(Xie et al., Genomic organization, differential expression, and interaction of SQUAMOSA promoter-binding-like transcription factors and microRNA156 in rice.Plant Physiol, 2006,142 =280-293)。而GAL4-UAS雙因子系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)基因的異位表達(dá) (Liang D et al. , Establishment of a patterned GAL4-VP16 transactivation system for discovering gene function in rice. Plant J, 2006,46 :1059-1072),為了優(yōu)化 0Sa-miR156e基因的表達(dá)模式，本發(fā)明通過(guò)利用本實(shí)驗(yàn)室突變體庫(kù)中報(bào)告基因特異表達(dá)的 模式系，創(chuàng)建含有0Sa-miR156e基因的目標(biāo)系，通過(guò)與模式系雜交，實(shí)現(xiàn)0sa-miR156e基因 在不同的時(shí)空條件下表達(dá)，從而培育理想的水稻株型。1999年，Haseloff報(bào)道了一種基于GAL4-UAS元件的雙因子反式激活系統(tǒng)，將果蠅 中已報(bào)道的GAL4-UAS系統(tǒng)引入了擬南芥基因功能研究中(圖1)。GAL4-UAS雙因子反式激 活系統(tǒng)是指由模式系(pattern lines)和目標(biāo)系(target lines)組成的基因誘導(dǎo)表達(dá)系 統(tǒng)。模式系是由時(shí)空特異型或者誘導(dǎo)型的順式調(diào)節(jié)因子控制的表達(dá)GAL4基因的株系；目 標(biāo)系則是指帶有能與GAL4的特異結(jié)合域結(jié)合的UAS (upstream activating sequence)序 列和受UAS序列控制的目標(biāo)基因的株系。僅對(duì)雙元系統(tǒng)而言，模式系只需要特異表達(dá)GAL4 即可，但是為了便于檢測(cè)GAL4的表達(dá)，在GAL4元件后面加入了由UAS元件控制的報(bào)告基因 (圖1中為綠色熒光蛋白EGFP)，由于UAS元件只與GAL4的特異結(jié)合域結(jié)合，在沒(méi)有GAL4 表達(dá)的情況下，報(bào)告基因不會(huì)表達(dá)，只有在GAL4存在的情況下，報(bào)告基因才會(huì)表達(dá)，這樣就 可以通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)情況得知GAL4的表達(dá)情況。在目標(biāo)系中，由于沒(méi)有GAL4元件，目標(biāo)基因不會(huì)表達(dá)。當(dāng)模式系與目標(biāo)系雜交后， 雜交F1代中來(lái)自目標(biāo)系的由UAS控制的下游基因?qū)凑漳Ｊ较抵械腉AL4表達(dá)模式進(jìn)行表 達(dá)(圖1)，這樣就可以方便地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的時(shí)空特異表達(dá)或者誘導(dǎo)型表達(dá)。只要有足夠 多的特異表達(dá)模式系，理論上任何一個(gè)目標(biāo)基因就可以實(shí)現(xiàn)在全生育期中的任何時(shí)期或器 官中表達(dá)。通過(guò)這個(gè)系統(tǒng)，只要有了相應(yīng)的模式系，就可以將目標(biāo)基因的表達(dá)限定于植物生 長(zhǎng)的某一特定時(shí)期和特定器官甚至細(xì)胞中。在植物分子育種工作中，可以將優(yōu)良性狀基因 特異表達(dá)于預(yù)期的時(shí)期和組織、器官或細(xì)胞，專一性提高產(chǎn)量及品質(zhì)；或者將抗蟲(chóng)、抗病基 因特異表達(dá)于非食用器官或者那些較易感蟲(chóng)、染病的時(shí)期、器官，這樣既可以達(dá)到抗蟲(chóng)抗病 的目的，又可以減少目標(biāo)基因不必要的表達(dá)，同時(shí)提高轉(zhuǎn)基因安全性。
申請(qǐng)人華中農(nóng)業(yè)大學(xué)所在的作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建的水稻T-DNA插 入突變體庫(kù)，含有GAL4-UAS元件的enhancer trap系統(tǒng)，同時(shí)又可以作為模式系使用(Wu 等.，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome. Plant J,2003, 35 418-427 ；Zhang et al. , Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealedby analyzing 13 804 T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutant library. Plant J, 2007,49 =947-959)。目前該突變體庫(kù)已超過(guò)10萬(wàn)個(gè)單株的突變體，也篩選到了大量的特異 表達(dá)的模式系，為利用GAL4-UAS系統(tǒng)異位表達(dá)目標(biāo)基因提供了重要的材料。為了深入開(kāi)發(fā)miR156基因在調(diào)控水稻株型中的作用，培育理想株型的水稻品種， 本發(fā)明首次在水稻育種中應(yīng)用GAL4-UAS異位表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控水稻0Sa-miR156e基因或其同 源基因的表達(dá)改良水稻的重要農(nóng)藝性狀，如分蘗數(shù)，株高，穗大小，結(jié)實(shí)率，成穗率等農(nóng)藝性 狀，達(dá)到改良水稻株型的目標(biāo)。本發(fā)明采用分子設(shè)計(jì)育種的方法改良水稻株型，有望在水稻 株型育種中應(yīng)用，塑造理想株型，達(dá)到增產(chǎn)的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種控制水稻株型的方法該方法是在水稻株型改良 中應(yīng)用GAL4-UAS異位表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控水稻0Sa-miR156e基因或其基因家族的其它同源基因 的表達(dá)模式達(dá)到調(diào)控水稻株型的目的。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種調(diào)控水稻株型的方法在轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。本發(fā)明第一次采用分子設(shè)計(jì)育種的方法調(diào)控水稻株型，有望在水稻株型育種中應(yīng) 用，塑造理想株型，達(dá)到增產(chǎn)的目的。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下1、模式系的選擇構(gòu)建模式系所用載體是pEGFP(見(jiàn)圖1)，這個(gè)載體pEGFP(也是用來(lái)構(gòu)建所述華 中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的大型T-DNA插入突變體庫(kù)的載體之一(Wu等， Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome. Plant J，2003，35 :418-427)，它采用 enhancer trap 策略并含有 GAL4-UAS 系統(tǒng)。選用 T 3種不同的模式系PI (登錄號(hào):04Z11BG74), P2(登錄號(hào):04Z11AC22)和P3(登錄號(hào) 04Z11BK42)，上述模式系材料已在http://rmd. ncpRr. cn/上公開(kāi))，它們各自報(bào)告基因的 表達(dá)模式為P1中綠色熒光蛋白EGFP除了不在花序中表達(dá)外，其他部位都表達(dá)；P2中綠色 熒光蛋白EGFP只在花序中而不在其他部位表達(dá)；P3在所有部位都表達(dá)(圖2)。2、目標(biāo)系的構(gòu)建用來(lái)創(chuàng)建目標(biāo)系的載體是pG0C17(圖1)，水稻0sa-miR156基因家族有12個(gè)成員 0sa-miR156a-—0sa_miR1561，選0sa_miR156e基因構(gòu)建到載體pG0C17上，將獲得的重組載 體命名為pG0C17-156e。3、遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome. Plant J,2003,35 :418_427)將 pG0C17-156e載體導(dǎo)入中花11水稻品種中。
遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果共得到轉(zhuǎn)化植株(苗)50株，將轉(zhuǎn)化獲得的植株命名為T156e。3、目標(biāo)系與模式系雜交，對(duì)水稻株型的改良。選取表型正常的陽(yáng)性單株(目標(biāo)系)與模式系雜交。T156e/Pl的F1代植株株型發(fā)生改變，特別是株高變矮，分蘗增多(圖3a，圖4)。T156e/P2的F1代植株表型沒(méi)有變化，說(shuō)明0Sa-miR156e在花序中表達(dá)不影響水稻 株型(圖3b，圖4)。T156e/P3的F1代植株株型發(fā)生改變，株高變矮，分蘗增多(圖3c，圖4)。GAL4-UAS異位表達(dá)系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確的調(diào)控目標(biāo)基因0Sa-miR156e表達(dá)，最終達(dá)到控 制水稻株型的目的。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果1、本發(fā)明是首次在水稻育種中應(yīng)用GAL4-UAS異位表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控水稻 0Sa-miR156e基因的表達(dá)模式，來(lái)控制水稻株型。2、GAL4-UAS異位表達(dá)系統(tǒng)，同樣可以用于改良水稻的其它重要農(nóng)藝性狀，在水稻 分子設(shè)計(jì)育種中應(yīng)用。3、本發(fā)明第一次采用分子設(shè)計(jì)育種的方法改良水稻株型，有望在水稻株型育種中 應(yīng)用，塑造理想株型，達(dá)到增產(chǎn)的目的。


圖1 是本發(fā)明的pEGFP載體和構(gòu)建的pG0C17_156e重組載體2 目標(biāo)系(T156e)和3種模式系的雜交F1代中EGFP(圖左)和⑶SPlus(圖 右)的表達(dá)模式，檢測(cè)了 6種部位從上到下為根，莖，葉，葉鞘，分蘗芽和花。(a)為T156e/ PI, (b)為 T156e/P2， (c)為 T156e/P3。圖3 野生型(圖左)和F1代(圖右)植株的表型，T156e/Pl (a)，T156e/P2 (b) and T156e/P3(c)。圖4株高(圖4a)和單株分蘗數(shù)(圖4b)統(tǒng)計(jì)，從左到右為野生型，T156e/Pl, T156e/P2and T156e/P3。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1水稻模式系的選擇和目標(biāo)系的構(gòu)建本發(fā)明克隆的0Sa-miR156e基因超量表達(dá)可以提高水稻的分蘗數(shù)，但是分蘗數(shù)太 多影響結(jié)實(shí)率，也不能形成理想的株型，而且組成型表達(dá)0Sa-miR156e基因同時(shí)還會(huì)影響 水稻的穗型和育性，過(guò)量表達(dá)0Sa-miR156e基因會(huì)使穗型變小，育性降低甚至不育，從而造 成減產(chǎn)。所以通過(guò)尋找特異表達(dá)的模式系，將上述目標(biāo)系和模式系進(jìn)行雜交，通過(guò)GAL4-UAS 元件的雙因子反式激活系統(tǒng)調(diào)控0Sa-miR156e的表達(dá)模式和表達(dá)量，改良水稻株型，并在 植物育種中應(yīng)用。1、模式系的選擇構(gòu)建模式系所用載體是pEGFP (圖1)，這個(gè)載體pEGFP也是用來(lái)構(gòu)建華中農(nóng)業(yè)大 學(xué)作物遺傳該了重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室大型T-DNA插入突變體庫(kù)的載體之一，它采用enhancer trap 策略(ffu ^ . ,Development of enhancer trap lines for functional analysis of therice genome. Plant J，2003，35 :418_427)并含有 GAL4-UAS 系統(tǒng)(Wu 等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome. Plant J,2003,35 418-427)。選用了 3種不同的模式系P1(登錄號(hào)04Z11B674)，P2(登錄號(hào):04Z11AC22)和 P3(登錄號(hào):04Z11BK42),上沭樽式系材料已在httD://rmd. ncpgr. cn/上公開(kāi))，它們各自 的表達(dá)模式為P1除了不在花序中表達(dá)EGFP，其他部位都表達(dá)；P2正好相反，只在花序中而 不在其他部位表達(dá)；P3是在所有部位都表達(dá)(圖2)。2、目標(biāo)系的構(gòu)建用來(lái)創(chuàng)建目標(biāo)系的載體是pG0C17(圖1)，水稻0sa-miR156基因家族有12個(gè)成員 0sa-miR156a-—0sa_miR1561，選其中的0sa_miR156e為目標(biāo)基因(其核苷酸序列見(jiàn)SEQ ID NO 1所示)構(gòu)建到pG0C17上，將獲得的重組載體命名為pG0C17-156e。pG0C17-156e載體的具體構(gòu)建過(guò)程引物設(shè)計(jì)TERR2-SacI 5' CTTGAGCTCgccaagcttgcatgcctgcag 3，，其中下劃線為酶切位點(diǎn)。0sa-miR156e-R-KpnI 5' CTTGGTACCtaaatccactggccggtgg 3，，其中下劃線為酶切 位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系的總體積為 50ii l，pUmiR156e 質(zhì)粒(Xie 等，Genomic organization, differential expression, and interaction of SQUAMOSA promoter-binding-like transcription factors and microRNA156 in rice. Plant Physiol,2006,142 280-293) liU (約lOOng)作為PCR擴(kuò)增的模板、LA Taq酶0. 5 yl (購(gòu)自寶生物工程(大連) 有限公司)、2XGC buffer I 25 u l,2mM dNTP 8 ii l、10uM 引物各 2 ii 1、力口 ddH20 至 50 ii 1。反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性 3min，94°C 45s、52°C 70s、72°C 90s、35cycles，72 °C 延伸 7min,擴(kuò) 2 管。擴(kuò)增片段純化回收收集PCR產(chǎn)物于1. 5ml離心管純化，加等體積24 1氯仿異 戊醇，輕搖5分鐘，12000rpm離心15分鐘，吸上清，加2倍體積95%乙醇，1/10體積3M醋酸 鈉(PH5. 2)，_201放置30分鐘，12000印111離心20分鐘，棄上清，加500111 75%乙醇放置 5min，12000rpm離心5分鐘，棄上清，晾干，加75 u 1 ddH20溶解。酶切和純化回收把純化的PCR產(chǎn)物及pG0C17載體酶切，體系總體積100 yl， PCR產(chǎn)物或載體質(zhì)粒75iU，限制性內(nèi)切酶SacI 30U，限制性內(nèi)切酶Kpnl 30U，10XL buffer lOiU，加ddH20到100iil，37°C酶切5小時(shí)。純化酶切產(chǎn)物，方法同上，最后加lOiil ddH20溶解。連接反應(yīng)10iil PCR酶切純化產(chǎn)物全部用于連接反應(yīng)，pG0C17載體0.5 iil，2U T4連接酶，5Xbuffer3 yl，總15 yl體積，連接24小時(shí)。取1 yl連接產(chǎn)物，電壓1800V，電 轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH10B，加800 u 1 LB,復(fù)蘇45分鐘，取200 u 1涂于含卡那霉素(工作濃度為 50微克/毫升)。的LA平板，37°C，過(guò)夜。挑單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)抽質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證結(jié)果正確，酶 切方法同上。PCR驗(yàn)證，體系程序同上。挑陽(yáng)性克隆，把構(gòu)建好的載體pG0C17-156e電轉(zhuǎn)(電 壓1800V)農(nóng)桿菌EHA105，抽質(zhì)粒，PCR驗(yàn)證，挑選正確克隆，取750iU含構(gòu)建好載體的農(nóng)桿 菌菌液加等體積的50%甘油混勻，-70°C保存。構(gòu)建好的重組載體命名為pG0C17-156e。遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Wu等，Development of enhancer trap
7lines for functional analysis of the rice genome. Plant J,2003,35 :418_427)將 pG0C17-156e重組載體導(dǎo)入中花11水稻品種中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的具體步驟如下1)愈傷組織誘導(dǎo)(1)將成熟的水稻種子(中華11號(hào))去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘， 0. 15%氯化汞處理15分鐘；(2)用滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(4)置于黑暗處培養(yǎng)5周，溫度25_27°C。2)愈傷組織繼代挑選亮顏色黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷組織，置于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培 養(yǎng)2周，溫度25-27 °C。3)預(yù)培養(yǎng)挑選結(jié)構(gòu)緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷組織，置于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)4天，溫 度 25-27 °C。4)農(nóng)桿菌培養(yǎng)(1)在帶有卡那霉素(工作濃度為50微克/毫升)的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)含構(gòu)建 好載體pG0C17-156e的農(nóng)桿菌EHA105兩天，溫度28°C ；(2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28°C搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。5)農(nóng)桿菌侵染(1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；(2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至0D6QQ 0. 8-1. 0 ；(3)將愈傷組織在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉(zhuǎn)移愈傷組織至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度 19-20°C。6)愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)(1)用滅菌水洗滌愈傷組織至看不見(jiàn)農(nóng)桿菌；(2)將愈傷組織浸泡在含400ppm頭孢霉素的滅菌水中30分鐘；(3)轉(zhuǎn)移愈傷組織至滅菌好的濾紙上吸干；(4)轉(zhuǎn)移愈傷組織至選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2-3次，每次2周。篩選標(biāo)記為潮霉 素。(抑制農(nóng)桿菌用頭孢霉素，第一次頭孢霉素篩選濃度為400ppm，第二次以后為250ppm)。7)分化(1)將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7天；(2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷組織至分化培養(yǎng)基上，于光照2000 lx下培養(yǎng)，溫度 26°C，培養(yǎng)5-7周。8)生根(1)拔出分化好的轉(zhuǎn)基因植株，剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根；(2)然后將轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照2000 lx下培養(yǎng)2-3周，溫度 26 °C。9)移栽
洗掉轉(zhuǎn)基因植株根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最 初的幾天保持水分濕潤(rùn)。共計(jì)獲得轉(zhuǎn)化苗50株，命名為T156e。實(shí)施例2GAL4-UAS異位表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控0Sa-miR156e表達(dá)模式控制水稻株型。選取表型正常的陽(yáng)性單株(目標(biāo)系)與模式系雜交。從T156e與P1雜交的18個(gè)F1代單株中，檢測(cè)到2株⑶SPlus和EGFP同時(shí)表 達(dá)的單株，而且它們的表達(dá)模式相同(圖2a)，從圖1我們知道目標(biāo)基因0Sa-miR156e 和⑶SPlus，EGFP的表達(dá)模式是相同的，因?yàn)樗麄兌际窃赨AS的調(diào)控下表達(dá)(Liang等， Establishment of a patterned GAL4-VP16 transactivation system for discovering gene function in rice. Plant J，2006，46 :1059-1072)，可以推斷出 0sa_miR156e 除了不 在花序中表達(dá)，其它部位都表達(dá)。然后我們考察了這2個(gè)單株的表型，結(jié)果也證實(shí)了這點(diǎn)， 它們的株型發(fā)生改變，特別是株高變矮，即從株高113. 00cm降低到株高82. 40cm,分蘗增 多，即從16. 20個(gè)提高到33. 40個(gè)，明顯的改變了水稻株型(圖3a，圖4)。從T156e與P2雜交的20個(gè)F1代單株中，檢測(cè)到3株⑶SPlus和EGFP同時(shí)表達(dá) 的單株，而且它們的表達(dá)模式相同(圖2b)，即只在花序中而不在其它部位表達(dá)。3個(gè)單株 的表型沒(méi)有變化，說(shuō)明本發(fā)明克隆的0Sa-miR156e基因在花序中表達(dá)不影響水稻株型(圖 3b，圖 4)。從T156e與P3雜交的15個(gè)F1代單株中，檢測(cè)到2株⑶SPlus和EGFP同時(shí)表達(dá) 的單株，而且它們的表達(dá)模式相同(圖2c)，即在所有部位都能檢測(cè)到GUSPlus和EGFP的表 達(dá)。2個(gè)單株的株型發(fā)生突變，特別是株高變矮，從113. 00cm降低到97. 40cm，分蘗增多從 16. 20個(gè)提高到30. 00個(gè)，水稻株型獲得了顯著的改變(圖3c，圖4)。附錄農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化試劑和配方(1)試劑和溶液縮寫(xiě)6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-芐基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激動(dòng)素)； NAA(Napthalene acetic acid,萘乙酸)；IAA(Indole-3_acetic acid,吲哚乙酸)；2， 4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二) ；AS (Acetosringone, Z^MT 香酮)；CH (Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)； DMS0 (Dimethyl S ii lfoxide，二甲基亞砜)；N6max (N6 大量成分溶液)；N6min (N6 小量成分 溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSmin (MS小量成分溶液)(2)組織培養(yǎng)的溶液配方1) N6max 母液[10 倍濃縮液(10X)]硝酸鉀(KN03)28. 3g磷酸二氫鉀(KH2P04)4. 0g硫酸銨((NH4)2S04)4. 63g硫酸鎂(MgS04 7H20) 1. 85g氯化鈣(CaCl2 2H20) 1. 66g逐一溶解，然后在20_25°C下定容至1000ml。2)N6min 母液[100 倍濃縮液(100X)]碘化鉀(KI)0. 08g
硼酸(H3B03)0. 16g硫酸錳(MnS04 4H20) 0. 44g硫酸鋅(ZnS04 7H20) 0. 15g在20-25 °C下溶解并定容至1000ml。3)Fe2EDTA 貯存液(100X)在一個(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeS04 7H20) 2. 78g在另一個(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水并加熱至70°C，然后加入乙二銨四乙酸二 鈉(Na2EDTA 2H20) 3. 73g在它們都溶解后混合在一起，70°C水浴中保持2小時(shí)，定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(100X)煙酸(Nicotinicacid)0. lg維生素B1 (Thiamine HC1)0. lg維生素B6(Pyridoxine HC1) 0. lg甘氨酸(Glycine)0. 2g肌醇(Inositol)lOg加水定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?)MSmax 母液(10X)硝酸銨(NH4N03)16. 5g硝酸鉀19. Og磷酸二氫鉀1.7g硫酸鎂3. 7g氯化鈣4. 4g在20-25 °C下溶解并定容至1000ml。
0124]6)MSmin 母液(100X)
0125]碘化鉀0.083g
0126]硼酸0.62g
0127]硫酸錳(MnS04 4H20)2. 23g
0128]硫酸鋅(ZnS04 7H20)0. 86g
0129]鉬酸鈉(Na2Mo04 2H20) 0. 025g
0130]硫酸銅(CuS04 5H20)0. 0025g
0131]氯化鈷(CoCl2 6H20)0. 0025g在20-25 °C下溶解并定容至1000ml。7)2，4-0貯存液(111^/1111)2. 4-D lOOmg.lml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，在 20-25 °C下保存。8)6_BA 貯存液(lmg/ml)6-BA lOOmg.
10
lml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，在 20-25 °C下保存。9) NAA 貯存液(lmg/ml)NAA lOOmg.lml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4°C保
存?zhèn)溆谩?0) IAAC存液(lmg/ml)IAA lOOmg.lml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4°C保
存?zhèn)溆谩?1)葡萄糖貯存液(0. 5g/ml)葡萄糖125g蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩?2) AS 貯存液AS 0. 392gDMSO 10ml分裝至1. 5ml離心管內(nèi)，4°C保存?zhèn)溆谩?3) IN氫氧化鉀貯存液氫氧化鉀 5. 6g蒸餾水溶解定容至100ml，在20-25 °C下保存?zhèn)溆谩?4) KT 貯存液(lmg/ml)KT lOOmg.lml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，在 20-25 °C下保存。(3)培養(yǎng)基配方1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max 母液(10X)100mlN6mix 母液(100X)10mlFe2+EDTA 貯存液(100X) 10ml維生素貯存液(100X) 10ml2，4-DC存液2.5ml脯氨酸(Proline)0. 3gCH0. 6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸(100°C )并定容至1000ml， 分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養(yǎng)基N6max 母液(10X)100ml
11
N6mix 母液(100X)10ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)10ml
維生素貯存液(100X)10ml
2，4-D貯存液2. 0ml
脯氨酸0. 5g
CH0. 6g
蔗糖30g
Phytagel3g
加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸(100°C )并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。
3)預(yù)培養(yǎng)基
N6max 母液(10X)12. 5ml
N6mix 母液(100X)1. 25ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2. 5ml
維生素貯存液(100X)2. 5ml
2，4-D貯存液0. 75ml
CH0. 15g
蔗糖5g
瓊脂粉(Agarose)1.75g
0190]加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。
0191]使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 u 1 AS貯存液，分裝倒入
培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。4)共培養(yǎng)基N6max 母液(10X)12.5mlN6mix 母液(100X)1.25mlFe2+EDTA 貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.75mlCH0. 2g蔗糖5g瓊脂粉1. 75g
0201]加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。
0202]使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 u 1 AS貯存液，分裝倒入
培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。5)懸浮培養(yǎng)基N6max 母液(10X)5mlN6mix 母液(100X)0. 5mlFe2+EDTA 貯存液(100X) 0.5ml維生素貯存液(100X)lml
2，4-D貯存液0．2ml
CH0．08g
蔗糖2g
加蒸餾水至lOOml，調(diào)節(jié)pH值到5．4，分裝到兩個(gè)lOOml的三角瓶中，封口滅菌。
使用前加入lml葡萄糖貯存液和100 u l AS貯存液。
6)選擇培養(yǎng)基
N6max母液(IOX)25ml
N6mix母液(IOOX)2．5ml
Fe“EDTA貯存液(IOOX)2．5ml
維生素貯存液(IOOX)2．5ml
2，4-D貯存液0．625ml
CH0．15g
蔗糖7．5g
瓊脂粉1．75g
加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6．0，封口滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 u l 50mg／ml的潮霉素和400ppm頭孢霉素，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml／皿)。
7)預(yù)分化培養(yǎng)基
N6max母液(IOX)25ml
N6mix母液(IOOX)2．5ml
Fe“EDTA貯存液(IOOX)2．5ml
維生素貯存液(IOOX)2．5ml
6一BA貯存液0．5ml
KT貯存液0．5ml
NAA貯存液50 u l
IAA貯存液50 u l
CH0．15g
蔗糖7．5g
瓊脂粉1．75g
加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5．9，封口滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 u l 50mg／ml的潮霉素和400ppm頭孢霉素，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml／皿)。
8)分化培養(yǎng)基
N6max母液(IOX)lOOml
N6mix母液(IOOX)lOml
Fe“EDTA貯存液(IOOX)lOml
維生素貯存液(IOOX)lOml
6一BA貯存液2ml
K／貯存液2m1
NAA C存液0. 2mlIAA C存液0. 2mlCHlg蔗糖30gPhytagel 3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6. 0。煮沸(100°C )并定容至1000ml，分裝到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。9)生根培養(yǎng)基MSmax 母液(10X)50mlMSmix 母液(100X)5mlFe2+EDTA 貯存液(100X)5ml維生素貯存液(100X)5ml蔗糖20gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8。煮沸(100°C )并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。
10) LA培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基不含瓊脂粉)蛋白胨2. 5g酵母粉1. 25g氯化鈉2. 5g瓊脂粉3. 2g蒸餾水溶解定容至250ml，裝于500ml三角瓶，滅菌后20_25°C保存?zhèn)溆谩?br> 1權(quán)利要求
一種調(diào)控水稻株型的方法，其特征在于，利用GAL4 UAS異位表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控水稻Osa miR156e基因的表達(dá)模式，達(dá)到控制水稻株型的目的，所述的Osa miR156e基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種調(diào)控水稻株型的方法，其特征在于通過(guò)GAL4-UAS異位表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控水稻Osa-miR156e基因，或其基因家族的其它同源基因Osa-miR156a-Osa-miR156l，或其功能類似物的表達(dá)模式達(dá)到改良水稻株型的目的。所述的Osa-miR156e基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，本發(fā)明采用GAL4-UAS兩因子系統(tǒng)調(diào)控水稻株型，有望在水稻株型育種中應(yīng)用，塑造理想株型，達(dá)到增產(chǎn)的目的。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101974559SQ201010263800
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月25日
發(fā)明者吳昌銀, 張啟發(fā), 陳志輝 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)