專(zhuān)利名稱(chēng)：草魚(yú)出血病疫苗蛋白表達(dá)載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白表達(dá)載體，尤其涉及一種用基因重組技術(shù)構(gòu)建的疫苗蛋白表 達(dá)載體及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
基于昆蟲(chóng)細(xì)胞的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因有很多優(yōu)點(diǎn)表達(dá)量高，可以 表達(dá)高分子量的蛋白質(zhì)，可以同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因等等。然而昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的 蛋白合成后修飾加工存在差異，許多在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)沒(méi)有足夠 的活性(Kost TA, Condreay JP, Jarvis DL Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology，2005，23 : 567-575)。自1995年起，重組桿狀病毒被發(fā)現(xiàn)可以攜帶外源基因進(jìn)入多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞 (Sarkis C,Serguera C,Petres S,et al. Efficient transduction of neural cells in vitro and in vivo by a baculovirus-derived vector. Proceedings of the National Academy of Sciences USA，2000，97 :14638-14643)。不管是體內(nèi)還是體外，皰疹性 口腔炎 病毒糖蛋白(VSV G)被發(fā)現(xiàn)都可以增強(qiáng)桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因在很多哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表 達(dá)的水平(Mangor J. T.，Monsma S. A.，Johnson Μ. C.，Blissard G. W.，2001. A GP64_null baculovirus pseudotyped with vesicular stomatitis virus G protein. Journal of Virology, 75 :2544_2556 ；Tani H.，Limn C. K.，Yap C. C.，Onishi Μ.，Nozaki Μ.，Nishimune Y.，Okahashi N.，Kitagawa Y.，Watanabe R.，Mochizuki R.，Moriishi K.，Atsuura Y.， 2003.In vitro and in vivo gene delivery by recombinant baculoviruses. Journal of Virology，77 :9799-9808)。由于桿狀病毒具有低毒性和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不復(fù)制的 特點(diǎn)，攜帶VSV G的桿狀病毒作為基因?qū)胼d體的研究已成為基因工程領(lǐng)域的一個(gè)研究熱 點(diǎn)。在已有的桿狀病毒載體的研究工作中，外源基因都是被哺乳動(dòng)物特異性的啟動(dòng)子介導(dǎo) 表達(dá)的，目標(biāo)蛋白質(zhì)在繁殖病毒的昆蟲(chóng)細(xì)胞中并不表達(dá)(Aoki H，Sakoda Y，Jukuroki K， et al. Induction of antibodies in mice by a recombinant baculovirus expressing pseudorabies virus glycoprotein B in mammalian cells. Veterinary Microbiology, 1999,68 :197_207 ；Facciabene A，Aurisicchio L，Monica NL. Baculovirus vectors elicit antigen-specific immune responses in mice. Journal of Virology，2004，78 : 8663-8672)。選取一個(gè)能在無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物細(xì)胞中都有活性的啟動(dòng)子構(gòu)建重組桿狀 病毒，則會(huì)使在昆蟲(chóng)細(xì)胞中和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)與分析外源蛋白成為可能。已有的 研究結(jié)果表明，對(duì)蝦白斑病毒極早期基因iel的啟動(dòng)子在無(wú)脊椎動(dòng)物對(duì)蝦和昆蟲(chóng)細(xì)胞中有 表達(dá)活性(Liu W, Chang YiWang C, et al. Microarray and RT-PCR screening for white spot syndrome virus immediate-early genes in cycloheximi de-treated shrimp. Virology，2005，334 :327_341 ；Lu L，Wang H，Manopo I，et al. Baculovirus-mediated promoter assay and transcriptional analysis of white spot syndrome virus orf427 gene. Virology Journal，2005，2 (71))。
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草魚(yú)出血病，是草魚(yú)魚(yú)種培育階段一種廣泛流行、危害大的病毒性魚(yú)病。流行季節(jié) 長(zhǎng)，發(fā)病率和死亡率均很高，往往造成大批草魚(yú)魚(yú)種死亡。草魚(yú)出血病一般用草魚(yú)出血病組 織漿滅活獲得疫苗，或者用草魚(yú)出血病細(xì)胞培養(yǎng)弱毒疫苗。用上述方法獲得的疫苗純度低， 周期長(zhǎng)。用基因工程方法獲得防治草魚(yú)出血病疫苗蛋白可以解決上述問(wèn)題。目前還沒(méi)有草 魚(yú)出血病疫苗蛋白表達(dá)載體構(gòu)建的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種草魚(yú)出血病疫苗蛋白表達(dá)載體，及其構(gòu)建方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下提供一種草魚(yú)出血病疫苗蛋白表達(dá)載體，包括以下部分(I)AcMNPV多角體啟動(dòng)子控制的VSV G表達(dá)閱讀框；(2)白斑病毒iel啟動(dòng)子控制的VP7表達(dá)閱讀框。所述的表達(dá)載體，由上述的兩個(gè)部分，同時(shí)用基因克隆的辦法，插入PFastBacl穿 梭載體中構(gòu)成。本發(fā)明還提供一種整合有如上所述的表達(dá)載體的重組桿狀病毒，該病毒是 vAc-G-Vp7,由上述的表達(dá)載體，通過(guò)在宿主菌DH10BAC 中定點(diǎn)轉(zhuǎn)座的辦法，整合進(jìn)桿狀病 毒基因組得到。本發(fā)明還提供一咱草魚(yú)出血病疫苗蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟DVSV G閱讀框的克隆A :pFastBacl中的多角體啟動(dòng)子首先用SnaB I和Sal I切除；B 用PCR的方法從Bacmid基因組中擴(kuò)增得到多角體啟動(dòng)子，所用兩條引物分別 是Pl :5’ -TCCCCCGGGGGATGGTTGGCTACGTATACTCCG-3’P2 :5’ -CGCGGATCCGGTTTCG GACCGAGATCCGC-3，；C 將B步驟得到的多角體啟動(dòng)子用Smal和Sal 1雙酶切，克隆進(jìn)pFastBacl載體 的SnaB 1和Sal 1位點(diǎn)中，得到含新的多角體啟動(dòng)子的pFastBacl載體；D 用PCR的方法從pVSV-G載體中擴(kuò)增，得到VSV G cDNA及其末端的β -globin 終止子，所用兩條引物分別是Sl :5’ -CGCGGATCCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGC-3’S2 :5， -CCCAAGCTTCCAACACACTATTGCAATGAA-3，；E 將D步驟中用PCR方法擴(kuò)增出來(lái)的VSV G片段用SnaB I和Sal I進(jìn)行雙酶切， 回收后的片段直接插入含新多角體啟動(dòng)子的pFastBacl載體；對(duì)轉(zhuǎn)化平皿上的菌落用PCR 的方法進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選。2)VP7閱讀框的克隆A 自對(duì)蝦白斑綜合癥病毒基因組iel基因的啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增iel啟動(dòng)子；擴(kuò)增引物 兩端設(shè)計(jì)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)SnaB I和Sal I，插入到pFastBacl載體的Stu I和Sal I位 占中.
/… I B :Vp7基因用RT-PCR的辦法擴(kuò)增自草魚(yú)出血病病毒標(biāo)準(zhǔn)株873株的基因組，所用 引物為
Vl 5' -ATAAGAATGCGGCCGGTAATGCCACTTCACATGATTCCGCA-3'V2 5' -CTAGTCTAGACGCATTAATCGGATGGCTCCAC-3'；然后插入到含有iel啟動(dòng)子序列的pFastBacl載體中，插入位點(diǎn)是Xba 1和Not 1。本發(fā)明構(gòu)建了攜帶受桿狀病毒多角體啟動(dòng)子控制的VSV G和受白斑病毒iel啟動(dòng) 子控制的vp7兩個(gè)表達(dá)閱讀框的新型重組病毒，成功實(shí)現(xiàn)了其在SF9和草魚(yú)CIK細(xì)胞上的 高效表達(dá)。本發(fā)明構(gòu)建的桿狀病毒表達(dá)載體在外膜上同時(shí)展示有VSV G糖蛋白；對(duì)蝦白斑 病毒iel啟動(dòng)子在該載體的介導(dǎo)下，可以在所有測(cè)試的無(wú)脊椎動(dòng)物或脊椎動(dòng)物細(xì)胞系中高 效表達(dá)外源基因。本研究為該蛋白用作防治草魚(yú)出血病的疫苗奠定了基礎(chǔ)。


圖1 :vAc-G-VP7質(zhì)粒載體構(gòu)建圖譜；圖2 重組桿狀病毒vAc-G_VP7在Sf9細(xì)胞和CIK細(xì)胞中表達(dá)VP7的情況。
具體實(shí)施例方式應(yīng)當(dāng)理解，下面實(shí)施例中未說(shuō)明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人 員常規(guī)采用方法如薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，或依據(jù) BAc-To-BAc系統(tǒng)使用手冊(cè)(Irwitrogen)，或按照制造廠(chǎng)商所建議的步驟和條件。實(shí)施例中，所涉及的主要材料來(lái)源和常規(guī)方法如下1. 1 細(xì)胞無(wú)脊椎動(dòng)物Sf9細(xì)胞系(國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)提供)培養(yǎng)在27度的無(wú)血清培養(yǎng) 基SF-900II (Invitrogen)中。草魚(yú)CIK細(xì)胞(國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)提供)。1. 2病毒的感染，滴度測(cè)定和轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)用桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞及桿狀病毒的滴度測(cè)定按照以前報(bào)道的方法進(jìn)行 (Lu L，Du Q，Chejanovsky N. Reduced expression of the immediate-early protein IEO enables efficient replication of Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus in poorly permissive Spodoptera littoralis cells. Journal of Virology，2003，77 :535_545)。細(xì)胞上清液中的病毒通過(guò)超速離心進(jìn)行濃 縮，病毒懸液的濃度用PBS調(diào)整到每毫升IOici空斑形成單位(PFU/ml)。桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)脊 椎動(dòng)物細(xì)胞系根據(jù)已報(bào)道的辦法進(jìn)行(Hsu C，Ho Y，Wang K，et al. Investigation of optimal transduction conditions for baculovirus-mediated gene delivery into mammalian cells.Biotechnology and bioengineering 2004,88 :42_51 ；Lu L，Ho YiKwang J.Suppression of porcine arterivirus replication by baculovirus-delivered shRNA targeting nucleoprotein. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006,340 :1178-1183)，并略有改動(dòng)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中用D-PBS作緩沖液，轉(zhuǎn)導(dǎo)在25度培養(yǎng) 箱中持續(xù)4小時(shí)，然后去掉上清，添加完全DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)正 常培養(yǎng)。1. 3免疫印跡反應(yīng)蛋白電泳，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜及抗體結(jié)合與顯色反應(yīng)都依據(jù)報(bào)道過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)
5行(Lu L, Du Q, Chejanovsky N.Reduced expression of the immediate-early protein IEO enables efficient replication of Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus in poorly permissive Spodoptera littoralis cells.Journal of Virology, 2003, 77 =535-545) 0相當(dāng)于1 X IO6的細(xì)胞總蛋白樣品被用于本實(shí)驗(yàn)的蛋白 質(zhì)分析。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例一質(zhì)粒構(gòu)建依據(jù)BAc-To-BAc系統(tǒng)使用手冊(cè)(Invitrogen)，AcMNPV多角體啟動(dòng)子控制的VSV G表達(dá)閱讀框，和白斑病毒iel啟動(dòng)子控制的VP7表達(dá)閱讀框，同時(shí)用基因克隆的辦法插入 pFastBacl穿梭載體(Invitrogen)中；這兩個(gè)閱讀框通過(guò)在宿主菌DH10BAC (Invitrogen) 中定點(diǎn)轉(zhuǎn)座的辦法，整合進(jìn)桿狀病毒基因組，得到重組病毒vAc-G-VP7。VSV G cDNA及其末端的β -globin終止子是用PCR的方法從pVSV-G(Clontech)載 體中擴(kuò)增而來(lái)，兩條引物分別是(Si) 5，CGCGGATCCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGC3，和(S2) 5，C CCAAGCTTCCAACACACTATTGCAATGAA3，。多角體啟動(dòng)子是用 PCR 的方法從 Bacmid (Invitrogen) 基因組中擴(kuò)增而來(lái)，兩條引物分別是(P 1) 5，TCCCCCGGGGGATGGTTGGCTACGTATACTCCG3，和 (P2) 5，CGCGGATCCGGTTTCG GACCGAGATCCGC3，。Vp7 基因用 RT-PCR 的辦法擴(kuò)增自草魚(yú)出血 病病毒標(biāo)準(zhǔn)株873株(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供)的基因組，所用引物為(V1)5' AT AAGAATGCGGCCGGTAATGCCACTTCACATGATTCCGCA3‘和(V2)5‘ CTAGTCTAGACGCATTAATCGGATGG CTCCAC3'。引物在插入兩個(gè)閱讀框前，pFastBacl中的多角體啟動(dòng)子首先用SnaBl和Sail 切除。具體構(gòu)建步驟如下DVSV G閱讀框的克隆A :pFastBacl中的多角體啟動(dòng)子首先用SnaB I和SalI切除；B 用PCR的方法從Bacmid基因組中擴(kuò)增得到多角體啟動(dòng)子，所用兩條引物分別 是Pl 5' TCCCCCGGGGGATGGTTGGCTACGTATACTCCG3’P2 :5’ CGCGGATCCGGTTTCG GACCGAGATCCGC3’ ；C 將B步驟得到的多角體啟動(dòng)子用Smal和Sal 1雙酶切，克隆進(jìn)pFastBacl載體 的SnaB 1和Sal 1位點(diǎn)中，得到含新的多角體啟動(dòng)子的pFastBacl載體；D 用PCR的方法從pVSV-G載體中擴(kuò)增，得到VSV G cDNA及其末端的β -globin 終止子，所用兩條引物分別是Sl :5’ CGCGGATCCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGC3，S2 :5， CCCAAGCTTCCAACACACTATTGCAATGAA3，；E 將D步驟中用PCR方法擴(kuò)增出來(lái)的VSV G片段用SnaB I和Sal I進(jìn)行雙酶切， 回收后的片段直接插入含新多角體啟動(dòng)子的pFastBacl載體；對(duì)轉(zhuǎn)化平皿上的菌落用PCR 的方法進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選。2)VP7閱讀框的克隆A 自對(duì)蝦白斑綜合癥病毒基因組iel基因的啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增iel啟動(dòng)子；擴(kuò)增引物 兩端設(shè)計(jì)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)SnaB I和Sal I，插入到pFastBacl載體的Stu I和Sal I位 占中.
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B :Vp7基因用RT-PCR的辦法擴(kuò)增自草魚(yú)出血病病毒標(biāo)準(zhǔn)株873株的基因組，所用 引物為Vl 5' ATAAGAATGCGGCCGGTAATGCCACTTCACATGATTCCGCA3'V2 5' CTAGTCTAGACGCATTAATCGGATGGCTCCAC3'；然后插入到含有iel啟動(dòng)子序列的pFastBacl載體中，插入位點(diǎn)是Xba 1和Not 1。構(gòu)建質(zhì)粒載體圖譜見(jiàn)圖1。實(shí)施例二 重組桿狀病毒的構(gòu)建根據(jù)Invitrogen公司Bac-to-bac表達(dá)系統(tǒng)的使用手冊(cè)構(gòu)建重組桿狀病毒。轉(zhuǎn)化 所構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)DHlOBac (Invitrogen)感受態(tài)宿主菌，利用該質(zhì)粒能夠自主轉(zhuǎn)座的特 性，VSV G和VP7兩個(gè)閱讀框可以通過(guò)轉(zhuǎn)座進(jìn)入宿主菌中的桿狀病毒基因組質(zhì)粒上。提取 發(fā)生轉(zhuǎn)座的桿狀病毒基因組質(zhì)粒，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)入昆蟲(chóng)SF9細(xì)胞系，即可得到重 組桿狀病毒vAc-G-VP7。為了增強(qiáng)桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因進(jìn)入脊椎動(dòng)物細(xì)胞的能力，在桿狀病毒載體中 插入了多角體啟動(dòng)子控制下的VSV G表達(dá)閱讀框，VSV G將會(huì)被展示在病毒粒子的外膜 上(Tani H. , Limn C. K. , Yap C. C. , Onishi Μ. , Nozaki Μ. , Nishimune Y. , Okahashi N., Kitagawa Y. , Watanabe R. ,Mochizuki R. , Moriishi K. ,Atsuura Y. ,2003. In vitro and in vivo gene delivery by recombinant baculoviruses. Journal of Virology,77 9799-9808)。在此基礎(chǔ)上，一個(gè)由iel啟動(dòng)子控制的VP7表達(dá)閱讀框被同時(shí)整合到含有VSV G表達(dá)框的病毒基因組中得到重組病毒vAc-G-VP7。實(shí)施例三新型桿狀病毒表達(dá)載體介導(dǎo)草魚(yú)出血病病毒vp7蛋白在SF9和CIK細(xì) 胞中的表達(dá)。為了檢測(cè)重組病毒vAc-G-Vp7表達(dá)目的蛋白vp7的能力，實(shí)驗(yàn)中用vAC-G-vp7感 染昆蟲(chóng)Sf9細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection)為25 ；同時(shí)，用vAc-G_VP7轉(zhuǎn)導(dǎo) CIK細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)為250。24小時(shí)后，收獲vAc-G-VP7感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，用抗VP7的單抗 通過(guò)免疫印跡反應(yīng)檢測(cè)VP7的表達(dá)情況(見(jiàn)圖2)。附圖2中M例為Marker ；Cl列，表示重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)CIK細(xì)胞，病毒感染復(fù)數(shù)為25 的表達(dá)情況；Sl列，表示重組病毒感染昆蟲(chóng)Sf9，感染復(fù)數(shù)為25的表達(dá)情況；C2列，表示重 組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)CIK細(xì)胞，病毒感染復(fù)數(shù)為250的表達(dá)情況；S2列，表示重組病毒感染昆蟲(chóng)Sf9， 感染復(fù)數(shù)為250的表達(dá)情況。本發(fā)明同時(shí)以草魚(yú)出血病病毒外膜蛋白vp7為目的蛋白，成功實(shí)現(xiàn)了其在SF9和 草魚(yú)CIK細(xì)胞上的表達(dá)，為該蛋白用作防治草魚(yú)出血病的疫苗奠定了基礎(chǔ)。序列表<110>上海海洋大學(xué)<120>草魚(yú)出血病疫苗蛋白表達(dá)載體及其構(gòu)建方法<160>6<210>1<211>32<212>DNA
<213>人工序列<220><223>根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，用來(lái)從pVSV-G載體中擴(kuò) 增 VSV G cDNA及其末端的β -globin終止子的引物；命名為Si。<400>1cgcggatcca tgaagtgcct tttgtactta gc 32<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，用來(lái)從pVSV-G載體中擴(kuò) 增 VSV GcDNA及其末端的β -globin終止子的引物；命名為S2。<400>2cccaagcttc caacacacta ttgcaatgaa 30<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，用來(lái)從Bacmid基因組中 擴(kuò)增多角體啟動(dòng)子的引物，命名為P1。<400>3tcccccgggg gatggt tggc tacgtatact ccg 33<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，用來(lái)從Bacmid基因組中 擴(kuò)增多角體啟動(dòng)子的引物，命名為P2。<400>4cgcggatccg gtttcggacc gagatccgc 29<210>5<211>41
<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，用RT-PCR的辦法擴(kuò)增草 魚(yú)出血病病毒標(biāo)準(zhǔn)株873株的Vp7基因的引物，命名為VI。<400>5ataagaatgc ggccggtaat gccacttcac atgattccgc a 41<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，用RT-PCR的辦法擴(kuò)增草 魚(yú)出血病病毒標(biāo)準(zhǔn)株873株的Vp7基因的引物，命名為V2。<400>6ctagtctaga cgcattaatc ggatggctcc ac 32
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權(quán)利要求
一種草魚(yú)出血病疫苗蛋白表達(dá)載體，其特征在于，包括以下部分(1)AcMNPV多角體啟動(dòng)子控制的VSV G表達(dá)閱讀框；(2)白斑病毒ie1啟動(dòng)子控制的VP7表達(dá)閱讀框。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，該載體是由權(quán)利要求1所述的兩個(gè)部 分，同時(shí)用基因克隆的辦法，插入PFastBacl穿梭載體中構(gòu)成。
3.一種整合有如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體的重組桿狀病毒，其特征在于，該病毒是 vAc-G-Vp7,由權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，通過(guò)在宿主菌DH10BAC 中定點(diǎn)轉(zhuǎn)座的辦法，整 合進(jìn)桿狀病毒基因組得到。
4.一種草魚(yú)出血病疫苗蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟 DVSV G閱讀框的克隆A :pFastBacl中的多角體啟動(dòng)子首先用SnaB I和Sal I切除； B 用PCR的方法從Bacmid基因組中擴(kuò)增得到多角體啟動(dòng)子，所用兩條引物分別是 Pl 5' -TCCCCCGGGGGATGGTTGGCTACGTATACTCCG-3' P2 5' -CGCGGATCCGGTTTCG GACCGAGATCCGC-3’ ；C 將B步驟得到的多角體啟動(dòng)子用Smal和Sal 1雙酶切，克隆進(jìn)pFastBacl載體的 SnaB 1和Sal 1位點(diǎn)中，得到含新的多角體啟動(dòng)子的pFastBacl載體；D 用PCR的方法從pVSV-G載體中擴(kuò)增，得到VSV G cDNA及其末端的β -globin終止 子，所用兩條引物分別是515' -CGCGGATCCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGC-3'52:5’ -CCCAAGCTTCCAACACACTATTGCAATGAA-3’ ；E 將D步驟中用PCR方法擴(kuò)增出來(lái)的VSV G片段用SnaB I和Sal I進(jìn)行雙酶切，回收 后的片段直接插入含新多角體啟動(dòng)子的pFastBacl載體； 對(duì)轉(zhuǎn)化平皿上的菌落用PCR的方法進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選。 2)VP7閱讀框的克隆A 自對(duì)蝦白斑綜合癥病毒基因組iel基因的啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增iel啟動(dòng)子；擴(kuò)增引物兩端 設(shè)計(jì)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)SnaB I和Sal I，插入到pFastBacl載體的Stu I和Sal I位點(diǎn)中； B :Vp7基因用RT-PCR的辦法擴(kuò)增自草魚(yú)出血病病毒標(biāo)準(zhǔn)株873株的基因組，所用引物為Vl 5' -ATAAGAATGCGGCCGGTAATGCCACTTCACATGATTCCGCA-3‘ V2 5' -CTAGTCTAGACGCATTAATCGGATGGCTCCAC-3'；然后插入到含有iel啟動(dòng)子序列的pFastBacl載體中，插入位點(diǎn)是Xba 1和Not 1。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種草魚(yú)出血病疫苗蛋白表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。本發(fā)明將AcMNPV多角體啟動(dòng)子控制的VSV G表達(dá)閱讀框，和白斑病毒ie1啟動(dòng)子控制的草魚(yú)出血病疫苗蛋白VP7表達(dá)閱讀框，同時(shí)用基因克隆的辦法插入pFastBac1穿梭載體中，獲得了VP7桿狀病毒表達(dá)載體；將這兩個(gè)閱讀框通過(guò)在宿主菌DH10BACTM中定點(diǎn)轉(zhuǎn)座的辦法整合進(jìn)桿狀病毒基因組得到重組病毒vAc-G-VP7。本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)在不同種類(lèi)細(xì)胞系中有效表達(dá)外源目的基因vp7，可用于草魚(yú)出血病疫苗蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建與疫苗活性蛋白的前期免疫活性分析。
文檔編號(hào)C12N15/66GK101974563SQ201010264188
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月24日
發(fā)明者呂利群, 李家樂(lè), 王浩 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)