專利名稱：一種可降解二甲基甲酰胺的菌群富集方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)境微生物領(lǐng)域，尤其涉及一種可降解二甲基甲酰胺的菌群富集方 法。
背景技術(shù)：
二甲基甲酰胺(DMF)是一種化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、沸點高、性能優(yōu)良的有機(jī)溶劑，能與水 及多數(shù)有機(jī)溶劑以任意比互溶，有“萬能溶劑”之稱，在工業(yè)生產(chǎn)中得到大量應(yīng)用。由于DMF 僅作為有機(jī)溶劑而不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，在量上幾乎沒有損耗，全部進(jìn)入廢水中。DMF進(jìn)入水中 會導(dǎo)致生物化學(xué)耗氧量和氮含量增加，使水質(zhì)迅速惡化。IgDMF產(chǎn)生1. 54gC0D,0. OlgBOD, B0D/C0D值為0. 0065，可生化性極差。因此尋找一種有效的方法來處理DMF廢水是十分迫 切的。高效優(yōu)勢菌以其成本低、二次污染少的特點，已受到重視并開始得到應(yīng)用。但如何獲 得高效的優(yōu)勢降解菌群一直是廢水生化處理中的一個難題。高效降解菌在廢水的生物處理中起著非常重要的作用，研究人員往往是從受污染 的環(huán)境中分離到一些具有特殊降解能力的細(xì)菌、真菌種類，通過富集、馴化而培養(yǎng)起來。國 外有學(xué)者為提高DMF的生物降解速率，用煉油廠、石化廠裝置附近經(jīng)常接觸工業(yè)廢水的土 壤中分離出的微生物或泥土加到活性污泥中去。研究發(fā)現(xiàn)主要降解DMF的菌種為給出中文 名稱(Pseudomonas minuscula)，給出中文名稱(Pcrucivial)及革蘭氏陰性菌，它們可將 DMF作為碳、氮源而去除。在自然環(huán)境中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起，當(dāng)希望獲得某 一類微生物時，就必須從混雜的微生物類群中分離它，以得到只含有這一類微生物的純培 養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。為了獲得某類微生物的純培養(yǎng)，一般 是根據(jù)該微生物對營養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求不同而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種 抑制劑造成只利于此菌生長而抑制其他細(xì)菌生長的環(huán)境，從而淘汰其他不需要的微生物， 再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離、純化該微生物，直至得 到較純的菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可降解DMF的菌群富集方法，通過該方 法能夠為工業(yè)廢水生化處理提供一種經(jīng)濟(jì)高效的可降解DMF的菌群。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下
先將含可降解二甲基甲酰胺的菌的活性污泥加入到馴化期的培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化培養(yǎng); 再將馴化培養(yǎng)后的的活性污泥加入到二甲基甲酰胺與富集培養(yǎng)基的體積比為1 :250的培 養(yǎng)液中進(jìn)行富集培養(yǎng)；最后將培養(yǎng)液在好氧條件下放置在恒溫振蕩箱中，保持恒溫28°C至 32°C、振蕩頻率150 rpm，振蕩培養(yǎng)5至6天為一周期，在每一周期結(jié)束時，撇掉2/3的培養(yǎng) 液，補(bǔ)充添加新鮮的富集培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，共經(jīng)過5個周期的培養(yǎng)。進(jìn)一步，馴化期的培養(yǎng)基組分為=K2HPO46. 8g、KH2PO4 1. 2、MgSO4. 7H20 0. lg、MnSO4. 4H20 0. lg、CaCl2. 2H20 0. lg、FeSO4. 7H20 0. lg、Na2MoO7. 2H20 0. 006g 和蒸溜水 1000mL。進(jìn)一步，富集培養(yǎng)期的培養(yǎng)基組分為=KH2PO4 5g、CaCl2. 2H20 0. 022g、 MgSO4. 7H20 0. 040g、FeCl3. 6H20 0. 0075g、Na2MoO7. 2H20 0. 001 lg、ZnSO4. 7H20 0. 0007g、 MnSO4. 4H20 0. 0006g、CuSO4. 5H20 0. 0006g、CoCl2. 6H20 0. 0006g 和蒸溜水 1000mL。進(jìn)一步，在上述培養(yǎng)過程中用NaOH或H2SO4調(diào)節(jié)其pH為7. 00。本發(fā)明的有益效果是利用本發(fā)明的方法能使工業(yè)廢水處理中DMF去除速率由普 通活性污泥的 14. 24 mgDMF/(g (MLSS) · d)上升到 30. 72 mgDMF/(g (MLSS) .d^DMF 去除速 率有較大提高，對減少DMF給環(huán)境保護(hù)帶來的危害起到很好的效果，在工業(yè)廢水的處理具 有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明活性污泥與添加富集微生物的活性污泥的DMF降解曲線圖； 圖2為本發(fā)明活性污泥與添加富集微生物的活性污泥的DMF去除率圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并 非用于限定本發(fā)明的范圍。實施例1原料的制備 a、培養(yǎng)基的配備
利用II型電子精密天平依次稱取下述組分溶于蒸餾水中，攪拌使其溶解。馴化期的培養(yǎng)基組分為=K2HPO46. 8g、KH2PO4 1. 2、MgSO4. 7H20 0. lg、 MnSO4. 4H20 0. lg、CaCl2. 2H20 0. lg、FeSO4. 7H20 0. lg、Na2MoO7. 2H20 0. 006g 和蒸溜水 1000mL。富集培養(yǎng)期培養(yǎng)基組分為KH2PO45g、CaCl2. 2Η20 0. 022g、MgSO4. 7H20 0. 040g、FeCl3. 6H20 0. 0075g、Na2MoO7. 2H20 0. 001 lg、ZnSO4. 7H20 0. 0007g、MnSO4. 4H20 0. 0006g、CuSO4. 5H20 0. 0006g、CoCl2. 6H20 0. 0006g 和蒸溜水 1000mL。b、含可降解DMF的菌的活性污泥制備
取制于煙臺市辛安河污水處理廠A20工藝二沉池的回流污泥 實施例2培養(yǎng)方法
馴化培養(yǎng)由于DMF具有一定的生物毒性，因此為了降低DMF的毒性對活性污泥中微生 物正常生命活動的沖擊影響，需要對其進(jìn)行馴化培養(yǎng)，使其逐漸適應(yīng)DMF，產(chǎn)生適應(yīng)酶，從而 在處理DMF廢水時以DMF作為唯一的碳源、氮源和能源進(jìn)行代謝，達(dá)到降解DMF的目的。首先將取來的活性污泥進(jìn)行了一周時間的馴化培養(yǎng)，活性污泥的MLSS為9702 mg/L。取250 mL錐形瓶3個，每個三角瓶取活性污泥62mL，靜置棄去上清液，用馴化階段培 養(yǎng)基稀釋到200mL，這樣每個三角瓶的初始MLSS約為3000 mg/L左右。利用NaOH或H2S04 調(diào)節(jié)其初始PH至7. 00。然后將三角瓶置于全溫振蕩培養(yǎng)箱中，溫度保持在30 士 2°C，振蕩頻 率150 rpm左右的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，每天取三角瓶中培養(yǎng)液50 mL利用TG16-WS 臺式高速離心機(jī)在8000 r/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，取水樣進(jìn)行DMF含量和氨氮含量的測定，同時測量三角瓶中培養(yǎng)液的PH。由于培養(yǎng)液總量不多，離心剩余的泥和上清液又倒回 對應(yīng)的三角瓶中。經(jīng)過六天的培養(yǎng)，DMF含量由初始的2600 mg/L左右降至40 mg/L以下， 表明其中已經(jīng)有可以降解DMF的微生物存活。篩選培養(yǎng)將馴化期培養(yǎng)后的三個三角瓶中的污泥混勻，平均分成六份并分別接 種到六個相同的250 mL三角瓶中。每個三角瓶中物質(zhì)添加情況見表1。DMF添加量為0.4% (ν/ν),即每個三角瓶添加DMF 0. SmL0接種好之后在QW-A型全溫振蕩培養(yǎng)箱中于相同的條 件下進(jìn)行培養(yǎng)。指標(biāo)測定情況同前。篩選培養(yǎng)的目的是為了觀察不同的PH和外加碳源對 DMF降解影響，并為最終的富集培養(yǎng)確定合適的條件。由實驗中各項指標(biāo)的測定及實驗現(xiàn)象的觀察，可以看出添加外加碳源琥珀酸鈉且 全程PH保持在7. 00的培養(yǎng)基狀況更適宜于DMF降解細(xì)菌的生長，其次是不添加外加碳源、 初始PH是7. 00且實驗過程中不加以控制的培養(yǎng)條件也適宜于DMF降解微生物的活動。因 此富集培養(yǎng)時選擇的最佳的培養(yǎng)條件是1號和4號，即初始ρΗ是7. 00且全程不加以控制、 不添加任何外加碳源和添加琥珀酸鈉、實驗全程PH保持在7. 00的兩組。
表格1 DMF降解微生物篩選培養(yǎng)實驗各組的接種情況
富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)過程所用培養(yǎng)基與之前的篩選培養(yǎng)實驗所用培養(yǎng)基相同。根據(jù)細(xì) 菌篩選培養(yǎng)的結(jié)果分析選取1、4號進(jìn)行富集培養(yǎng)。接種物選用DMF降解細(xì)菌篩選培養(yǎng)時1、 4號污泥。接種量是50 mL，用培養(yǎng)基稀釋到200 mL。DMF添加量為體積比1 :250。其他培 養(yǎng)條件同前。每天測定其中DMF的含量、氨氮含量、0D540和ρΗ。采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式， 當(dāng)二甲基甲酰胺濃度由2600mg/L降至250mg/L左右時，撇掉2/3的培養(yǎng)液，補(bǔ)充添加新鮮 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)5個周期的培養(yǎng)，獲得富集的可降解二甲基甲酰胺的菌群。
具體試驗實施例
試驗實施例1 DMF降解微生物富集培養(yǎng)的鑒定
本實驗中通過測定生物反應(yīng)速率來判斷降解DMF微生物富集培養(yǎng)是否成功。具體流程 如下取兩個相同的250mL三角瓶，1號瓶取200mL活性污泥，離心之后將污泥利用培養(yǎng)基稀釋到200mL ；2號瓶取200mL活性污泥和300mL左右DMF降解微生物的富集培養(yǎng)液進(jìn)行 離心。離心后撇掉上清液，將泥利用培養(yǎng)基稀釋到200mL。兩個三角瓶中DMF添加量為0. 1% 體積比。PH調(diào)至7. 00，于相同條件下培養(yǎng)。每2小時離心取樣一次，測定其DMF含量，同時 檢測PH變化。通過DMF降解速率的異同來驗證DMF降解微生物是否富集。在實驗開始和 結(jié)束分別測定培養(yǎng)液的MLSS含量以計算每克MLSS的DMF去除率。由圖1可見，添加富集菌的活性污泥與未添加富集菌的活性污泥的DMF去除量相 差很多，僅加活性污泥的對照組的DMF去除量為142 mg/L，添加富集菌的活性污泥對照組 的DMF去除量為456 mg/L。如圖2所示，圖中1是未添加富集菌的活性污泥，其DMF去除 速率為14. 24 mgDMF/(g(MLSS) · d) ；2是添加富集菌的活性污泥，其DMF去除速率為30. 72 mgDMF/(g(MLSS) · d)?；钚晕勰嗟腗LSS為11167 mg/L，添加富集菌的活性污泥的MLSS為 12320 mg/L。兩組的MLSS相差不多，但DMF去除速率相差2. 2倍左右。由此很容易知道，2 號DMF較高的去除速率是由于其中DMF降解微生物的存在，且該DMF降解微生物有較高的 活性，由此證明DMF降解微生物富集培養(yǎng)效果明顯。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種可降解二甲基甲酰胺的菌群富集方法，是通過以下步驟實現(xiàn)a、將活性污泥加入到馴化期的培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化培養(yǎng) ；b、再將馴化培養(yǎng)后的的活性污泥加入到二甲基甲酰胺與富集培養(yǎng)基的體積比為1250的培養(yǎng)液中進(jìn)行富集培養(yǎng);c、將上述培養(yǎng)液在好氧條件下放置在恒溫振蕩箱中，保持恒溫28℃～32℃、振蕩頻率150rpm，振蕩培養(yǎng)5～6天為一周期；d、在每一周期培養(yǎng)結(jié)束后，去掉2/3的培養(yǎng)液，再補(bǔ)充添加新的富集培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，共經(jīng)過5個周期的培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟a中馴化期的培養(yǎng)基組分 為=K2HPO4 6. 8g、KH2PO4 1. 2g、MgSO4. 7H20 0. lg、MnSO4. 4H20 0. lg、CaCl2. 2H20 0. lg、 FeSO4. 7H20 0. lg、Na2MoO7. 2H20 0. 006g 和蒸溜水 1000ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟b中富集培養(yǎng)期的培養(yǎng) 基組分為=KH2PO4 5g、CaCl2. 2H20 0. 022g、MgSO4. 7H20 0. 040g、FeCl3. 6H20 0. 0075g、 Na2MoO7J2O 0. 001 lg、ZnSO4. 7H20 0. 0007g、MnSO4. 4H20 0. 0006g、CuSO4. 5H20 0. 0006g、CoCl2. 6H20 0. 0006g 和蒸溜水 1000mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的方法，其特征在于在培養(yǎng)過程中用NaOH或H2SO4 調(diào)節(jié)其PH為7. 00。
全文摘要
本發(fā)明涉及環(huán)境微生物領(lǐng)域，尤其涉及一種可降解二甲基甲酰胺(DMF)的菌群富集方法。針對DMF在工業(yè)廢水處理中不易降解或降解效果不理想的問題。本發(fā)明公開了一種可降解二甲基甲酰胺的菌群富集方法，其特征在于將活性污泥加入到馴化期的培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化培養(yǎng)，再將馴化培養(yǎng)后的活性污泥加入到二甲基甲酰胺與富集培養(yǎng)基的體積比為1250的培養(yǎng)液中進(jìn)行富集培養(yǎng)，用NaOH或H2SO4調(diào)節(jié)其pH至7.00；在好氧條件下放置在恒溫振蕩箱QW—A中在恒溫30℃±2℃，振蕩頻率150rpm左右振蕩培養(yǎng)5至6天。本發(fā)明的目的在于為工業(yè)廢水的生化處理提供一種經(jīng)濟(jì)高效的可降解DMF的菌群的富集方法。
文檔編號C12N1/20GK101914479SQ20101026667
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月30日
發(fā)明者宋巖, 崔榮, 張鵬, 李金玲, 韓京龍 申請人:煙臺大學(xué)