專利名稱：小鼠精原干細胞的體外分離培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及小鼠精原干細胞的體外分離培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基。
背景技術：
精原干細胞是部分未分化的A型精原細胞，位于雄性哺乳動物睪丸曲細精管生精上皮基膜內，在復雜而高度有序的精子發(fā)生過程中占據極其重要的地位。精原干細胞是一種可以將基因傳遞給后代的干細胞，在雄性生物中精原干細胞正常的自我更新和增殖、分化保證了終生的生殖細胞供應。精原干細胞維持一定的數目以及保持正常的增殖、分化功能是確保男性生育的關鍵。在合適的環(huán)境和條件下，精原干細胞能夠分化為其他組織的細胞精原干細胞的研究與應用需要獲得長期培養(yǎng)并維持其體內分化能力的穩(wěn)定細胞系，這些穩(wěn)定細胞系的培養(yǎng)大都來自于幼年小鼠的睪丸組織，孫源等在《小鼠精原干細胞體外培養(yǎng)體系的建立[J].中華男科學雜志，2008，14(8) :695 700》中披露了以下內容取出生后2 6d的雄性ICR小鼠30只，脫頸法處死，切取睪丸后，采用兩步酶消化法制成單細胞懸液，添加特定培養(yǎng)液，以小鼠胚胎成纖維細胞作為飼養(yǎng)層細胞進行體外培養(yǎng)。對培養(yǎng)細胞進行鑒定，結果小鼠精原干細胞在體外穩(wěn)定增殖，所得克隆AP強陽性，標記物檢測 GFRa -l+/0ct-4+/VASA+/SCP3-，基因表達 GFR a -l+/0ct_4+/SCP3-，證實所培養(yǎng)細胞為處于未分化狀態(tài)的小鼠精原干細胞。在本研究建立的培養(yǎng)體系下小鼠精原干細胞可穩(wěn)定傳代并保持未分化狀態(tài)，為探索體外精子發(fā)生過程提供了良好的研究平臺?！蹲匀弧冯s志在2006 年第 440 卷第 7088 期第 1199 1203 頁刊登了《Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis》(成年小鼠精原干細胞的多潛能性)一文，文中提及，成年個體精原干細胞可發(fā)育成各種組織。經對現(xiàn)有技術的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，《突變研究》(Mutat. Res.)雜志在1993年第 290 期 193 200 頁刊登了一篇名為《A quantitative study of spermatogonial multiplication and stem cell renewal in the C3H/101 Fl hybrid mouse》 (C3H/101 Fl雜交鼠中精原干細胞自我更新的定量研究)的文章，文中提及，在幼年個體中，大約每1 萬個睪丸細胞中才有2 3個精原干細胞，僅占睪丸所有生精上皮細胞總數的0. 02% 0. 03%，而成年睪丸中精原干細胞所占的比例更低，分化程度更高，因而長期培養(yǎng)的難度更大。用成年小鼠精原干細胞建立細胞系并產生后代小鼠，在國內外均未見相關報道。因此， 本發(fā)明要解決的技術問題是如何在體外培養(yǎng)成年小鼠精原干細胞。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種小鼠精原干細胞的體外分離培養(yǎng)方法。利用本發(fā)明的方法，可使得來源于幼體或成體小鼠的精原干細胞均能夠在體外長期培養(yǎng)并增殖，能夠建立長期維持穩(wěn)定生長的精原干細胞系，并且維持其精子發(fā)生的功能。
一種小鼠精原干細胞的體外分離培養(yǎng)方法，包括如下步驟步驟一，收集小鼠睪丸，采用兩步酶消化法制備細胞懸液；

步驟二，利用免疫磁珠分選法分離出精原干細胞；步驟三，制備精原干細胞的培養(yǎng)液，對精原干細胞進行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。步驟一中，所述免疫磁珠分選法使用的磁珠為Thyl磁珠。步驟一中，所述Thyl磁珠為⑶90。步驟三中，所述原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)時加入STO細胞飼養(yǎng)層，所述STO細胞飼養(yǎng)層的制備方法具體為向STO細胞中加入含10 μ 1/ml絲裂霉素C的STO細胞培養(yǎng)液，之后于培養(yǎng)箱培養(yǎng)；PBS緩沖液洗滌；加入0. 25%胰蛋白酶，置于培養(yǎng)箱中消化4-5min ；加入STO 細胞培養(yǎng)液終止胰蛋白酶消化，并用移液槍吹打，使細胞分散均勻；轉移細胞懸液至離心管中，離心，棄去上清液，向離心管中加入STO細胞培養(yǎng)液，用移液槍吹勻細胞，然后分至鋪有明膠的平皿中，加入STO細胞培養(yǎng)液，用移液槍將培養(yǎng)液均勻分散處理的細胞，培養(yǎng)24h后， 得到的STO細胞即可作為精原干細胞的飼養(yǎng)層。所述STO 細胞培養(yǎng)液配方88% DMEM，10% FBS,0. 3mg/ml L-谷氨酰胺，100U/ml
青霄素。步驟三中，所述傳代培養(yǎng)具體為4-7天傳代1次。本發(fā)明的另一個目的在于還提供一種小鼠精原干細胞的體外分離培養(yǎng)方法所使用的培養(yǎng)基，由STO細胞飼養(yǎng)層和精原干細胞培養(yǎng)液組成，所述精原干細胞培養(yǎng)液包括 MEM- α、FBS、L-谷氨酰胺、LIF、bFGF、胰島素、維生素C、EGF、⑶NF。優(yōu)選地，所述精原干細胞培養(yǎng)液進一步包括非必需氨基酸、β-巰基乙醇、丙酮酸鈉中的一種以上。優(yōu)選地，所述FBS的體積百分含量為8-10%，所述LIF的含量為102_104U/ml，所述bFGF的含量為0. 02-0. 03μ g/ml，所述IGF-IR激活劑的含量為0. 04-0. 06μ g/ml，所述 EGF的含量為0. 01-0. 02 μ g/ml，所述維生素C的含量為40-60 μ g/ml，所述⑶NF的含量為 0.01-0. 02 μ g/ml。優(yōu)選地，在所述精原干細胞培養(yǎng)液中，所述FBS的體積百分比為10%，所述LIF的含量為103u/ml，所述bFGF的含量為0. 025 μ g/ml，所述IGF-IR激活劑的含量為0. 05 μ g/ ml，所述維生素C的含量為50 μ g/ml，所述EGF的含量為0. 01 μ g/ml，所述⑶NF的含量為 0.01 μ g/ml。步驟三中，配制所述精原干細胞的培養(yǎng)液的具體步驟為100ml精原干細胞培養(yǎng)液的配制為取86. 8ml MEM- α，IOml FBS, Iml 30mg/ml L-谷氨酰胺，Iml非必需氨基酸， Iml 100mmol/L 丙酮酸鈉，0. 7μ 1β-巰基乙醇，100μ 1 106U/ml LIF, 5 μ 1 1 μ g/μ 1 胰島素，5 μ 1 lmg/ml 維生素 C，2. 5μ 1 1 μ g/ μ 1 bFGF, 1 μ 1 1 μ g/ μ 1 EGF, 1μ 11μ g/μ 1 ⑶NF ；將以上各組分混勻即得。所述非必需氨基酸購買自Invitrogen公司。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果利用本發(fā)明的方法，可使得來源于幼體或成體小鼠的精原干細胞均能夠在體外長期培養(yǎng)并增殖，能夠建立長期維持穩(wěn)定的精原干細胞系，并且維持其精子發(fā)生的功能；同時，本發(fā)明的方法操作簡便，安全可靠，成本低廉。


圖1 穩(wěn)定的小鼠精原干細胞系的建立的照片。(a)顯示培養(yǎng)在絲裂霉素C處理過的STO細胞飼養(yǎng)層上24小時后的成年精原干細胞形態(tài)(箭頭所示)。(b)培養(yǎng)4個月后， 典型的精原干細胞簇和克隆的形態(tài)。比例尺10μπι in a;50ym inb。圖2 精原干細胞移植12周后的睪丸切片的照片，見精子發(fā)生。比例尺40μπι。圖3 :C57BL/6來源的成年小鼠精原干細胞系移植入C57BL/6XCD-1 Fl代受體小鼠后，與純種CD-I小鼠交配，并產生的后代。母親為純白色，后代均為黑色。圖4 =PCR檢測STPB-C轉基因陽性小鼠的免疫熒光檢測照片；M =DNA分子量標準； P 陽性對照；2和7 轉基因陽性鼠；1，3，4，5，6，8，9和10 野生型小鼠。圖5 =Southern雜交驗證STPB-C轉基因陽性小鼠的電泳圖譜；M :DNA分子量標準； P 陽性對照；N 陰性對照；1和3 轉基因陽性小鼠；2，4，5和6 野生型小鼠。圖6 =PCR檢測STPB-C基因沉默小鼠的免疫熒光檢測照片；M =DNA分子量標準；P 陽性對照；6，7，8，9和13 =STPB-C基因沉默小鼠；1，2，3，4，5，10，11，12，14，15和16 野生型小鼠。
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。應理解為這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊見New York Cold Spring Harbor Laboratory出版社1989年版中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1小鼠精原干細胞系的建立與移植步驟一，幼年、成年或老年小鼠精原干細胞的分離將所需的幼年、成年或老年小鼠處死，用75%酒精棉球擦洗小鼠身體；迅速剖腹取雙側睪丸，將睪丸置于約含1/3體積D-Hanks液的冰浴平皿中，并去除睪丸組織的包膜； 另取一滅菌1. 5ml EP管，加入Iml D-Hanks液，將分離的生精小管轉移至其中；取3. 5ml 含lmg/ml膠原酶的D-Hanks液至15ml離心管，將含生精小管的D-Hanks液吸入其中，并用 500 μ 1含膠原酶IV的D-Hanks沖洗殘余組織，一起吸入15ml離心管中，使總體積為5ml ； 將15ml離心管置于37°C水浴，略振蕩消化15min，消化完畢后，IOOOrpm離心5min，棄去上清液；加入5ml D-Hanks液于離心管中，IOOOrpm離心5min，棄去上清液，同法洗滌3次；力口入5ml含0. 25%胰蛋白酶和0. 02% EDTA的D-Hanks液，37°C略振蕩消化lOmin，而后加入 500 μ 1 FBS終止消化；IOOOrpm離心5min，棄去上清液；在細胞中加入400ml免疫磁珠分選 BD buffer (緩沖液)(購買自BD Biosciences公司)以及40 μ 1的Thyl磁珠(CD90)(購買自BD Biosciences公司)，輕輕混勻后，于6_8°C冰箱放置30min ；將1. 5ml離心管安裝固定在磁珠分選架子上，加入混合液于離心管內，然后在磁珠分選架上放置6-8min ；緩慢吸走BD buffer (緩沖液)混合液，取下該離心管(詳情參照BD Biosciences公司的產品手冊(protocol))；加入1.5ml干細胞培養(yǎng)液重懸離心管中的磁珠分選的細胞，將細胞轉入 Φ35mm培養(yǎng)皿或24孔板培養(yǎng)；培養(yǎng)3_4h后，可在顯微鏡下觀察到混雜其中的體細胞開始貼壁，小心傾斜培養(yǎng)皿，將尚未貼壁的精原細胞連同培養(yǎng)液(為精原干細胞培養(yǎng)液)一起吸出，另行接種培養(yǎng)。步驟二，小鼠精原干細胞的體外培養(yǎng)1、精原干細胞的培養(yǎng)液配方
IOOml精原干細胞培養(yǎng)液的配制具體為取86. 9ml MEM- α，IOml FBS, lml30mg/ ml L-谷氨酰胺，Iml非必需氨基酸(購買自Invitrogen公司)，lmllOOmmol/L丙酮酸鈉， 0. 7μ 1β-巰基乙醇，ΙΟΟμ 1 106U/ml LIF,5y 1 1 μ g/μ 1 胰島素，5 μ 1 lmg/ml 維生素 C， 2. 5 μ 1 1 μ g/ μ 1 bFGF，1 μ 1 1 μ g/ μ 1 EGF, 1 μ 1 1 μ g/ μ 1 ⑶NF ；將以上各組分混勻即得。2、STO飼養(yǎng)層細胞的制備(1)取若干新的Φ60πιπι平皿，分別加入Iml明膠，室溫于超凈工作臺放置2h后除
去明膠，繼續(xù)將培養(yǎng)板置于超凈工作臺，晾干后待用；(2)吸去STO培養(yǎng)平皿中舊的培養(yǎng)液，向STO培養(yǎng)平皿中加入含10 μ 1/ml絲裂霉素C的STO培養(yǎng)液2ml (此培養(yǎng)液需事先置于培養(yǎng)箱進行平衡)，將STO培養(yǎng)平皿置于培養(yǎng)箱處理1. 5h，所述STO細胞培養(yǎng)液配方為88% DMEMUO % FBS,0. 3mg/ml L-谷氨酰胺和 100U/ml青霉素；(3)處理1.5h后，取出平皿，移去培養(yǎng)液，向STO培養(yǎng)平皿中加入Iml PBS緩沖液， 輕輕晃動STO培養(yǎng)平皿，棄去PBS緩沖液，如此反復操作5次；(4)向STO培養(yǎng)平皿中加入Iml 0. 25%胰蛋白酶，置于培養(yǎng)箱中消化4-5min ；力口入等體積的新鮮STO培養(yǎng)液(不含絲裂霉素C)終止胰蛋白酶消化，并用移液槍吹打，使細胞分散均勻；(5)轉移細胞懸液至12ml離心管中，IOOOrpm離心5min，棄去上清，向離心管中加入3ml STO培養(yǎng)液(不含絲裂霉素C)，用移液槍吹勻細胞，然后分至2-4個鋪有明膠的步驟 (1)所述的Φ60πιπι平皿中，加入新鮮STO培養(yǎng)液(不含絲裂霉素C)至4ml，并用移液槍將培養(yǎng)液均勻分散處理的細胞；(6)處理后的STO細胞，培養(yǎng)24h后，即可作為精原干細胞的飼養(yǎng)層。3、精原干細胞的培養(yǎng)、建系37V,5% CO2條件下，于STO飼養(yǎng)層上培養(yǎng)精原干細胞，其中精原干細胞培養(yǎng)液的加入量，應根據培養(yǎng)孔或培養(yǎng)皿的大小決定，同時，為了維持該精原干細胞的特性，在精原干細胞的培養(yǎng)液中還需要加入其他特殊的細胞生長因子，如LIF，胰島素，EGF,⑶NF，bFGF 等，具體配制詳見第一步。通常，24孔培養(yǎng)板中，每孔加入500 μ 1精原干細胞培養(yǎng)液，而 Φ60mm培養(yǎng)平皿中，需要加入2ml精原干細胞培養(yǎng)液，同時每48小時換液1次，5-7天傳代 1次。細胞傳代方法傳代之前必須要制備新的STO飼養(yǎng)層細胞，詳見第2步操作。小心移去舊的精原干細胞培養(yǎng)液，加入0. 5ml 0. 25%胰蛋白酶清洗細胞表面，然后移去胰蛋白酶；加入Iml 0. 25%胰蛋白酶，置于37°C培養(yǎng)箱，時間不應超過5min，等到細胞約一半脫落時，加入3ml 新鮮精原干細胞培養(yǎng)液終止消化；用移液槍輕輕吹散細胞，轉移至離心管，IOOOrpm離心 5min,棄去上清液；加入2ml新鮮精原干細胞培養(yǎng)液，用移液槍吹散細胞，然后分至2_4個含有新處理的STO飼養(yǎng)層細胞的Φ60πιπι平皿中；各平皿加入新鮮精原干細胞培養(yǎng)液至4ml，并用移液槍將培養(yǎng)液均勻分散于整個平皿。圖1的(a)顯示了培養(yǎng)在絲裂霉素C處理過的 STO細胞飼養(yǎng)層上24小時后的成年精原干細胞形態(tài)(箭頭所示)。(b)顯示培養(yǎng)4個月后， 典型的精原干細胞簇和克隆的形態(tài)。比例尺10μπι in (a) ；50ymin(b)o4、小鼠精原干細胞系的移植(1)受體小鼠的準備針對4-6周齡雄性小鼠，按40mg/kg劑量腹腔注射白消安(Busulfan，Sigma公司)。注射后，混合飼料喂養(yǎng)至少4周，存活小鼠睪丸生精功能被破壞，可作為受體鼠進行精原細胞移植。(2)精原干細胞懸液的準備用0. 25%胰蛋白酶消化培養(yǎng)物(為培養(yǎng)了 40代的細胞)，轉移漂浮細胞至離心管，1，OOOrpm離心收集精原干細胞細胞，加入冷的滅菌PBS緩沖液重懸細胞，調整細胞密度為約 IO3/μ 1。(3)精原干細胞的移植按75mg/kg劑量，腹腔注射巴比妥鈉麻醉雄鼠。用75%酒精棉球擦洗小鼠身體，沿腹中線附近切開腹腔，擠出睪丸，用毛細玻璃管將細胞懸液多點注入小鼠曲細精管內，注意避免傷及血管。注射完畢后，將睪丸還入腹腔，縫合切口。移植兩個月后，將術后雄鼠與雌鼠合籠。結果顯示將來自精原干細胞系的精原干細胞移植于不孕雄性小鼠曲細精管內，經體內分化產生精子，與雌性小鼠交配產生小鼠后代，見圖2，3。圖2顯示了精原干細胞移植 12周后的睪丸切片，見有精子發(fā)生，比例尺40μπι。圖3顯示了 C57BL/6來源的成年小鼠精原干細胞系移植入C57BL/6 X⑶-1 Fl代受體小鼠后，與純種OT-I小鼠交配，并產生的后代。母親為純白色，后代均為黑色。實施例2獲得過量表達STPB-C的基因工程小鼠步驟一，pFB-STPBC載體構建及重組病毒的收集1、pFB-STPBC 載體的構建(1)目的基因片段的準備pCMV-STPB-C質粒以Hind III和BamH I雙酶切后，1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并切下含目的基因片段的電泳帶，用QIAEX-II Gel Extraction Kit從瓊脂糖凝膠中回收純化STPB-C編碼基因片段，重懸于TE溶液(500ml TE溶液中含有l(wèi)Ommol/L Tris-HCl (pH = 8. 0) 6. 057g,與 lmmol/L EDTA (pH = 8. 0) 1. 8612g)中。(2)載體的準備將真核細胞表達載pFB-neo質粒以HindIII和BamH I雙酶切。通過1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切下含線性載體的電泳帶，凝膠回收純化，重懸于TE溶液中。(3)重組質粒的連接 將酶切回收的目的基因片段和線性pFB-neo質粒用T4 DNA連接酶連接(16°C，過夜)。(4)重組質粒轉化大腸桿菌用熱休克法將重組質粒和陰性對照空載質粒分別轉化感受態(tài)大腸桿菌ToplO，接種于含氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)平皿，37°C恒溫箱過夜。隨機挑取平皿上的單個菌落， 接種于含Amp的4ml LB液體培養(yǎng)基，37°C振搖過夜。通過PCR方法進行重組子的篩選，陽性結果送至測序，進一步分析確定。2、重組病毒顆粒的收集取一個滅菌的EP管 ，加入3yg pFB-STPBC重組質粒、3yg pVPack-GP(gag-pol-expressing vector)禾口 3 μg ρVPack-VSV-G(env-expressing vector)，再加入Iml無水乙醇和0. 1倍體積的NaAc (3M)。用移液槍混勻后，置于_30°C共沉淀過夜。將混合質粒于4°C，12，OOOrpm離心lOmin，棄去上清液。然后加入Iml 70%乙醇，12，OOOrpm離心5min，棄去上清液。將混合質粒保存于4°C，過夜。轉染293T細胞a.觀察Φ60πιπι細胞培養(yǎng)平皿中293T細胞生長情況，當細胞生長至80%平皿時，方可用于轉染實驗。b.移去舊的培養(yǎng)液，加入4ml含MBS[來自 Stratagene公司的ViraPack Transfection kit (病毒包裝轉染試劑盒))的新鮮培養(yǎng)液，置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。c.取出含混合質粒的離心管，加入450 μ 1滅菌超純水，再加入 50 μ 1 Solution I 和 500 μ 1 Solution II [Solution I 和 II 分別來自 Stratagene 公司的 ViraPack Transfection kit (病毒包裝轉染試劑盒)]，用移液槍輕輕地混勻后，室溫靜置 IOmin0 d.取出培養(yǎng)的293T細胞，將上述液體加入到培養(yǎng)皿中，輕輕的搖晃平皿，注意不要將細胞漂浮。再將新細胞放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。e.3h后，移去平皿中的液體，加入4ml含25μΜ chloroquine的培養(yǎng)液。f. 6h后，再移去平皿中的液體，加入4ml不含chloroquine的培養(yǎng)液；收集病毒顆粒收集培養(yǎng)上清，用0. 45 μ m微孔濾器過濾至滅菌離心管中，立即置于液氮中，而后置于-70°C長期保存。步驟二，pFB-STPBC病毒顆粒感染精原干細胞根據實施例1所述小鼠精原干細胞體外分離培養(yǎng)方法培養(yǎng)精原干細胞4d后，將 STPB-C過表達載體病毒顆粒感染該細胞。感染方法如下(1)從-70°C低溫冰箱中取出上述方法制備的含STPB-C載體病毒顆粒培養(yǎng)液，置于37°C水浴中溶解。(2)溶解后迅速加入 DEAE ( 二乙基-2-羥基乙胺)至終濃度為10 μ g/ml。(3)移去干細胞培養(yǎng)皿中舊的培養(yǎng)液， 加入上述含病毒顆粒與DEAE的培養(yǎng)液(24孔培養(yǎng)板每孔加200 μ 1含病毒顆粒培養(yǎng)液)。 (4)3h后向24孔培養(yǎng)板每孔補加200 μ 1新鮮干細胞培養(yǎng)液。步驟三，精原干細胞移植1、受體小鼠的準備對4-6周齡雄性小鼠按40mg/kg劑量腹腔注射白消安(Busulfan，Sigma公司)， 混合飼料喂養(yǎng)至少4周后，存活小鼠睪丸生精功能被破壞，作為受體鼠進行精原細胞移植。2、pFB-STPBC病毒顆粒感染的精原干細胞細胞懸液準備用0.25%胰蛋白酶消化培養(yǎng)物，轉移漂浮細胞至離心管，1，OOOrpm離心收集細胞，加入冷的滅菌PBS緩沖液重懸細胞，調整細胞密度約為IO3/μ 1。3、上述精原干細胞手術移植按75mg/kg劑量，腹腔注射巴比妥鈉麻醉雄鼠。用75%酒精棉球擦洗小鼠身體，沿腹中線附近切開腹腔，擠出睪丸，并用毛細玻璃管將細胞懸液多點注入小鼠曲細精管內，注意避免傷及血管。注射完畢后，將睪丸納入腹腔，縫合切口。移植兩個月后，將術后雄鼠與雌鼠合籠。
結果表明精原干細胞移植于3只不育雄性小鼠曲細精管內，兩只獲得生育，共產生46只后代，經PCR檢測以及Southern雜交進一步證實，其中2只為STPB-C轉基因陽性后代，見圖4、5。其中圖4為PCR檢測的STPB-C轉基因陽性小鼠，M DNA分子量標準；P 陽性對照；2和7 轉基因陽性鼠；1，3，4，5，6，8，9和10 野生型小鼠。圖5為Southern雜交驗證STPB-C轉基因陽性小鼠；M :DNA分子量標準；P 陽性對照；N 陰性對照；1和3 轉基因陽性小鼠；2，4，5和6 野生型小鼠。實施例3 對培養(yǎng)的精原干細胞的驗證1、精原干細胞的體外轉染根據本發(fā)明所述方法進行體外分離并培養(yǎng)精原干細胞大約4天后，將表達目的基因或RNAi的DNA片段通過病毒載體轉染精原干細胞。2、受體動物的準備受體動物可分為先天不育和后天施用藥物導致不育兩種。對于正常動物生精能力的破壞，目前多使用的是白消安(Busulfan，甲磺酸丁二醇二酯)，其作用機理是白消安能使DNA烷基化，從而破壞受體精原干細胞的增殖。因而通過注射白消安至少4周后可進行移植，白消安的用量根據實驗動物的大小確定。3、精原干細胞的移植本發(fā)明采用曲細精管注射法來完成精原干細胞的移植。本方法是用手術顯微鏡注射裝置，將經過基因改造的細胞系直接注射到受體動物的曲細精管。注射完畢，縫合傷口， 消炎看護，保證成活率。曲細精管注射法比較簡單，容易掌握。移植后，經過一段時間雄鼠與雌鼠交配，可獲得經過基因改造的子代小鼠。結果顯示STPB-C基因沉默的精原干細胞分次植入5只不育雄性小鼠曲細精管內， 5只全部生育，共產生82只子代小鼠。通過PCR方法篩選并將其PCR產物測序驗證，檢測到5只STPB-C基因沉默的陽性小鼠(見圖6)。圖6顯示PCR檢測STPB-C基因沉默小鼠； M:DNA分子量標準；P 陽性對照；6，7，8，9和13 :STPB_C基因沉默小鼠；1，2，3，4，5，10，11， 12，14，15和16 野生型小鼠。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。
權利要求
1.小鼠精原干細胞的體外分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，收集小鼠睪丸，采用兩步酶消化法制備細胞懸液；步驟二，利用免疫磁珠分選法分離出精原干細胞；步驟三，制備精原干細胞培養(yǎng)液，對精原干細胞進行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。
2.根據權利要求1所述的小鼠精原干細胞的體外分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟一中，所述免疫磁珠分選法使用的磁珠為Thyl磁珠。
3.根據權利要求2所述的小鼠精原干細胞的體外分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述 Thyl磁珠為CD90。
4.根據權利要求1所述的小鼠精原干細胞的體外分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟三中，所述原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)時加入STO細胞飼養(yǎng)層。
5.如權利要求1所述的小鼠精原干細胞的體外分離培養(yǎng)方法所使用的培養(yǎng)基，其特征在于，由STO細胞飼養(yǎng)層和精原干細胞培養(yǎng)液組成，所述精原干細胞培養(yǎng)液包括MEM- α、 FBS、L-谷氨酰胺、LIF、bFGF、胰島素、維生素C、EGF、⑶NF。
6.根據權利要求5所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述精原干細胞培養(yǎng)液還包括非必需氨基酸、β-巰基乙醇、丙酮酸鈉中的一種以上。
7.根據權利要求5所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述FBS的體積百分含量為8% -10 %， 所述LIF的含量為102-104U/ml，所述bFGF的含量為0. 02-0. 03 μ g/ml，所述IGF-IR激活劑的含量為0. 04-0. 06 μ g/ml，所述EGF的含量為0. 01-0. 02 μ g/ml，所述維生素C的含量為 40-60 μ g/ml，所述 GDNF 的含量為 0. 01-0. 02 μ g/ml。
全文摘要
本發(fā)明提供小鼠精原干細胞的體外分離培養(yǎng)方法，包括如下步驟步驟一，收集小鼠睪丸，采用兩步酶消化法制備細胞懸液；步驟二，利用免疫磁珠分選法分離出精原干細胞；步驟三，制備精原干細胞的培養(yǎng)液，對精原干細胞進行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。本發(fā)明還提供所述方法使用的培養(yǎng)基，由STO細胞飼養(yǎng)層和精原干細胞培養(yǎng)液組成，所述精原干細胞培養(yǎng)液包括基礎培養(yǎng)基、FBS、氨基酸、LIF、bFGF、IGF-1R激活劑、維生素C、EGF、GDNF。利用本發(fā)明的方法和培養(yǎng)基，可使來源于幼體或成體小鼠的精原干細胞均能夠在體外長期培養(yǎng)并增殖，能夠建立長期維持穩(wěn)定生長的精原干細胞系，并且維持其精子發(fā)生的功能。本發(fā)明的方法操作簡便，安全可靠，成本低廉。
文檔編號C12N5/076GK102382799SQ20101026993
公開日2012年3月21日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權日2010年8月31日
發(fā)明者吳際 申請人:吳際