專(zhuān)利名稱(chēng)：玉米兼抗矮花葉病毒及粗縮病毒無(wú)選擇標(biāo)記siRNA復(fù)合表達(dá)載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及一種玉米兼抗矮花葉病毒及 粗縮病毒的復(fù)合表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
玉米是一種重要的糧食、飼料和工業(yè)原料，我國(guó)是世界第二大玉米生產(chǎn)國(guó)。隨著 農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化結(jié)構(gòu)的調(diào)整，我國(guó)玉米種植面積逐年增加。但玉米的病害尤其是矮花葉病毒 (Maize dwarf mosaic virus, MDMV)病以及玉米粗縮病毒(Maize rough dwarf virus, MRDV)病成了制約我國(guó)玉米生產(chǎn)發(fā)展的巨大障礙。不但造成玉米的大量減產(chǎn)和品質(zhì)下降，并 且通過(guò)種子傳遞給后代，造成品種種性退化。玉米矮花葉病主要是通過(guò)蚜蟲(chóng)傳播，在我國(guó)其 病原主要是甘蔗花葉病毒的B株系。在黃淮海夏播玉米區(qū)發(fā)生尤為頻繁和嚴(yán)重。玉米粗縮 病是通過(guò)攜帶病毒的灰飛虱傳播，在我國(guó)主要病原為水稻黑條矮縮病毒，在我國(guó)大面積暴 發(fā)、流行呈明顯上升趨勢(shì)。目前對(duì)這兩種玉米病毒病的防治，多采用農(nóng)藥來(lái)控制傳播病毒的 蚜蟲(chóng)和灰飛虱，從而使植物免受病毒侵染，但農(nóng)藥價(jià)格較高、易造成污染、費(fèi)工費(fèi)時(shí)且防治 效果差。因此，培育推廣抗病品種已成為病毒病防治的迫切需求，利用病毒基因轉(zhuǎn)化植物已 成為解決植物病毒的主要手段。利用病毒目的基因如外殼蛋白(CP)基因、復(fù)制酶基因和運(yùn) 動(dòng)蛋白基因等進(jìn)行抗病基因工程研究已經(jīng)取得了一定的成果。RNA沉默是一種真核生物共有的、轉(zhuǎn)錄后水平起作用的同源依賴(lài)的基因沉默現(xiàn)象。 目前RNAi作為一種高效的反向遺傳學(xué)手段，已廣泛應(yīng)用于多種動(dòng)植物的功能基因組研究 和代謝途徑分析，并且在植物的抗病毒育種中也表現(xiàn)出了巨大的優(yōu)勢(shì)，具有抗病性強(qiáng)、抗性 持久、抗性植株頻率高和生物安全性高，遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，成為植物抗病毒基因工程的熱 點(diǎn)。眾多的植物病毒學(xué)工作者正通過(guò)各種方式利用RNA介導(dǎo)的干擾技術(shù)進(jìn)行植物抗病毒方 面的研究，而其中應(yīng)用方式最多的是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化使可表達(dá)dsRNA的T-DNA片段 整合到植物體基因組，然后檢測(cè)轉(zhuǎn)化體對(duì)病毒的抗性。隨著植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，人們利用多種轉(zhuǎn)化方法尤其是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源 基因轉(zhuǎn)化到植物體內(nèi)，而選擇標(biāo)記基因的應(yīng)用使植物基因工程成為可能。目前，植物基因工 程中應(yīng)用的選擇標(biāo)記基因主要是編碼抗生素的抗性基因或除草劑抗性基因，然而，選擇標(biāo) 記基因及其蛋白產(chǎn)物引起人們對(duì)其安全性方面的擔(dān)憂(yōu)，在人類(lèi)健康安全性方面，人們擔(dān)心 選擇標(biāo)記基因及其產(chǎn)物在食用時(shí)是否有毒性或者會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)；其次，當(dāng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品所 攜帶的選擇標(biāo)記基因是編碼某些應(yīng)用于臨床或腸道抗生素的抗性物時(shí)，它們是否可能被轉(zhuǎn) 移到微生物中，從而增強(qiáng)病原微生物的抗藥性，引起抗生素失效；在環(huán)境安全方面，人們擔(dān) 心帶有除草劑抗性選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物是否會(huì)擴(kuò)散于環(huán)境中，從而危害其他作物的 安全生產(chǎn)；除草劑抗性的選擇標(biāo)記基因是否會(huì)平行轉(zhuǎn)移進(jìn)野草中，使其轉(zhuǎn)變?yōu)殡y以控制的 害草，造成生態(tài)平衡的破壞等。選擇標(biāo)記基因的存在還限制了轉(zhuǎn)基因植物的進(jìn)一步改良。近 年來(lái)，無(wú)選擇標(biāo)記基因植物的培育已成為植物基因工程研究的一個(gè)新趨勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足之處，提供玉米兼抗矮花葉病毒和粗 縮病毒的無(wú)選擇標(biāo)記siRNA復(fù)合表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，以此來(lái)誘導(dǎo)植物對(duì)病原物產(chǎn)生抗 性，可以形成一種防治作物病害的新方法。本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是玉米兼抗矮花葉病毒和粗縮病毒的無(wú)選擇標(biāo)記siRNA復(fù)合表達(dá)載體，利用RT-PCR 分別擴(kuò)增玉米矮花葉病毒及粗縮病毒外殼蛋白基因特異性片段，構(gòu)建反向重復(fù)表達(dá)載體， 利用中間載體pBluscript SK，分別將玉米矮花葉病毒外殼蛋白及粗縮病毒外殼蛋白兩個(gè) 反向重復(fù)片段串聯(lián)在一起；將含雙T的真核表達(dá)載體pDTB用Hindlll-EcoRI酶切，連入 Ubiquitin啟動(dòng)子及Nos終止子，再將串聯(lián)重復(fù)片段連入載體中，構(gòu)建成兼抗玉米矮花葉病 毒及粗縮病毒的無(wú)選擇標(biāo)記siRNA復(fù)合表達(dá)載體。一種玉米兼抗矮花葉病毒及粗縮病毒無(wú)選擇標(biāo)記siRNA復(fù)合表達(dá)載體的構(gòu)建方 法，包括如下操作步驟(1)利用GenBank和MaizeSeq等數(shù)據(jù)庫(kù)中的矮花葉病毒和粗縮病毒外殼蛋白基 因全序列信息，與已知玉米表達(dá)序列和基因組序列以及人類(lèi)基因組序列進(jìn)行同源性比對(duì)， 確定目的基因片段序列分別為矮花葉病毒上游512-658bp，共147bp ；下游743_882bp，共 140bp ；粗縮病毒ORF框上游555-685bp，共131bp ；下游1444_1573bp，共129bp ；設(shè)計(jì)特異 性引物，RT-PCR擴(kuò)增CP基因特異性片段；(2)利用pUCCRNAi載體構(gòu)建MDMV CP及MDRV CP基因特異性片段的反向重復(fù)表達(dá) 載體pUCCRNAi+2F載體；(3)利用PstI-SalI酶切將粗縮病毒的反向重復(fù)片段插入到pBluscript SK中，再 利用PstI單酶切將矮花葉病毒反向重復(fù)片段插入到pBluscript SK中，構(gòu)建中間復(fù)合載體 pBluscript+SM ；(4)利用HindIII-EcoRI酶切雙T載體pDTB，插入U(xiǎn)biquitin啟動(dòng)子及Nos終止 子，構(gòu)建PDTBU中間載體；(5)利用SalI-SacI酶切中間復(fù)合載體pBluscript+SM，插入到經(jīng)SacI單酶切的 PDTBU中間載體中，構(gòu)建兼抗MDMV及MRDV的無(wú)選擇標(biāo)記復(fù)合表達(dá)載體pDTBUSM。本研究以玉米MDMV和MRDV外殼蛋白基因的特異性片段為靶目標(biāo)，構(gòu)建兼抗玉米 矮花葉病毒及玉米粗縮病毒的無(wú)選擇標(biāo)記siRNA復(fù)合表達(dá)載體，對(duì)開(kāi)展抗病毒RNA干擾調(diào) 控技術(shù)研究，創(chuàng)建高抗病毒玉米新種質(zhì)具有重要的理論和實(shí)踐意義。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明方法在技術(shù)上的優(yōu)點(diǎn)如下1、本發(fā)明從病毒RNA中擴(kuò)增特異性干擾片段，利用RNA干涉技術(shù)進(jìn)行玉米抗病毒 病的改良，為植物病毒防治提供新思路。RNA干涉技術(shù)具有高效性、特異性、可遺傳性、操作 簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，這是傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)和反義RNA技術(shù)所無(wú)法比擬的。2、本發(fā)明利用RNA干涉技術(shù)，從病毒自身序列中擴(kuò)增一段與其同源的基因片段， 就可對(duì)受體進(jìn)行研究，因此，研究范圍較為廣泛。而傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)和反義RNA技術(shù)所 要研究的受體一般是完整的基因序列，對(duì)于基因序列不明確的受體，具有明顯的局限性。3、在操作方法上，反義RNA技術(shù)一般要構(gòu)建的是含數(shù)千個(gè)堿基對(duì)的大片段，操作起來(lái)較為困難，而RNA干涉技術(shù)中所要構(gòu)建的載體僅僅是140bp左右的小片段，操作簡(jiǎn)單、 方便，易于運(yùn)用。另外，根據(jù)對(duì)不同病毒的抗性，同時(shí)將來(lái)自不同病毒的干涉片段串聯(lián)一起， 而且一個(gè)基因可選擇一到多個(gè)干涉片段，可對(duì)這些片段或組合進(jìn)行干涉效果的分析、優(yōu)化， 以獲得最有效的片段。4、本發(fā)明將RNA干涉技術(shù)與標(biāo)記基因的分離技術(shù)結(jié)合起來(lái)，構(gòu)建的復(fù)合載體轉(zhuǎn)入 玉米后，在后代的分離中獲得無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的可能性大，解決了常規(guī)轉(zhuǎn)基因潛在的風(fēng) 險(xiǎn)。同時(shí)采用該技術(shù)轉(zhuǎn)化的RNA干涉片段小，對(duì)受體其它農(nóng)藝性狀影響小，遺傳穩(wěn)定性高， 便于獲得對(duì)目的基因干涉而其它農(nóng)藝性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因植株。


圖1為pUCCRNAi載體圖譜。圖2為pDTB載體圖譜。
具體實(shí)施例方式1玉米矮花葉病毒CP基因上游片段Ml反向重復(fù)載體pUCCRNAi+2F的構(gòu)建(正向 147bp+ 內(nèi)含子 199bp+ 反向 247bp = 593bp)1.1目的片段的選擇利用GenBank和MaizeSeq等數(shù)據(jù)庫(kù)中的MDMV和MRDV外殼蛋白基因全序列信息， 與已知玉米表達(dá)序列和基因組序列以及人類(lèi)基因組序列進(jìn)行同源性比對(duì)，確定目的基因 片段序列分別為 MDMV(Genebank Accession Number :S77088)上游 512_658bp，共 147bp ； 下游 743-882bp，共 140bp。MRDV (Genebank Accession Number :AF227206) ORF 框上游 555-685bp，共 131bp ；下游 1444_1573bp，共 129bp。1. 2玉米矮花葉病毒CP基因上游片段Ml的RT-PCR擴(kuò)增提取感染玉米矮花葉病毒病的玉米葉片RNA，利用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反 轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為膜板，設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，分別擴(kuò)增矮花葉病毒病CP基因上 游片段的正向和反向產(chǎn)物。表1玉米MDMV及MRDV CP基因特異性干涉片段RT-PCR擴(kuò)增的引物序列
權(quán)利要求
玉米兼抗矮花葉病毒及粗縮病毒無(wú)選擇標(biāo)記siRNA復(fù)合表達(dá)載體，其特征在于RT PCR分別擴(kuò)增玉米矮花葉病毒及粗縮病毒外殼蛋白基因特異性片段，構(gòu)建反向重復(fù)表達(dá)載體，利用中間載體pBluscript SK，分別將玉米矮花葉病毒外殼蛋白及粗縮病毒外殼蛋白基因兩個(gè)反向重復(fù)片段串聯(lián)在一起；將含雙T的真核表達(dá)載體pDTB用HindIII EcoRI酶切，連入U(xiǎn)biquitin啟動(dòng)子及Nos終止子，再將串聯(lián)重復(fù)片段連入載體中，構(gòu)建成兼抗玉米矮花葉病毒及粗縮病毒的無(wú)選擇標(biāo)記siRNA復(fù)合表達(dá)載體。
2.—種權(quán)利要求1所述玉米兼抗矮花葉病毒及粗縮病毒無(wú)選擇標(biāo)記siRNA復(fù)合表達(dá)載 體的構(gòu)建方法，其特征是包括如下操作步驟(1)利用GenBank和MaizeSeq等數(shù)據(jù)庫(kù)中的矮花葉病毒和粗縮病毒外殼蛋白基因全 序列信息，與已知玉米表達(dá)序列和基因組序列以及人類(lèi)基因組序列進(jìn)行同源性比對(duì)，確定 目的基因片段序列分別為矮花葉病毒上游512-658bp，共147bp ；下游743_882bp，共140bp ； 粗縮病毒ORF框上游555-685bp，共131bp ；下游1444_1573bp，共129bp ；設(shè)計(jì)特異性引物， RT-PCR擴(kuò)增外殼蛋白基因特異性片段；(2)利用pUCCRNAi載體構(gòu)建玉米矮花葉病毒及粗縮病毒外殼蛋白基因特異性片段的 反向重復(fù)表達(dá)載體pUCCRNAi+2F載體；(3)利用PstI-SalI酶切將粗縮病毒的反向重復(fù)片段插入到pBluscriptSK中，再利 用PstI單酶切將矮花葉病毒反向重復(fù)片段插入到pBluscript SK中，構(gòu)建中間復(fù)合載體 pBluscript+SM ；(4)利用HindIII-EcoRI酶切雙T載體pDTB，插入U(xiǎn)biquitin啟動(dòng)子及Nos終止子，構(gòu) 建pDTBU中間載體；(5)利用SalI-SacI酶切中間復(fù)合載體pBluscript+SM，插入到經(jīng)SacI單酶切的pDTBU 中間載體中，構(gòu)建兼抗玉米矮花葉病毒及粗縮病毒的無(wú)選擇標(biāo)記復(fù)合表達(dá)載體PDTBUSM。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種玉米兼抗矮花葉病毒及粗縮病毒無(wú)選擇標(biāo)記siRNA復(fù)合表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。RT-PCR分別擴(kuò)增玉米矮花葉病毒及粗縮病毒外殼蛋白基因特異性片段，構(gòu)建反向重復(fù)表達(dá)載體，利用中間載體分別將玉米矮花葉病毒外殼蛋白及粗縮病毒外殼蛋白兩個(gè)反向重復(fù)片段串聯(lián)在一起；將含雙T的真核表達(dá)載體酶切，連入U(xiǎn)biquitin啟動(dòng)子及Nos終止子，再將串聯(lián)重復(fù)片段連入載體中，構(gòu)建成兼抗玉米矮花葉病毒及粗縮病毒的無(wú)選擇標(biāo)記siRNA復(fù)合表達(dá)載體。本發(fā)明能夠在轉(zhuǎn)化后代中通過(guò)自交分離獲得剔除選擇標(biāo)記的雙抗性植株。本發(fā)明對(duì)開(kāi)展抗病毒RNA干擾調(diào)控技術(shù)研究，創(chuàng)建高抗病毒玉米新種質(zhì)具有重要的理論和實(shí)踐意義。
文檔編號(hào)C12N15/66GK101974549SQ20101027048
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月2日
發(fā)明者張姣, 朱蘇文, 甘德芳, 程備久, 程郢, 趙陽(yáng) 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)