專利名稱：一種豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
目前，常用于檢測(cè)病毒的方法有酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)、定性PCR技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。ELISA靈敏度較高，但檢測(cè)結(jié)果可能包括假陽(yáng)性。定性PCR技術(shù)成本低、易于操作，但靈敏度比較低，且由于其擴(kuò)增產(chǎn)物需通過凝膠電泳分析，極易產(chǎn)生污染。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)由于其高靈敏度、高特異性且操作簡(jiǎn)便而被廣泛應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一種在PCR體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。其化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種。探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計(jì)的弓I物來(lái)指示擴(kuò)增的增加。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)主要有以下三種熒光標(biāo)記1) SYBR Green I SYBR Green I是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。STOR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)， 而不摻入鏈中的STOR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。STOR Green I在核酸的實(shí)時(shí)檢測(cè)方面有很多優(yōu)點(diǎn)，由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制，利用熒光染料可以指示雙鏈DNA熔點(diǎn)的性質(zhì)，通過熔點(diǎn)曲線分析可以識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，區(qū)分非特異擴(kuò)增，進(jìn)一步還可以實(shí)現(xiàn)單色多重測(cè)定。此外，由于一個(gè)PCR產(chǎn)物可以與多分子的染料結(jié)合，因此STOR Green I 的靈敏度很高。但是，由于STOR Green I與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽(yáng)性會(huì)影響定量的精確性。通過測(cè)量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響，同時(shí)，由解鏈曲線來(lái)分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由STOR Green I得到定量結(jié)果。2)分子信標(biāo)分子信標(biāo)是一種在靶DNA不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，位于分子一端的熒光基團(tuán)與分子另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。在此結(jié)構(gòu)中，熒光基團(tuán)被激發(fā)后不是產(chǎn)生光子，而是將能量傳遞給淬滅劑，這一過程稱為熒光諧振能量傳遞(FRET)。由于“黑色”淬滅劑的存在，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來(lái)。如果第二個(gè)熒光基團(tuán)是淬滅劑，其釋放能量的波長(zhǎng)與熒光基團(tuán)的性質(zhì)有關(guān)。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并與目標(biāo)序列互補(bǔ)；莖一般 5-7個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并相互配對(duì)形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。分子信標(biāo)必須非常仔細(xì)的設(shè)計(jì)，以致于在復(fù)性溫度下，模板不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，模板存在時(shí)則與模板配對(duì)。與模板配對(duì)后，分子信標(biāo)的構(gòu)象改變使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí)，它發(fā)出自身波長(zhǎng)的光子。3) TaqMan探針=TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)，它設(shè)計(jì)為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對(duì)。熒光基團(tuán)連接在探針的5’ 末端，而淬滅劑則在3’末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因在 3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5’外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。iTaqMan探針適合于各種耐熱的聚合酶，如DyNAzymeTM II DNA聚合酶。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來(lái)的熒光基團(tuán)不斷積累。因此，熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。即首先通過DNAstar軟件在豬圓環(huán)病毒2型基因組內(nèi)尋找保守序列，在獲得的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，然后通過擴(kuò)增獲得大量的目的片段。將目的片段和PGEM-T easy 載體連接，取連接產(chǎn)物做模板，以設(shè)計(jì)好的特異引物做PCR檢測(cè)?；赥aqMan探針特異性地結(jié)合于目的片段上，所以整個(gè)過程中監(jiān)測(cè)到的熒光量的增加代表了目的片段的生成，保證了實(shí)驗(yàn)的特異性，以解決豬圓環(huán)病毒2型快速、準(zhǔn)確檢測(cè)問題。本發(fā)明所述的豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟1)特異性引物和探針的設(shè)計(jì)和合成本發(fā)明首先設(shè)計(jì)并合成了一個(gè)探針和兩個(gè)特異性上、下游引物分別由 invitrogen公司和上海生物工程有限公司合成，即將pGEM-T easy載體的3' -T突出端與擴(kuò)增得到的目的片段的5' -A突出端配對(duì)，引物上沒有加酶切位點(diǎn)，目的片段和載體的連接為直接的T-A連接。所述上、下游引物的序列如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示，具體如下上游引物5' -CGGATATTGTAKTCCTGGTCGTA-3‘，下游引物5' -CCTGTCCTAGATTCCCCTATTGATT-3‘，所述探針的序列如SEQ ID No 3所示，具體如下FAM-5‘ -CTAGGCCTACGTGGTCTACATTTC-3‘ -TAMRA ；2)目的片段的獲得配制PCR反應(yīng)體系在0. 25ml印pendorf管中加入2XPCR Mix 12. 5 μ 1，上下游引物各 1 μ 1，基因組 DNA 2μ 1 ；PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C 5min，94°C lmin，52°C lmin， 72°C lmin,72°C 10min，35循環(huán)?；厥詹⒓兓疨CR產(chǎn)物，即為目的片段。3)配制連接反應(yīng)體系在0. 5ml印pendorf管中加入快速連接緩沖液5 μ 1, pGEM-T easy載體1 μ 1，PCR 產(chǎn)物2 μ 1，T4連接酶1 μ 1，補(bǔ)加去離子水至總體積10 μ 1。室溫孵育Ih或者4°C孵育過夜。4)轉(zhuǎn)化并提取質(zhì)粒模板將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109受體細(xì)胞中，涂板，選出陽(yáng)性質(zhì)粒克隆，測(cè)序。所提取的質(zhì)粒即可作為后續(xù)試驗(yàn)的模板。5)定性PCR檢測(cè)將陽(yáng)性質(zhì)粒、去離子水和待測(cè)樣品作為模板做定性PCR檢測(cè)。6)定量PCR檢測(cè)將梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，取得標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后以待測(cè)樣品DNA和標(biāo)準(zhǔn)品為模板做定量PCR檢測(cè)。本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好。另外，本發(fā)明設(shè)計(jì)了不同的特異性引物和探針，使實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)檢測(cè)的定量極限和檢測(cè)極限極低， 大大提高了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的靈敏度。本發(fā)明的一種豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法可以制備成試劑盒。使用該試劑盒，就能簡(jiǎn)單地進(jìn)行豬圓環(huán)病毒2型的快速檢測(cè)和定量檢測(cè)。


圖1是本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為質(zhì)粒模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)為循環(huán)閾值。圖2是本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的定量檢測(cè)圖，橫坐標(biāo)為模板拷貝數(shù)量，縱坐標(biāo)為循環(huán)閾值。圖3是本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)極限圖，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為每一時(shí)刻的熒光量。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)驗(yàn)試劑和材料豬圓環(huán)病毒2型、JM109受體細(xì)胞、豬流行性腹瀉PED、豬傳染性胃腸炎TGE、豬輪狀病毒RV、豬藍(lán)耳病PRRS和豬圓環(huán)病毒1型PCVl均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供，pGEM-T easy載體(Promega公司)，其余試劑均購(gòu)于TaKaRa Biotechnology Co. ,Ltd.。膠回收試劑盒(上海生物工程有限公司)，ABI PRISM 3730 GeneticAnalyzer型測(cè)序儀(Applied Biosystems Division of Perkin-Elmer Corp.), ABI 7500 型定量 PCR 儀(美國(guó)生物應(yīng)用系統(tǒng)公司)。實(shí)施例11)目的片段的獲得在豬圓環(huán)病毒2型檢測(cè)研究中，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μ 1 :2XPCR Mix 12. 5 μ 1，上下游引物各1 μ 1，基因組DNA2 μ 1，去離子水補(bǔ)加至總體積 25 μ 1。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C 5min，94°C lmin，52°C lmin，72°C lmin，72°C 10min，35 循環(huán)，通過瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，并用膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，即得目的片段。2)配制連接反應(yīng)體系在純化的2 μ 1 PCR產(chǎn)物中，pGEM-T easy載體1 μ 1，加入T4連接酶1 μ 1，快速連接緩沖液5 μ 1，去離子水1 μ 1，組成10 μ 1的連接反應(yīng)體系。室溫孵育Ih或者4°C孵育過夜。連接液過柱純化，以20 μ 1 ddH20洗脫。3)轉(zhuǎn)化并提取質(zhì)粒模板回收純化的PCR產(chǎn)物與pGEM-T easy載體連接得到的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109受體細(xì)胞中，涂板，選出陽(yáng)性質(zhì)?？寺?。陽(yáng)性質(zhì)?？寺√峤籭nvitrogen公司測(cè)序，測(cè)序儀為ABI PRISM 3730Genetic Analyzer，采用載體通用引物雙向測(cè)序。序列BLASTN比對(duì)分析，149bp 對(duì)應(yīng)豬圓環(huán)病毒BJ0804的1094-1242區(qū)域。
4)定性PCR檢測(cè)分別以待測(cè)樣品、陽(yáng)性質(zhì)粒和去離子水為模板做檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為10XPCR 緩沖液(10Xbuffer)2. 5μ l，25mM氯化鎂(MgCl2) 2 μ 1，三磷酸脫氧核苷酸_Ρ)2μ 1，上下游引物各1μ 1，1.25U DNA聚合酶，模板1 μ 1，去離子水補(bǔ)加至總體積25 μ 1。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5min，94°C 30S，60°C 20S，72°C 20S，72°C 7min，30 循環(huán)，被測(cè)樣品中 78. 3%為豬圓環(huán)病毒2型陽(yáng)性。5)定量PCR檢測(cè)將提取的陽(yáng)性質(zhì)粒梯度稀釋(101(1-10°)作為標(biāo)準(zhǔn)品，使用ABI 7500定量PCR 儀，按以下反應(yīng)體系和反應(yīng)程序做定量PCR檢測(cè)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(參見圖1)。PCR反應(yīng)體系10Xbuffer 2. 5 μ l,25mM MgCl24. 5 μ 1，dNTP 2. 5 μ 1，上下游引物各 1 μ 1，探針
0.5 μ 1,1. 25U DNA聚合酶，模板DNA 1 μ 1，去離子水補(bǔ)加至總體積25 μ 1。PCR反應(yīng)程序 940C IOmin,94°C 15S，60°C 40S，45 循環(huán)。以IO7, IO5, IO3,100，90，80，70，60，50，40，30，20，10，1 拷貝 / 微升的質(zhì)粒為模板做定量PCR，PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序同上。結(jié)果表明，建立的定量PCR方法的定量極限為100拷貝/微升(參見圖2)，檢測(cè)極限為10拷貝/微升(參見圖3)。6)重復(fù)性檢測(cè)以107，105，IO3拷貝/微升的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每個(gè)濃度重復(fù)十次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)，以同樣濃度的標(biāo)準(zhǔn)品做十次實(shí)驗(yàn)間重復(fù)性檢測(cè)，結(jié)果顯示，變異系數(shù)分別在0. 59%到
1.05%和 1. 9%到 4. 2%之間。7)特異性檢測(cè)以 IO8, IO7, IO6, IO5, IO4 拷貝 / 微升的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，PED、TGE、RV、PRRS 的 cDNA 和 PCVl 的DNA為模板做特異性檢測(cè)，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)過程中非豬圓環(huán)病毒2型質(zhì)粒模板的反應(yīng)中無(wú)熒光量的增加，本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物和探針具有很好的特異性。以建立的熒光定量PCR體系作臨床樣品檢測(cè)，結(jié)果顯示，97. 3%的樣品為豬圓環(huán)病毒2型陽(yáng)性，比定性PCR檢測(cè)的檢出率提高了 18%。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所述的一種豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、特性性強(qiáng)、重復(fù)性好，并且檢測(cè)的定量極限和檢測(cè)極限極低，可準(zhǔn)確定量檢測(cè)出豬圓環(huán)病毒2型，起到預(yù)防和控制豬圓環(huán)病毒2型的流行。最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
權(quán)利要求
1.一種豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟1)首先設(shè)計(jì)與合成特異性上、下游引物和探針?biāo)錾稀⑾掠我锏男蛄腥鏢EQID No 1和SEQ ID No 2所示，具體如下上游引物 5' -CGGATATTGTAKTCCTGGTCGTA-3 ‘，下游引物 5' -CCTGTCCTAGATTCCCCTATTGATT-3 ‘，所述探針的序列如SEQ ID No 3所示，具體如下FAM-5‘ -CTAGGCCTACGTGGTCTACATTTC-3‘ -TAMRA ；2)目的片段的獲得配制PCR反應(yīng)體系，按照PCR反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)得到目的片段；3)配制連接反應(yīng)液；4)轉(zhuǎn)化并提取質(zhì)粒模板；5)定性PCR檢測(cè)；6)定量PCR檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)體系為2XPCRMix 10-13 μ 1，上下游引物各0.9-1. 3 μ 1，基因組DNA 1_2 μ 1，去離子水補(bǔ)加至總體積25 μ 1 ； 所述 PCR 反應(yīng)程序?yàn)?MV 5min，94°C lmin，52°C lmin，72°C lmin，72°C lOmin，30-40 循環(huán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述連接反應(yīng)液為2X快速連接緩沖液4-6μ l，pGEM-T easy載體1 μ 1，PCR產(chǎn)物1_3 μ 1，T4連接酶1 μ 1，補(bǔ)加去離子水至總體積 10 μ 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述定性PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為 IOXbuffer 2. 0-3. O μ 1，25mM MgCl2 2 μ 1, dNTP 2 μ 1，上下游引物各 0. 9-1. 3 μ 1，1. 25U DNA聚合酶，模板1-2μ1，去離子水補(bǔ)加至總體積25μ1 ；所述定性PCR檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)?940C 5min，94°C 30S,60°C 20S,72°C 20S,72°C 7min，25-35 循環(huán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述定量PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為 IOXbuffer 2. 5 μ l,25mM MgCl2 4. 5 μ 1，dNTP 2. 5 μ 1，上下游引物各 0. 9-1. 3 μ 1，探針 0. l-Ι.Ομ 1，1.25U DNA聚合酶，模板DNA 1 μ 1，去離子水補(bǔ)加至總體積25 μ 1 ；所述定量 PCR 檢測(cè)的反應(yīng)程序:94°C 10min,94°C 15S，60°C 40S，40-50 循環(huán)。
6.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法在制備熒光定量PCR試劑盒中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法在快速和定量檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟1)首先設(shè)計(jì)并合成特異性引物和探針；2)目的片段的獲得配制PCR反應(yīng)體系，按照PCR反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)得到目的片段；3)配制連接反應(yīng)液；4)轉(zhuǎn)化并提取質(zhì)粒模板；5)定性PCR檢測(cè)；6)定量PCR檢測(cè)。本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特性性強(qiáng)、重復(fù)性好，并且檢測(cè)的定量極限和檢測(cè)極限極低，靈敏度高，可準(zhǔn)確定量檢測(cè)出豬圓環(huán)病毒2型，達(dá)到預(yù)防和控制豬圓環(huán)病毒2型流行的作用。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102382900SQ201010271159
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者劉啟文, 吳瀟, 唐雪明, 施偉, 朱宏, 李春華, 王金斌, 蔣玲曦, 譚芙蓉, 趙凱, 鄒勇, 陶世如, 韓芳婷 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院