專利名稱：一種羊水來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種羊水來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化方法，具體涉及一種源于產(chǎn) 前診斷羊水培養(yǎng)物廢棄上清的羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化方法。
背景技術(shù)：
羊水間充質(zhì)干細(xì)胞(Human amniotic fluid-derived mesenchymal stemcells,人 羊水干細(xì)胞)是一類胎兒間充質(zhì)干細(xì)胞，除具有成體干細(xì)胞無(wú)致瘤性、相對(duì)容易培養(yǎng)等優(yōu) 點(diǎn)外，還具有以下一些特點(diǎn)1、來(lái)源豐富，容易獲??；2、增殖能力和分化能力遠(yuǎn)強(qiáng)于骨髓來(lái) 源的成體干細(xì)胞，在分化能力上更接近于胚胎干細(xì)胞。3、低免疫原性、具有可應(yīng)用于母嬰相 關(guān)疾病的研究和先天性疾病的治療的特殊應(yīng)用前景。自從In’ t Anker等從孕中期(17 22周)羊水中分離培養(yǎng)出胎兒間充質(zhì)干細(xì)胞以來(lái)，人羊水干細(xì)胞成為干細(xì)胞研究的新熱 點(diǎn)，在胎兒組織工程、細(xì)胞治療、藥物篩選等研究領(lǐng)域展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。羊水培養(yǎng)細(xì)胞是多種類型的混合物，包含了 3類形態(tài)和生長(zhǎng)特點(diǎn)的不同的細(xì)胞 上皮樣-E型細(xì)胞、羊水特有-AF型細(xì)胞、成纖維樣-F型細(xì)胞。羊水細(xì)胞通常的貼壁時(shí)間為 5 7天，最早貼壁的是上皮樣-E型細(xì)胞和羊水特有-AF型細(xì)胞，而來(lái)自間充質(zhì)組織的、被 認(rèn)為是人羊水干細(xì)胞來(lái)源的F型細(xì)胞卻通常出現(xiàn)在培養(yǎng)的后期。產(chǎn)前診斷多在羊水培養(yǎng)的 第5 6天收集貼壁細(xì)胞進(jìn)行核型分析，羊水培養(yǎng)物上清液及存留的尚未貼壁的有活力的 細(xì)胞則一并予以廢棄。傳統(tǒng)的人羊水干細(xì)胞分離純化需要經(jīng)過(guò)羊水穿刺、細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，后續(xù)進(jìn)行流式 細(xì)胞或免疫磁珠分選等步驟，操作復(fù)雜，成本昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是探索產(chǎn)前診斷羊水培養(yǎng)物體廢棄上清中胎兒間充質(zhì)干細(xì)胞的體 外分離、純化和擴(kuò)增條件，不干擾產(chǎn)前診斷的程序，也無(wú)需額外的穿刺羊水，為節(jié)儉高效地 進(jìn)行胎兒組織工程種子細(xì)胞庫(kù)的建立和干細(xì)胞的臨床治療奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明采用技術(shù)方案是—種羊水來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化方法，所述方法包括如下順序步驟(1)取產(chǎn)前診斷羊水培養(yǎng)物的廢棄上清(即進(jìn)行產(chǎn)前診斷時(shí)羊水培養(yǎng)物收集貼壁 細(xì)胞后的剩余上清)，以500 lOOOcell/cm2密度種植到培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)至出現(xiàn)梭形類成纖維 細(xì)胞樣的間充質(zhì)干細(xì)胞集落，去除非貼壁細(xì)胞，加入細(xì)胞培養(yǎng)液I繼續(xù)培養(yǎng)4 7天，每2 3天換新鮮培養(yǎng)液；所述細(xì)胞培養(yǎng)基I終濃度組成如下15% FBS+4 8ng/ml bFGF+100U/ml 青霉素 +100U/ml 鏈霉素，溶劑為低糖 DMEM
培養(yǎng)液；(2)取步驟(1)培養(yǎng)獲得的細(xì)胞以5 lOcell/cm2密度種植于培養(yǎng)皿上，加入細(xì)胞 培養(yǎng)液II培養(yǎng)直至單克隆細(xì)胞長(zhǎng)出(約7 12天)，即得所述羊水來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞； 所述細(xì)胞培養(yǎng)液II終濃度組成如下20% FBS+4 8ng/ml bFGF+100U/ml青霉素+100U/ml鏈霉素，溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)液。具體的，所述廢棄上清由如下方法獲得取用于產(chǎn)前診斷的中期(17 22周)無(wú) 菌羊水樣本，1500rpm離心lOmin，取上清(一般1 2mL即可)加等體積細(xì)胞培養(yǎng)液II， 重懸細(xì)胞沉淀，移至T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)7天后，收獲貼壁細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷，收集廢棄上清備 用；所述細(xì)胞培養(yǎng)液II終濃度組成如下20% (v/v)FBS+4 8ng/ml bFGF+100U/ml青霉素 +100U/ml鏈霉素，溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)液。所述細(xì)胞經(jīng)過(guò)特定培養(yǎng)基下經(jīng)過(guò)極低密度種植而成的成纖維樣細(xì)胞，具有多向分 化能力，與成體細(xì)胞相比還具有良好的擴(kuò)增能力，可傳代至15代以上而保持原來(lái)的特性。所述羊水來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定1)細(xì)胞形態(tài)觀察，經(jīng)過(guò)極低密度種植，單克 隆細(xì)胞篩選后成纖維樣細(xì)胞比例大于95% ；2)細(xì)胞增值能力，P5、P8代細(xì)胞的群體倍增時(shí) 間分別為28h、29. 8h ；3)細(xì)胞表型鑒定，全能干細(xì)胞特異表型陽(yáng)性(OCT-4，SSEA-4)間充質(zhì) 表型陽(yáng)性(⑶29，⑶105)，造血系表型陰性(⑶34)，間充質(zhì)干細(xì)胞占到95%以上；4)免疫原 性檢測(cè)，HLA-II抗原陰性(HLA-DR流式檢測(cè)結(jié)果為0.6%) ；5)多向分化能力，具有成骨和 成脂分化能力；6)無(wú)致瘤性。本發(fā)明在以前的研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高，利用簡(jiǎn)單的培養(yǎng)方法，使用梯度血清干 細(xì)胞篩選培養(yǎng)基及單克隆培養(yǎng)的純化方法，得到高純度人羊水干細(xì)胞，使人羊水干細(xì)胞含 量在95%以上，可傳至15代而保持特性，獲得IO9以上人羊水干細(xì)胞，從而獲得足夠的種子 細(xì)胞，此技術(shù)將促進(jìn)人羊水干細(xì)胞在胎兒組織工程、細(xì)胞治療、藥物篩選等研究領(lǐng)域的廣泛 應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)本發(fā)明的原料獲取方便、不存在倫理間題，具 備極強(qiáng)的使用價(jià)值；(2)本發(fā)明所獲得細(xì)胞具有良好的擴(kuò)增能力，可傳至15代而保持特性， 并具有多向分化能力；(3)本發(fā)明所獲得細(xì)胞獲得方法簡(jiǎn)單、效率高、無(wú)需流式，磁珠等分 離純化方法，大大降低了獲得高純度人羊水干細(xì)胞的成本；(4)本發(fā)明細(xì)胞適合于胎兒組 織工程、細(xì)胞治療、藥物篩選和作為組織工程的種子細(xì)胞。


圖1為人羊水干細(xì)胞在各代的生長(zhǎng)情況，形態(tài)高度均一，呈典型的螺旋形生長(zhǎng)；圖2為人羊水干細(xì)胞典型的間充質(zhì)干細(xì)胞表型和免疫原性檢測(cè)；a :CD29 ；b CD105 ；c :CD34 ；d =HLA-DR ；圖3為人羊水干細(xì)胞表達(dá)全能干細(xì)胞標(biāo)志物OCT-4 (a)和SSEA-4 (b)；圖4為成脂鑒定結(jié)果(油紅0染色，標(biāo)尺第1列100um、第2列50um、第3列20um)； a 人羊水干細(xì)胞普通培養(yǎng)14d對(duì)照組；b 人羊水干細(xì)胞脂肪誘導(dǎo)14d實(shí)驗(yàn)組；圖5為成骨鑒定結(jié)果(a、b采用鈣鈷法染色，c、d采用Von Kossa染色，e、f采用 茜素紅染色)；a 人羊水干細(xì)胞普通培養(yǎng)15d對(duì)照組；b 人羊水干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)15d實(shí)驗(yàn) 組；c 人羊水干細(xì)胞普通培養(yǎng)15d對(duì)照組；d 人羊水干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)15d實(shí)驗(yàn)組；e 人羊 水干細(xì)胞普通培養(yǎng)15d對(duì)照組；f 人羊水干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)15d實(shí)驗(yàn)組；圖6為接種不同細(xì)胞含量的人羊水干細(xì)胞/PLGA支架復(fù)合物，經(jīng)過(guò)動(dòng)態(tài)灌流系統(tǒng) 培養(yǎng)8天后支架復(fù)合物內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)；其中以4X IO5個(gè)/支架的細(xì)胞量接種，8天后支架 復(fù)合物內(nèi)細(xì)胞含量最多，活性最強(qiáng)；A :4X IO5個(gè)/支架接種組；B :8X IO5個(gè)/支架接種組；C :2 X IO5個(gè)/支架接種組。 具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此(本發(fā)明中試劑除特殊說(shuō)明均購(gòu)自Irwitrogen公司)實(shí)施例1 產(chǎn)前診斷羊水培養(yǎng)物廢棄上清中人羊水干細(xì)胞的分離、純化和擴(kuò)增(1)無(wú)菌操作取中期羊水樣本，羊水來(lái)自浙江大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)前診斷門診 患者，經(jīng)本人同意將其廢棄上清用于相關(guān)研究，12ml中期羊水樣本1500rpm離心IOmin ；留 Iml上清，加Im細(xì)胞培養(yǎng)液II，重懸細(xì)胞沉淀，移至T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。7天后，收獲貼壁細(xì) 胞，進(jìn)行產(chǎn)前診斷，同時(shí)收集廢棄上清備用；所述細(xì)胞培養(yǎng)液II終濃度組成如下80% (ν/ ν)低糖 DMEM+20% (v/v) FBS+4ng/ml bFGF+lOOU/ml 青霉素+100U/ml 鏈霉素。(2)步驟(1)廢棄上清以500 lOOOcell/em2密度種植到新的培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)至 出現(xiàn)梭形類成纖維細(xì)胞樣的間充質(zhì)干細(xì)胞集落，去除非貼壁細(xì)胞，加入培養(yǎng)液I繼續(xù)培養(yǎng) 4 7天，每2 3天換液。所述細(xì)胞培養(yǎng)基I終濃度組成如下85% (ν/ν)低糖DMEM+15% (v/v) FBS+4ng/ml bFGF+100U/ml 青霉素和鏈霉素；(3)步驟(2)培養(yǎng)獲得的第三代細(xì)胞再以5 lOcell/em2密度種植于培養(yǎng)皿上， 于培養(yǎng)基II中培養(yǎng)直至單克隆細(xì)胞長(zhǎng)出，即得所述羊水來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。所述細(xì)胞培 養(yǎng)液 π 終濃度組成如下80% (v/v)低糖 DMEM+20% (v/v) FBS+4ng/ml bFGF+100U/ml 青 霉素+100U/ml鏈霉素；見細(xì)胞呈均一的成纖維樣細(xì)胞(圖1)。實(shí)施例2 表面抗原特性、免疫原性和全能干細(xì)胞標(biāo)志物檢測(cè)具體分析方法如下1、抗原特性及免疫原性檢測(cè)(1)胰酶消化實(shí)施例1獲得的細(xì)胞，加入等量培養(yǎng)液III，終止消化。所述細(xì)胞培 養(yǎng)基 III 終濃度組成如下85% (v/v)低糖 DMEM+10% (v/v) FBS+100U/ml 青霉素+100U/ml
鏈霉素；(2) PBS IOml洗滌1次后，重懸于1. 2ml含有1% (v/v) FBS的PBS中，制備成細(xì)胞 懸液，按照每管100 μ L的量分裝8支，每支細(xì)胞量控制在5 X IO5 1 X IO6個(gè)；(3)各管依次添加⑶29及其同型對(duì)照、⑶34及其同型對(duì)照、⑶105及其同型對(duì)照、 HLA-DR及其同型對(duì)照各20 μ L，避光4°C孵育30 45分鐘；(4) 1500rpm離心5min去除抗體，添加PBS2 3ml洗滌2次；(5)添加Iml PBS重懸后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，對(duì)于每個(gè)樣本至少計(jì)數(shù)1 X IO4個(gè)。結(jié)果該細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)表型⑶29、⑶105、不表達(dá)造血系表型⑶34和HLA-II抗 原 HLA-DR (圖 2)。2、全能干細(xì)胞標(biāo)志物檢測(cè)(1)胰酶消化實(shí)施例1獲得的細(xì)胞，加入等量培養(yǎng)液III，終止消化，用1 3% (w/ w)的多聚甲醛固定30分鐘(也可4°C保存過(guò)夜)。所述細(xì)胞培養(yǎng)基III終濃度組成如下 85% (v/v)低糖 DMEM+15% (v/v)FBS+100U/ml 青霉素 +100U/ml 鏈霉素；(2)用PBS洗2次；重懸于0. 4ml含有(v/v) FBS的PBS中，制備成細(xì)胞懸液， 按照每管100 μ L的量分裝4支，每支細(xì)胞量控制在5 X IO5 1 X IO6個(gè)；
(3)其中2支加入SSEA-4及同型對(duì)照各20 μ L ；另2支進(jìn)行細(xì)胞膜打孔，加入 0. 1 % (w/w) Triton-X-100,室溫10分鐘，用PBS洗滌2次，加入0CT-4及同型對(duì)照各20 μ L。 避光4°C孵育30 45分鐘；(4) 1500rpm離心5min去除抗體，添加PBS2 3ml洗滌2次；(5)添加Iml PBS重懸后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，對(duì)于每個(gè)樣本至少計(jì)數(shù)1 X IO4個(gè)。結(jié)果表達(dá)全能干細(xì)胞特異標(biāo)記SSEA-4和0CT-4。(圖3)實(shí)施例3 多向分化潛能鑒定1、向脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分低糖DMEM+15% (v/v)FBS+脂肪添加劑(lumol/L地塞米松 +10mg/L胰島素+0. 5mmol/L異丁基甲基黃嘌呤+200umol/L吲哚美辛)誘導(dǎo)方法實(shí)施例1中所得人羊水干細(xì)胞以3 5X103個(gè)/cm2細(xì)胞密度接種 于24孔板，達(dá)90 %匯合時(shí)換為脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)液。每3 4天換液，誘導(dǎo)2周后，通過(guò)油 紅0染色觀察到了染色陽(yáng)性的脂肪顆粒(圖4)，同時(shí)通過(guò)RT-PCR (檢測(cè)引物Forward 5' -GCCATCCGCATCTTTCGA-3‘ ,Reverse 5' -AGGACTCAGGGTGGTTCA-3‘)可檢測(cè)到脂肪組 織中高水平表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子過(guò)氧化物酶增殖物激活受體Y(PPARY)的表達(dá)，說(shuō)明人羊水 干細(xì)胞在特定條件下能夠向脂肪細(xì)胞分化。2、成骨樣細(xì)胞的分化成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液85% (ν/ν)低糖DMEM+15% (v/v)FBS+成骨添加劑(IOOnM 地塞米松+IOmM β -甘油磷酸鈉+0. 05mM維生素C)誘導(dǎo)方法實(shí)施例1中所得人羊水干細(xì)胞以3 5X 103/Cm2細(xì)胞密度接種于24孔 板，達(dá)40%匯合時(shí)換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液。每3 4天換液，誘導(dǎo)12天后，通過(guò)RT-PCR檢測(cè) 到了骨細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2 (Rimx2)和堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)，說(shuō)明 人羊水干細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下能向成骨方向分化；誘導(dǎo)15天后，肉眼可以觀察到24孔板中有 少量白色結(jié)節(jié)，堿性磷酸酶(ALP)、鈣結(jié)節(jié)Von Kossa和茜素紅染色呈陽(yáng)性(圖5)。說(shuō)明此 時(shí)細(xì)胞已產(chǎn)生少量礦化結(jié)節(jié)，有了一定的成骨功能。實(shí)施例4 致瘤實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例1獲得的人羊水干細(xì)胞接種于裸鼠皮下，接種細(xì)胞數(shù)量為IXlO7個(gè)細(xì) 胞，結(jié)果2個(gè)月后仍無(wú)腫瘤形成，表面此方法得到的人羊水干細(xì)胞沒(méi)有明確的致瘤性，臨床 治療應(yīng)用安全可靠。實(shí)施例5 組織工程應(yīng)用I(1)收集實(shí)施例1中所得的人羊水干細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液IV調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至 3X106cell/ml，以制備細(xì)胞懸液，備用。所述細(xì)胞培養(yǎng)液IV終濃度組成如下95% (ν/ν)低 糖DMEM+5% (v/v)FBS+10Mm L-谷氨酰胺+100U/ml青霉素和鏈霉素；(2)取經(jīng)過(guò)24小時(shí)75% (ν/ν)酒精消毒的聚乳酸-乙醇酸復(fù)合物(PLGA)支架，用 無(wú)菌紗布吸干后，在超凈工作臺(tái)中慢速風(fēng)機(jī)吹干，取樣品槽下槽架，將吹干的PLGA支架放 入樣品槽下槽架中，使用硅膠軟管連接樣品槽下槽架的下端出口和無(wú)菌注射器，吸取上述 約250 μ 1的細(xì)胞懸液均勻滴至支架上表面，然后以0. 05ml/min的流速輕輕抽取注射器使 懸液均勻進(jìn)入支架內(nèi)部達(dá)到將人羊水干細(xì)胞在PLGA支架上接種的目的。所述聚乳酸-乙醇 酸復(fù)合物(PLGA)支架基本情況直徑10mm，厚度3mm，孔隙率94. 5% 98. 0%，孔徑280
6450 μ m ；(3)接種完畢后取出支架放于細(xì)胞培養(yǎng)板(六孔板)中靜止2小時(shí)，然后每孔加入 3ml培養(yǎng)基II，靜態(tài)培養(yǎng)24小時(shí)，獲得干細(xì)胞/支架復(fù)合物。所述細(xì)胞培養(yǎng)液II終濃度組 成如下80% (ν/ν)低糖 DMEM+20% (v/v) FBS+4ng/ml bFGF+100U/ml 青霉素+100U/ml 鏈霄素。實(shí)施例6 組織工程應(yīng)用II(1)取實(shí)施例5靜態(tài)培養(yǎng)24小時(shí)后獲得的細(xì)胞/支架復(fù)合物，移入灌流培養(yǎng)裝置 (7524-55,Cole-Parmer公司，上海)的樣品槽下槽架內(nèi)，然后上、下槽架旋轉(zhuǎn)銜接密封樣品 槽，聯(lián)通灌流培養(yǎng)系統(tǒng)，設(shè)定流速0. 2ml/min進(jìn)行灌流培養(yǎng)，每隔三天換液。選用培養(yǎng)液流 速為0. 2ml/min，為達(dá)到低速給液以保證支架內(nèi)部羊水間充質(zhì)干細(xì)胞良好粘附、均勻分布和 高增殖效率的目的。上述灌流培養(yǎng)7天后，增加灌流流速至3. Oml/min進(jìn)行灌流培養(yǎng)到14 天，每隔三天半量換液。選用培養(yǎng)液流速為3. Oml/min,為達(dá)到高流速給液促進(jìn)羊水間充質(zhì) 干細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化的目的。取出上述細(xì)胞/支架復(fù)合物，用PBS洗1次后，從中間切開，加熒光素二乙酯(FDA， Merck公司，上海)染色液，37°C下孵育5分鐘，PBS洗去多余染色液，倒置熒光顯微鏡觀察 拍照，分析羊水間充質(zhì)干細(xì)胞在支架內(nèi)的分布。結(jié)果熒光染色可見人羊水干細(xì)胞在PLGA支架內(nèi)分布均勻，并有較強(qiáng)的活性(圖 6)。總結(jié)(1)本發(fā)明使用的原料產(chǎn)前診斷羊水培養(yǎng)物廢棄上清極易獲取、不存在倫理問(wèn) 題；(2)本發(fā)明所獲得細(xì)胞獲得方法簡(jiǎn)單、效率高、無(wú)需流式，磁珠等分離純化方法，大 大降低了獲得高純度人羊水干細(xì)胞的成本，所獲得細(xì)胞具有良好的擴(kuò)增能力，可傳至15代 而保持特性，能夠得到IO9以上人羊水干細(xì)胞，從而獲得足夠的種子細(xì)胞；(3)本發(fā)明所獲人羊水干細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志，同時(shí)表達(dá)全 能干細(xì)胞標(biāo)志；(4)本發(fā)明所獲人羊水干細(xì)胞具有多向分化能力；(5)本發(fā)明所獲人羊水干細(xì)胞適合于胎兒組織工程、細(xì)胞治療、藥物篩選和作為組 織工程的種子細(xì)胞，與組織工程材料具有良好的相容性。綜上所述，本方法利用產(chǎn)前診斷羊水培養(yǎng)物廢棄上清液經(jīng)過(guò)梯度血清干細(xì)胞篩選 培養(yǎng)基及單克隆培養(yǎng)的純化方法，得到高純度、擴(kuò)增能力強(qiáng)、具備三系分化潛能的人羊水干 細(xì)胞，在胎兒組織工程、細(xì)胞治療、藥物篩選等研究領(lǐng)域展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景，將會(huì)給干 細(xì)胞的應(yīng)用帶來(lái)極大的發(fā)展。
權(quán)利要求
一種羊水來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化方法，所述方法包括如下順序步驟(1)取產(chǎn)前診斷羊水培養(yǎng)物的廢棄上清，以500～1000ce1l/cm2密度種植到培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)至出現(xiàn)梭形類成纖維細(xì)胞樣的間充質(zhì)干細(xì)胞集落，去除非貼壁細(xì)胞，加入細(xì)胞培養(yǎng)液I繼續(xù)培養(yǎng)4～7天，每2～3天換新鮮培養(yǎng)液；所述細(xì)胞培養(yǎng)基I終濃度組成如下15％FBS+4～8ng/ml bFGF+100U/ml青霉素+100U/ml鏈霉素，溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)液；(2)取步驟(1)培養(yǎng)獲得的細(xì)胞以5～10cell/cm2密度種植于培養(yǎng)皿上，加入細(xì)胞培養(yǎng)液II培養(yǎng)直至單克隆細(xì)胞長(zhǎng)出，即得所述羊水來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞；所述細(xì)胞培養(yǎng)液II終濃度組成如下20％FBS+4～8ng/ml bFGF+100U/ml青霉素+100U/ml鏈霉素，溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述廢棄上清由如下方法獲得取用于產(chǎn)前 診斷的中期無(wú)菌羊水樣本，1500rpm離心lOmin，取上清加等體積細(xì)胞培養(yǎng)液II，重懸細(xì)胞 沉淀，移至T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)7天后，收獲貼壁細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷，收集廢棄上清備用；所述 細(xì)胞培養(yǎng)液II終濃度組成如下20% FBS+4 8ng/ml bFGF+100U/ml青霉素+100U/ml鏈 霉素，溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種源于產(chǎn)前診斷羊水培養(yǎng)物廢棄上清的羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化方法。所述細(xì)胞經(jīng)過(guò)特定培養(yǎng)基下經(jīng)過(guò)極低密度種植而成的成纖維樣羊水間充質(zhì)干細(xì)胞，該細(xì)胞具有多向分化能力，與成體細(xì)胞相比還具有良好的擴(kuò)增能力，可傳代至15以上而保持原來(lái)的特性。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)本發(fā)明的原料獲取方便、不存在倫理問(wèn)題，具備極強(qiáng)的使用價(jià)值；(2)本發(fā)明所獲得細(xì)胞具有良好的擴(kuò)增能力，可傳至15代而保持特性，并具有多向分化能力；(3)本發(fā)明所獲得細(xì)胞獲得方法簡(jiǎn)單、效率高、無(wú)需流式，磁珠等分離純化方法，大大降低了獲得高純度人羊水干細(xì)胞的成本；(4)本發(fā)明細(xì)胞適合于胎兒組織工程、細(xì)胞治療、藥物篩選和作為組織工程的種子細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK101948798SQ201010273878
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者徐晨明, 王金福, 胡文勝, 陳松長(zhǎng), 黃祎婷, 黃荷鳳 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)