專利名稱：一種與乳腺癌相關(guān)的血清/血漿miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤學(xué)領(lǐng)域，涉及一種與乳腺癌相關(guān)的血清/血漿miRNA 標(biāo)志物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。據(jù)估計(jì)，全球2002年新發(fā)乳腺癌病例達(dá)115萬， 占女性全部惡性腫瘤發(fā)病的23%，預(yù)計(jì)2010年將達(dá)到140-150萬。在我國，乳腺癌的發(fā)病 率與西方國家相比較低，但近二十年來，其呈現(xiàn)顯著增長趨勢，平均年增長率達(dá)3-4%，遠(yuǎn)遠(yuǎn) 高于0.5%的世界平均增長水平。雖然乳腺癌的預(yù)后較好，但是由于其發(fā)病率較高，仍然是 女性因癌癥死亡的首要原因。在我國北京，上海，天津等城市乳腺癌發(fā)病率已高居女性惡性 腫瘤發(fā)病的第一位、第二位。在2000年到2005年這5年間，我國女性乳腺癌患者增加了 38. 5%，每年因乳腺癌死亡的女性達(dá)1. 3萬人。乳腺癌已成為威脅我國女性健康的首要惡 性腫瘤，是亟待解決的重大公共衛(wèi)生問題。乳腺癌目前雖無特殊的預(yù)防措施，但是若能早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療，預(yù)后 情況一般較好。所以，當(dāng)前及將來相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)，爭取早期診斷仍是乳腺癌防治的一項(xiàng)基 本策略。目前早期診斷乳腺癌的方式主要有乳腺自檢，乳腺鉬靶X線攝影、乳腺彩色多譜勒 超聲檢查、乳腺導(dǎo)管內(nèi)視鏡檢查、乳腺導(dǎo)管灌洗、CT和磁共振等，若有無法辨別的腫塊或膿 腫可進(jìn)行細(xì)胞學(xué)穿刺檢查。盡管近年來乳腺癌的診斷水平不斷上升，但真正較為成熟或有 較好應(yīng)用前景的乳腺癌診斷手段尚不多，有些早期乳腺癌患者由于腫塊較小，或浸潤較輕、 呈膨脹性生長、表現(xiàn)為光滑、活動、邊界清楚，與良性腫瘤不易區(qū)別。此外，由于涉及社會文 化倫理等方面問題，一些年輕女性對于乳腺檢查容易忽視或產(chǎn)生抗拒心理，不但不能保證 診斷對癌癥患者診斷的準(zhǔn)確性，對于處于早期階段的乳腺癌患者，尤其是年輕患者的診斷 能力更為有限。因此，我們亟需發(fā)現(xiàn)更加明確而有效的生物標(biāo)志物，對乳腺癌做出明確的早 期診斷，這將有助于乳腺癌患者做出早期治療，提高生存率。MicroRNAs (即miRNAs)是近年來腫瘤分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)，它的成熟 狀態(tài)是一類長約19-23個(gè)核苷酸的小單鏈RNA分子，進(jìn)化上具有高度保守性。它廣泛存在 于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，其本身不具有開放閱讀框(ORF)。MiRNA 的主要功能是調(diào)節(jié)生物體內(nèi)在的與機(jī)體生長、發(fā)育、疾病發(fā)生過程有關(guān)的基因的表達(dá)。自從 參與調(diào)控線蟲時(shí)序發(fā)育的lin-4與let-7被發(fā)現(xiàn)以來，miRNA分別在2002年和2003年兩度 入選Science雜志年度十大科技突破。2005年預(yù)測miRNAs至少能調(diào)控5300個(gè)人類基因， 即所有基因的30%。隨著研究的深入，越來越多的miRNAs不斷被發(fā)現(xiàn)。聚光燈下的miRNA 已經(jīng)逐步擺脫了 DNA光芒的掩蓋，從“配角”變成“主角”，并且對DNA的中心地位提出了新 的挑戰(zhàn)。近年來，miRNA與腫瘤的關(guān)系已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA通過負(fù) 調(diào)控基因的表達(dá)與肺癌，乳腺癌，胃癌，乳腺癌等的發(fā)病高度相關(guān)。研究已經(jīng)證實(shí)血清/血漿中存在幾百種的miRNAs，這些小分子RNAs性質(zhì)穩(wěn)定、 含量豐富、易于定量檢測，且存在顯著的疾病特異性。現(xiàn)有的成熟的技術(shù)，包括定性和定量miRNA分子的技術(shù)，表明利用血清miRNAs作為分子生物標(biāo)志物的方法比傳統(tǒng)的特異蛋白分 子標(biāo)記方法將更加有效，為生物標(biāo)志物開拓了新境界。然而，目前還沒有用于乳腺癌診斷的較為穩(wěn)定的生物標(biāo)志物的報(bào)道，若能篩選出 乳腺癌異常表達(dá)的血清/血漿miRNAs作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的診斷試劑盒，對我國 乳腺癌的診斷現(xiàn)狀必將是一次有力的推動。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的是針對上述技術(shù)問題，提出一種與乳腺癌相關(guān)的血清/血漿 miRNA標(biāo)志物。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述血清/血漿miRNA標(biāo)志物及其引物在制備乳腺癌 輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明第四個(gè)目的是提供輔助乳腺癌診斷的試劑盒。發(fā)明人通過分離和研究乳腺癌患者及與其年齡匹配的健康女性對照血清/血漿 中的miRNAs，尋找一組與乳腺癌高度相關(guān)的高特異性和敏感性的miRNAs，并研制出可便于 臨床應(yīng)用的乳腺癌診斷試劑盒，為乳腺癌的篩查和診斷提供數(shù)據(jù)支持，為發(fā)現(xiàn)具有潛在治 療價(jià)值的新型小分子藥物提供數(shù)據(jù)支持。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種與乳腺癌相關(guān)的血清/血漿miRNA標(biāo)志物，該標(biāo)志物為miR_16、miR_25、 miR-222 和 miR-324_3p 的組合。所述的血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物，這些引物為miR-16 的引物為 SEQ ID No. 19 和 SEQ ID No. 20 ；miR-25 的引物為 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；miR-222 的引物為 SEQ ID No. 17 和 SEQ ID No. 18 ；miR-324_3p 的引物為 SEQ ID No. 13 和 SEQ ID No. 14。所述的血清/血漿miRNA標(biāo)志物在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。所述血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物在制備乳腺癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。一種乳腺癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測血清/血漿中miR-16、miR-25、 miR-222 和 miR-324_3p。所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有血清/血漿miRNA中miR-16、miR-25和 miR-324-3p 的引物。所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有的血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物為miR-16 的引物為 SEQ ID No. 19 和 SEQ ID No. 20 ；miR-25 的引物為 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；miR-222 的引物為 SEQ ID No. 17 和 SEQ ID No. 18 ；miR-324_3p 的引物為 SEQ ID No. 13 和 SEQ ID No. 14。所述診斷試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液， dNTPs, MgCl2, DEPC水和Taq酶等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌?。具體地說，本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括(1)建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫和數(shù)據(jù) 庫以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床 資料。(2)血清/血漿miRNA差異表達(dá)譜分析選擇乳腺癌病例、與乳腺癌病例年齡匹配的健康女性對照，檢測其血清/血漿miRNA表達(dá)譜及含量，分析乳腺癌病例和健康女性對照 間血清/血漿miRNA的共性和特性，篩選差異表達(dá)miRNAs，進(jìn)行進(jìn)一步大樣本多階段驗(yàn)證。 (3)對已篩選的血清/血漿差異表達(dá)miRNAs在大樣本人群中進(jìn)行定量分析，確定乳腺癌發(fā) 病相關(guān)血清/血漿miRNAs (4)血清/血漿miRNA篩查和診斷試劑盒的研制根據(jù)乳腺癌病 例和健康女性對照的特異血清/血漿miRNA開發(fā)miRNAs診斷試劑盒。本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口 學(xué)資料、臨床資料等(這些資料可用于判斷疾病進(jìn)展，并控制疾病分期、患者年齡等因素 對于發(fā)病的影響)，并采用了 RT-PCR、Real-time PCR方法、Solexa測序技術(shù)、TaqMan Low DensityArray (TLDA)芯片檢測等。具體來說研究的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個(gè)部分1.研究樣本的選擇(1)經(jīng)病理學(xué)明確診斷的乳腺癌病例(2)采血前未經(jīng)過手術(shù)和放化療，無手術(shù)前放化療(3)與病例年齡匹配的健康女性對照本研究共采用196例符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本進(jìn)行研究。2. Trizol 試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)和 miRNeasy Mini Kit (QIAGEN 公司) 提取血清/血漿總RNA，按常規(guī)方法操作。通常能得到 5yg RNA/50ml血清或血漿。3. Solexa 測序(1)總RNA進(jìn)行PAGE電泳回收17_27nt RNA分子(2)將鏈接引物(adaptor prime，Solexa測序通用引物)酶聯(lián)在小RNA分子的3' 與5'端(3)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后進(jìn)行測序(4)數(shù)據(jù)分析與處理4. TLDA(Applied Biosystems 公司)芯片檢測(1)總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品(2)cDNA樣品進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)(3)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TLDA芯片檢測，得到miRNA的表達(dá)譜(4)數(shù)據(jù)分析與處理5. Real-time RT-PCR(qRT-PCR)方法(1)取受試者的血清/血漿總RNA，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品；(2)設(shè)計(jì)引物；(3)加入熒光探針或染料進(jìn)行PCR反應(yīng)；(4)檢測并比較乳腺癌病例與健康女性對照血清/血漿樣本中miRNA的量的變化。6.診斷試劑盒制備方法Solexa測序和TLDA芯片檢測方法綜合確定乳腺癌病例和健康女性對照中有拷貝 差異和表達(dá)差異，且方向一致的miRNA，通過qRT-PCR技術(shù)篩選在乳腺癌病例和健康女性對 照中表達(dá)量和差異程度大的一組血清/血漿miRNA，作為輔助乳腺癌診斷的指標(biāo)。最后篩選 出的與乳腺癌發(fā)病有關(guān)的血清/血漿miRNA組成診斷試劑盒(miR-16、miR-25、miR-222和 miR-324-3p)。診斷試劑盒可以包括這些血清/血漿微小核糖核酸組合的引物，探針，以及
5Taq酶、dNTP等試劑。7.統(tǒng)計(jì)分析方法運(yùn)用x2檢驗(yàn)(用于分類變量)或者student t檢驗(yàn)(用于連續(xù)性變量)比較人 口學(xué)特征、組織類型和miRNA平均表達(dá)水平在研究對象組間分布的差異。我們在探索性樣本人群(48例乳腺癌病例和48例健康女性對照)中綜合運(yùn)用 Solexa測序和TLDA芯片的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)有10種miRNAs與乳腺癌發(fā)病情況有顯著關(guān)聯(lián)。 個(gè)體miRNAs檢測的不同表達(dá)水平以表示，其中Δ Ct = CTtMi-CTrt ，我們在每一個(gè)樣本 提取時(shí)加入cel-mir-39的RNA作為參照，計(jì)算相對表達(dá)量。對有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的miRNAs 在另外50例乳腺癌病例和50例對照中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，進(jìn)而觀察本研究結(jié)果的穩(wěn)定程度。為了進(jìn)一步研究這四種miRNAs構(gòu)成的綜合指征用于乳腺癌診斷的效果，我們構(gòu) 建了一個(gè)數(shù)學(xué)公式，綜合考慮每種miRNA與乳腺癌發(fā)病的正、負(fù)關(guān)聯(lián)情況和聯(lián)系強(qiáng)度。具 體來說，首先以探索性人群健康女性對照組miR-16、miR-25、miR-222和miR-324_3p表達(dá) 量的單側(cè)95%參考值范圍為標(biāo)準(zhǔn)，分別將這4種miRNA的表達(dá)水平評為0分和1分，然后 我們再以探索性樣本對照人群的回歸系數(shù)為權(quán)重，綜合考慮每種miRNA的表達(dá)情況給每 個(gè)病人確定一個(gè)危險(xiǎn)分值。危險(xiǎn)分值的計(jì)算方法如下危險(xiǎn)分值=(4.023XmiR-16的評 分)+ (3. 646 XmiR-25 的評分)+ (2. 347 XmiR-222 的評分)+ (3. 219 XmiR-324_3p 的評分)， 獲得的危險(xiǎn)分值系數(shù)以及界限值被直接應(yīng)用于驗(yàn)證樣本人群和總的196例樣本人群中。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均通過專門的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件完成(SAS，v. 9. 1. 3)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水 平P值設(shè)為0. 05，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。以下是本發(fā)明進(jìn)一步的說明在上述48例符合條件的乳腺癌病例及48例健康女性對照中，兩組年齡按個(gè)體精 確匹配。我們將這兩組人群作為探索性樣本經(jīng)Solexa測序試驗(yàn)及TLDA芯片檢測獲得相關(guān)結(jié)果。根據(jù)Solexa測序方法，本發(fā)明人檢測到在“乳腺癌病例”組和“健康女性對照”組 的血清中存在差異表達(dá)(2組的拷貝數(shù)倍數(shù)差異大于4)的微小核糖核酸包括hsa-let-7b、 hsa-miR-1、hsa_miR-103、hsa_miR-107、hsa_miR-10a、hsa_miR-10b、hsa_miR-1246、 hsa-miR-1294、hsa_miR-1301、hsa_miR-1307、hsa-miR-151_3p、hsa-miR-199a_3p、 hsa-miR-199b_3p、hsa-miR-206、hsa_miR-22、hsa-miR-222、hsa-miR-223、hsa-miR-25、 hsa_miR-30a、 hsa_miR-320b、 hsa_miR-320c、 hsa-miR-324_3p、 hsa-miR-330_3p、 hsa-miR-339_3p、hsa-miR-342_5p、hsa-miR-361_3p、hsa—miR-375、hsa-miR-409_3p、 hsa-miR-423_3p、 hsa-miR-423_5p、 hsa_miR-425、 hsa_miR-432、 hsa_miR-433、 hsa—miR-451、hsa-miR-483_5p、hsa-miR-486_5p、hsa-miR-501_3p、hsa—miR-584、 hsa-miR-629、hsa_miR-720、hsa_miR_744、hsa_miR-874、hsa_miR_92a、hsa_miR_92b、 hsa_miR-99b0根據(jù)TLDA芯片檢測，本發(fā)明人檢測到在“乳腺癌病例”組和“健康女性對 照”組的血清中存在差異表達(dá)(Δ Δ CT > 2)的微小核糖核酸包括haS-miR-155、 hsa_let_7a氺、hsa_let_7b、 hsa_let_7e、 hsa_let_7g氺、hsa_let_7g、 hsa_miR_101、 hsa_miR—105、hsa_miR—106a、hsa_miR—106b、hsa_miR—10b*、hsa_miR—10b、hsa_miR—122*、 hsa-miR-125a_3p、 hsa_miR-126*、 hsa_miR-126、 hsa_miR-130a、 hsa_miR-132、hsa_miR-133a、hsa—miR-134、hsa_miR-135a*、hsa—miR-136*、hsa-miR-140_3p、 hsa-miR-140-5p、 hsa-miR-142_5p、 hsa_miR-143、 hsa_miR-l、 hsa_miR-144*、 hsa-miR-145*、h sa_miR_146a、hsa-miR-146b_3p、hsa-miR-146b_5p、hsa_miR-148b、 hsa-miR—149、 hsa—miR-150、 hsa—miR-15l_3p、 hsa_miR-15a*、 hsa-miR-16—1*、 hsa-miR-16、hsa_miR-17*、hsa_miR-17、hsa_miR-182、hsa_miR-183*、hsa_miR-183、 hsa-miR-lSSAhsa-miR-lSGAhsa-miR-lSa^hsa-miR-lStKhsa-miR-ig^Uhsa-miR-igSa-Sp、 hsa_miR-193b*、hsa—miR-195、hsa_miR-196b、hsa-miR-199a_3p、hsa-miR-199a_5p、 hsa_miR-19a、hsa_miR-19b、hsa_miR-200c、hsa—miR-205、hsa_miR-20a*、hsa_miR-20a、 hsa-miR-20b、hsa_miR_21*、hsa_miR-210、hsa_miR_21、hsa_miR-214、hsa_miR_22*、 hsa-miR-222、hsa_miR_223*、hsa_miR_223、hsa_miR_23a、hsa_miR_24、hsa_miR_25、 hsa-miR-26a_l*、 hsa_miR_26b*、 hsa_miR-27a、 hsa_miR-27b、 hsa_miR-29a、 hsa-miR-29b-2*、hsa_miR_29b、hsa_miR_29c*、hsa_miR_29c、hsa_miR-30lb、h sa_miR-30a、hsa_miR-30d、hsa_miR-30e*、hsa_miR-30e、hsa—miR-320、hsa—miR-32、 hsa-miR-324_3p、 hsa_miR-326、 hsa-miR-330_3p、 hsa_miR-335、 hsa-miR-337_3p、 hsa-miR-338_3p、hsa-miR-339_3p、hsa_miR-33a*、hsa—miR-340、hsa-miR-342_3p、 hsa-miR-342_5p、 hsa_miR-345、 hsa_miR-346、 hsa_miR_34a*、 hsa_miR-34a、 hsa-miR-361_3p、hsa-miR-362_3p、hsa_miR-374a*、hsa_miR-376a、hsa_miR-376c、 hsa-miR-378^^ hsa-miR-378^ hsa-miR-382^ hsa_miR_410、hsa-miR-422a^ hsa-miR-424^ hsa-miR-425*、hsa-miR-425、hsa-miR-429、hsa-miR-432、hsa_miR-449a、hsa_miR-449b、 hsa-miR-451、 hsa_miR-452、 hsa_miR-454*、 hsa_miR-454、 hsa-miR-455_5p、 hsa-miR-486-3p、 hsa-miR-486_5p、 hsa_miR_493*、 hsa_miR_493、 hsa_miR_494、 hsa-miR-495、 hsa_miR_497、 hsa-miR-500*、 hsa-miR-500、 hsa_miR-5(U-5p、 hsa-miR-502_3p、hsa—miR-505*、hsa-miR-512_3p、hsa-miR-515_3p、hsa-miR-516a_3p、 hsa_miR-517a、hsa-miR-518a_3p、hsa-miR-519b_3p、hsa—miR-521、hsa_miR-526b*、 hsa-miR-532-3p、hsa-miR-532_5p、hsa_miR_541*、hsa_miR_545*、hsa_miR_545、 hsa-miR-548d_5p、 hsa_miR-55la、 hsa_miR-565、 hsa_miR-569、 hsa_miR-573、 hsa—miR-575、hsa-miR-576_3p、hsa—miR-579、hsa—miR-580、hsa-miR-589*、hsa—miR-589、 hsa-miR-590_5p、hsa—miR-597、hsa—miR-598、hsa—miR-601、hsa—miR-605、hsa—miR-616*、 hsa-miR-622、hsa_miR-625、hsa-miR-628_3p、hsa-miR-628_5p、hsa_miR-629*、 hsa—miR-636、h sa—miR-638、hsa_miR-639、hsa_miR-640、hsa_miR-642、hsa—miR-645、 hsa—miR-652、hsa-miR-654_5p、hsa—miR-655、hsa—miR-656、hsa—miR-659、hsa—miR-660、 hsa-miR-66U hsa_miR—7_1 氺、hsa_miR—7_2氺、hsa_miR_7、hsa_miR—744氺、hsa_miR—768_3p、 hsa-miR-770_5p、 hsa_miR-801、 hsa-miR-875_5p、 hsa_miR-877、 hsa-miR-886_3p、 hsa-miR-888、hsa_miR-889、hsa_miR_93*、hsa_miR_933、hsa_miR_93、hsa_miR_941、 hsa-miR-942、hsa—miR-9、hsa—miR-944、hsa_miR-99a*。 根據(jù)上述兩種方法檢測的結(jié)果，選擇滿足下列條件的miRNAs用qRT_PCR方法進(jìn)一 步的驗(yàn)證l)Solexa測序中這些miRNAs至少在一組研究對象(“乳腺癌病例”組或“健康 女性對照”組)中的拷貝數(shù)大于50且在TLDA芯片中兩組研究對象的CT值均不大于35以 提高檢測效率；2) Solexa測序在兩組的倍數(shù)差異達(dá)4倍，且TLDA芯片中Δ Δ CT大于3，兩種方法所得結(jié)果方向一致；3)SoleXa測序在兩組的倍數(shù)差異達(dá)8倍，且TLDA芯片中Δ ACT 大于2，兩種方法所得結(jié)果方向一致。滿足上述條件的miRNAs 包括let_7b、miR-222、miR-25、miR-324_3p、 miR-339-3p、miR-451、miR-486、miR-151_3p、miR_30a。鑒于 miR-16 在一些報(bào)道中被用作 內(nèi)參，我們?nèi)詫iR-16納入后續(xù)分析中。探針法和染料法qRT-PCR結(jié)果均發(fā)現(xiàn)在48例乳 腺癌病例和48例健康女性對照中，有4種miRNAs (miR-16、miR-25、miR-222、miR-324_3p) 在“乳腺癌病例”組和“健康女性對照”組中的表達(dá)情況存在顯著性差異。多因素Logistic回歸分析結(jié)果表明，這4種miRNAs的表達(dá)水平均與乳腺癌的發(fā) 病存在著顯著關(guān)聯(lián)4種miRNAs均在病例中高表達(dá)。根據(jù)上述結(jié)果，將這4個(gè)與乳腺癌發(fā)病相關(guān)的miRNAs在另外50例乳腺癌病例和 與其年齡匹配的50例健康女性對照中進(jìn)一步的驗(yàn)證。我們發(fā)現(xiàn)血清/血漿高表達(dá)miR-16、 miR-25、miR-222、miR-324_3p均與乳腺癌發(fā)病相關(guān)聯(lián)，染料法的結(jié)果與探針法一致。進(jìn)一步分析這4種miRNA的組合用于乳腺癌診斷的效果，發(fā)現(xiàn)其組合對乳 腺癌發(fā)病診斷的 AUCArea Under the ROC Curve, ROC 曲線(Receiver Operating CharacteristicCurve，受試者工作特征曲線)下面積與單個(gè)miRNA相比增加。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明人制備了一種能用于乳腺癌診斷的試劑盒，包含測定 受試者血清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測的成熟miR-16、miR-25、miR-222和miR-324_3p的 引物和其他檢測試劑。具體而言，這4種miRNAs的組合，或者這4種miRNAs的引物組合構(gòu)成的相關(guān)診斷 試劑盒有助于乳腺癌的診斷，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴(yán)重程度， 及時(shí)采取更具個(gè)性化的防治方案提供支持，從而最大限度提高乳腺癌患者的生存率。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供的血清/血漿微小核糖核酸(microRNAs/miRNAs)標(biāo)志物作為乳腺癌 診斷的標(biāo)志物的優(yōu)越性在于(1)血清/血漿miRNAs是一種新型生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物，不僅穩(wěn) 定、微創(chuàng)、易于檢測，且定量精確，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類小分子RNA 生物標(biāo)志物的成功開發(fā)有助于乳腺癌的輔助診斷，為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供借鑒。(2)血清/血漿miRNAs試劑盒是一種系統(tǒng)、全面的診斷和監(jiān)測試劑盒，可用于乳腺 癌患者的輔助診斷，有助于反映乳腺癌患者的疾病狀態(tài)，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病 情、及時(shí)采取更具個(gè)性化的防治方案提供支持。(3)采用嚴(yán)密的設(shè)計(jì)和評價(jià)體系，本發(fā)明人初期采用Solexa全基因組測序技術(shù)對 血清/血漿miRNAs進(jìn)行直接測序，同時(shí)采用TLDA芯片檢測以獲取疾病特異和異常表達(dá)的 血清/血漿miRNAs表達(dá)譜，并應(yīng)用qRT-PCR的方法在大樣本中進(jìn)行了多階段驗(yàn)證，采用了 兩種不同的方法(熒光探針法和染料法)進(jìn)行驗(yàn)證；以上方法和策略的應(yīng)用加速和保證了 血清/血漿miRNAs生物標(biāo)志物和診斷試劑盒的應(yīng)用，也為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供 方法和策略上的借鑒。本發(fā)明通過控制年齡等對疾病發(fā)展的影響因素，研究血清/血漿miRNA在乳腺癌 輔助診斷的應(yīng)用前景，闡述異常表達(dá)的miRNAs對于乳腺癌進(jìn)展的影響，揭示其篩查和診斷價(jià)值。因此，本發(fā)明獲得了乳腺癌發(fā)病相關(guān)血清/血漿miRNAs表達(dá)數(shù)據(jù)庫和特異性標(biāo)志物； 通過血清/血漿miRNAs生物標(biāo)志物和診斷試劑盒的研制和應(yīng)用，可使得乳腺癌的診斷更加 方便易行，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情，為臨床治療效果評價(jià)奠定基礎(chǔ)，并為發(fā)現(xiàn)具 有潛在治療價(jià)值的新型小分子藥物靶標(biāo)提供幫助。


圖1.顯示病例組和對照組的4種miRNA的表達(dá)箱線圖。顯示乳腺癌病例組和健康女性對照組的表達(dá)箱線圖。DS 探索性樣本，IS 驗(yàn)證性樣本，Com 合并探索性樣本與驗(yàn)證性樣本。圖2.顯示探索性樣本人群病例組和對照組的ROC曲線。顯示乳腺癌病例組對健康女性對照組為參照的ROC曲線。圖3.顯示驗(yàn)證性樣本人群病例組和對照組的ROC曲線。顯示乳腺癌病例組對健康女性對照組為參照的ROC曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1樣品的收集和樣品資料的整理發(fā)明人于2006年開始至今從江蘇省腫瘤醫(yī)院和常州武進(jìn)區(qū)收集了大量的乳腺癌 患者和對照的外周血樣品(用于研究的樣本為同期收取，采樣、分裝、保存條件均一)，通過 對樣品資料的整理，發(fā)明人從中選擇了 196例符合下列標(biāo)準(zhǔn)的樣本作為Solexa測序、TLDA 芯片檢測和后續(xù)一系列qRT-PCR驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)樣品1、新發(fā)乳腺癌病例2、采血前未經(jīng)過手術(shù)和放化療，無手術(shù)前放化療3、與病例年齡匹配的健康女性對照并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料、臨床資料等情況。實(shí)施例2血清/血漿中miRNA的Solexa測序?qū)嶒?yàn)在上述符合條件的48例乳腺癌患者和48例健康女性對照中，兩組年齡匹配。將 這兩組人群經(jīng)Solexa測序試驗(yàn)獲得相關(guān)結(jié)果。具體步驟為1、分別取“乳腺癌病例”組和“健康女性對照”組患者的血清50ml，加入等體積的 Trizol 試劑；2、相分離室溫放置15min，然后按0. 2ml氯仿/lml Trizol試劑的體積比加入氯 仿，震蕩 15s,室溫 15min, 12，OOOg, 4°C，離心 15min ；3、將水相轉(zhuǎn)移到新的50ml的離心管，3步苯酚/氯仿除去蛋白相；4,RNA沉淀將水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，按0. 5ml異丙醇/lml Trizol試劑體積 加入異丙醇，_20°C保存 60min, 12，OOOg, 4°C，離心 60min ；5、用lml Trizol試劑重懸沉淀，將懸液轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml的離心管中；6、重復(fù)2，4步(第四步離心改為15min)；7、RNA洗滌去掉上清，加入75%乙醇，12，000g，4°C離心5min ；8、測量濃度通常能得到 5 μ g RNA/50ml血清；9、總RNA進(jìn)行PAGE電泳回收17_27nt RNA分子；
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10、將鏈接引物(adaptor prime，Solexa測序通用引物)酶聯(lián)在小RNA分子的3' 與5'端；11、進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后并進(jìn)行測序；12、數(shù)據(jù)分析與處理在“乳腺癌病例”組和“健康女性對照”組中運(yùn)用Solexa測 序方法發(fā)現(xiàn)的血清差異表達(dá)的微小核糖核酸在上文中已經(jīng)羅列出。實(shí)施例3血清/血漿中miRNA的TLDA芯片檢測將上述進(jìn)行Solexa測序的48例乳腺癌患者和48例健康女性對照經(jīng)TLDA芯片檢 測獲得相關(guān)結(jié)果。具體步驟為1、分別取“乳腺癌病例”組和“健康女性對照”組患者的血清600 μ 1，加入3倍體 積的Trizol試劑；2、相分離室溫放置15min，加入終濃度為1(Γ4ρπι01/ μ 1的cel_39 (TAKARA)作為 內(nèi)參，然后加入與血漿等體積的氯仿，震蕩50s，室溫15min，14，OOOrpm，4°C，離心15min ；3,RNA沉淀將水相轉(zhuǎn)移到新的15ml的離心管，加入1. 5倍水相體積的無水乙醇， 充分混勻；4、用QIAGEN miRNeasy kit富集RNA 每次吸取700 μ 1樣本至離心柱中， 14，OOOrpm離心15s，棄去收集管中濾液，重復(fù)至樣本均過柱；加入700 μ 1洗液1， 14，OOOrpm離心15s，棄收集管中濾液；加入500 μ 1洗液2，14，OOOrpm離心15s，棄收集管 中濾液；再加入500 μ 1洗液2，14，OOOrpm離心2min，棄收集管中濾液；將離心柱放回空的 收集管中，14，OOOrpm離心2min以干燥離心管；將離心管放入新的1. 5ml管中，加入50 μ 1 無核酸酶水，10, OOOrpm離心Imin ；將管中的液體倒回離心柱中，14，OOOrpm離心lmin，棄離 心柱；5、測量濃度通常能得到 1250ng RNA/600 μ 1血清；6、用TLDA芯片配套的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng) 體系包括0. 8μ 1逆轉(zhuǎn)錄引物(10Χ)、0. 2μ 1 IOOmM dNTPs混合物、1. 5 μ 1逆轉(zhuǎn)錄酶(50U/ μ L)、0. 8 μ 1 IOX逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、0. 9 μ 1 25mM氯化鎂、0. 1 μ 1 RNA抑制劑以及0. 2 μ 1無 核酸酶水。加入3 μ 1 (l-350ng)的總RNA。反應(yīng)步驟為16°C孵育2分鐘，42°C反應(yīng)1分鐘， 50°C反應(yīng)1秒，上述3步經(jīng)40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，再85°C孵育5分鐘；10、對芯片特異性的miRNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增以增加表達(dá)所需的CNDA的量。預(yù)擴(kuò)增的反 應(yīng)體系包括12. 5μ 1預(yù)擴(kuò)增Master Mix (2 X)、2· 5 μ 1預(yù)擴(kuò)增引物(10 X)、7. 5 μ 1無核酸 酶水、2. 5 μ 1 CDNA。反應(yīng)步驟為95°C 10分鐘一55V 2分鐘一72°C 2分鐘一95°C 15秒、 600C 4分鐘，12個(gè)循環(huán)一99. 90C 10分鐘；反應(yīng)結(jié)束后加入75 μ 1 0. IX TE稀釋；11、取9μ 1稀釋后的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，加入450μ 1基因表達(dá)Master Mix，441yl無 核酸酶水，充分混勻后，在TLDA芯片上加入100 μ 1/孔；IOOOrpm離心lmin，離心2次。 TLDA芯片實(shí)驗(yàn)使用的是ABI Prism 7900熒光定量PCR儀。選擇384-well TaqMan Low DensityArray特定的程序進(jìn)行反應(yīng)；12、數(shù)據(jù)分析與處理用RQ-Manger軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Ct閾值設(shè)為0. 2，Δ Ct = Ct -Ctu6 (U6為TLDA芯片中的內(nèi)源性U6，用以控制板間差異)，兩組樣品血清miRNAs的表達(dá)
量比值可用方程Δ Δ Ct表示，Δ ACt =厶(^病例-厶(^對照_厶(^小39，其中Δ CTcel_39 = CTcel_39 ]-CTcei-39 ' (cel-39用以控制RNA提取時(shí)的差異，)。運(yùn)用TLDA芯片檢測發(fā)現(xiàn)的“乳腺 癌病例”組和“健康女性對照”組中血清差異表達(dá)的微小核糖核酸在上文中已經(jīng)羅列出。
10
實(shí)施例4血清/血漿中miRNA的qRT_PCR實(shí)驗(yàn)根據(jù)上述Solexa和TLDA結(jié)果，選擇滿足下列條件的miRNAs用qRT_PCR方法進(jìn) 一步的驗(yàn)證1) Solexa測序中這些miRNAs至少在一組研究對象(“乳腺癌病例”組或“健 康女性對照”組)中的拷貝數(shù)大于50且在TLDA芯片中兩組研究對象的CT值均不大于35 以提高檢測效率；2) Solexa測序在兩組的倍數(shù)差異達(dá)4倍，且TLDA芯片中Δ Δ CT大于 3，兩種方法所得結(jié)果方向一致；3) Solexa測序在兩組的倍數(shù)差異達(dá)8倍，且TLDA芯片中 Δ Δ CT大于2，兩種方法所得結(jié)果方向一致。對所選擇的let-7b、miR-16、miR-222、miR-25、 miR-324-3p、miR-339-3p、miR-451、miR-486、miR-151-3p、miR-30a 等 10 個(gè) miRNAs 設(shè)計(jì)逆 轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR的引物(見表2)。對“乳腺癌病例”組和“健康女性對照”組的血清單個(gè)個(gè) 體進(jìn)行miRNA的qRT-PCR檢測，見表1。在整個(gè)研究過程中均實(shí)施嚴(yán)格的質(zhì)控。每個(gè)樣本連 續(xù)檢測三次。所有檢測均采用盲法，即在不清楚樣本背景的情況下完成以避免偏倚。分別 用染料法和探針法兩種方法進(jìn)行qRT-PCR檢測。(1)制備RNA樣品a)取100 μ 1血清；b)加3倍體積的Trizol室溫放置15min， 加入終濃度為10_4ρπιΟ1/μ 1的cel-39 (TAKARA)作為內(nèi)參，然后加入與血漿等體積的氯仿， 震蕩50s，室溫15min，14，000rpm，4°C，離心15min ；c)將水相轉(zhuǎn)移到新的15ml的離心管， 加入1. 5倍水相體積的無水乙醇，充分混勻；d)用QIAGEN公司的miRNeasy kit富集RNA 每次吸取700 μ 1樣本至離心柱中，14，OOOrpm離心15s，棄去收集管中濾液，重復(fù)至樣本 均過柱；加入700 μ 1洗液1,14, OOOrpm離心15s，棄收集管中濾液；加入500 μ 1洗液2， 14，OOOrpm離心15s，棄收集管中濾液；再加入500 μ 1洗液2，14，OOOrpm離心2min，棄收集 管中濾液；將離心柱放回空的收集管中，14，OOOrpm離心2min以干燥離心管；將離心管放入 新的1. 5ml管中，加入50 μ 1無核酸酶水，10, OOOrpm離心Imin ；將管中的液體倒回離心柱 中，14，OOOrpm離心lmin，棄離心柱，將管中的液體作為RNA樣品；(2)探針法使用ABI試劑盒。a)通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。探針法的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括0. 15 μ 1 IOOmMdNTPs混合物、1 μ 1逆轉(zhuǎn)錄酶(50U/ μ L)、1. 5 μ 1 IOX逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、0. 19 μ 1 RNA抑 制劑以及3μ 1 5Χ逆轉(zhuǎn)錄引物一種或幾種的混合物。加入9. 16 μ 1的總RNA。反應(yīng)步驟為 16 °C孵育30分鐘，42 °C反應(yīng)30分鐘，85 °C孵育5分鐘；b) q-PCR 將cDNA加入5μ 1水稀釋，取1μ 1稀釋后的cDNA，加入 0. 25μ 120 XMicroRNA檢測探針、2· 5μ 1 2 X 基因表達(dá) Master Mix、1. 25 μ 1 雙蒸水，5 μ 1 體系進(jìn)行q-PCR。儀器使用的是ABI Prism 7900熒光定量PCR儀，PCR的反應(yīng)條件是95°C、 5分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)一950C、15秒，60°C、1分鐘進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。(3)染料法a)通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。染料法的逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括4 μ 1 5 X AMV 緩沖液、2 μ 1 IOmM dNTP 混合物(Takara 公司)、0· 5 μ 1 RNase 抑制劑(Takara公司)、2 μ 1 AMV(Takara公司)以及1.5μ1 miRNA特異性反向引物一種或幾種的混合物。反應(yīng)步驟為 16°C孵育15分鐘，42°C反應(yīng)1小時(shí)，85°C孵育5分鐘；b)q_PCR 將 cDNA 按 1/5 體積稀釋，取 0. 5μ 1 稀釋后的 cDNA，加入 0. 15μ 1 Taq 酶(Takara 公司)，0· 5μ 1 20 X EVA GREEN, 0. 1 μ 1 10 μ M 正向引物一種，0· 1 μ 1 10 μ Mil 用反向引物(URP :TGGTGTCGTGGAGTCG, SEQ ID No. 23) ,0. 6 μ 1 25mM MgCl2,0. 8 μ 1 2. 5mMdNTP混合物(Takara公司)，1 μ 1 10XPCR緩沖液，6. 75 μ 1雙蒸水，10 μ 1體系進(jìn)行q-PCR。 儀器使用的是ABI Prism 7900熒光定量PCR儀，PCR的反應(yīng)條件是95°C、5分鐘進(jìn)行1個(gè) 循環(huán)一950C、15秒，60°C、1分鐘進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。(4)數(shù)據(jù)處理與分析兩組樣品血清miRNAs的表達(dá)量比值可用方程2_Δ"表示，其中Δ Ct =
,,我們在每一個(gè)樣本提取時(shí)加入cel-39的RNA作為參照，計(jì)算相對表達(dá)量(cel_39 =SEQ IDNo. 21 和 SEQ ID No. 22)。探針法和染料法qRT-PCR結(jié)果均發(fā)現(xiàn)在96例樣本中，有4種miRNAs (miR_16、 miR-25、miR-222和miR-324-3p)在兩組間的表達(dá)情況存在顯著性差異，探針法結(jié)果見表1、 表3、圖1，染料法結(jié)果因與探針法類似不再列出。實(shí)施例5血清中微小核糖核酸qRT-PCR實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究根據(jù)上述結(jié)果，將這4種與乳腺癌發(fā)病相關(guān)的miRNAs在另外50例乳腺癌患者與 50例年齡匹配的健康女性對照中進(jìn)行進(jìn)一步檢測。我們發(fā)現(xiàn)miR-16、miR-25、miR-222和 miR-324-3p在乳腺癌病例組血清中的表達(dá)均顯著高于對照組(表4、圖1)，探針法與染料法 結(jié)果同樣一致。實(shí)施例6利用危險(xiǎn)度評分方法進(jìn)一步分析4種miRNA的組合對乳腺癌發(fā)病的診斷根據(jù)上述Real-time PCR結(jié)果，本發(fā)明人通過對2組血漿樣品(“乳腺癌病例組” 和“健康女性對照組”)的miRNAs表達(dá)水平的分析，以探索性人群健康女性對照組miR-16、 miR-25、miR-222和miR-324_3p表達(dá)量的單側(cè)95%參考值范圍為標(biāo)準(zhǔn)，對這4種miRNA進(jìn) 行評分，表達(dá)量小于第95百分位數(shù)評分為0分，表達(dá)量大于等于第95百分位數(shù)評分為1分， 以回歸系數(shù)為權(quán)重，進(jìn)一步求得危險(xiǎn)分值，以危險(xiǎn)分值的中位數(shù)(中位數(shù)=2. 783)為界值， 繪制ROC來評估預(yù)測的靈敏性和特異性，進(jìn)而評估這4種miRNAs高表達(dá)對乳腺癌發(fā)病的 判斷能力。對4個(gè)標(biāo)志物的聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，在探索性樣本人群中，這4種miRNAs以91. 7% 的AUC將健康女性對照組和乳腺癌癌病例組分開，最佳臨界點(diǎn)的靈敏度為91. 7%，特異度 91. 7% ；在驗(yàn)證樣本人群中，這4種miRNAs以93. 0%的AUC將健康女性對照組和乳腺癌癌 病例組分開，最佳臨界點(diǎn)的靈敏度為92. 0%，特異度94. 0% (圖2、3)。運(yùn)用危險(xiǎn)分值的界 值在探索性樣本人群中錯(cuò)判率為8. 3% (8/96)，在驗(yàn)證性樣本人群中錯(cuò)判率為8% (8/100) (表 5)。因此，本發(fā)明人證明了采用miR-16、miR-25、miR-222和miR-324_3p能夠很好地將 健康女性對照和乳腺癌患者區(qū)分。實(shí)施例7用于乳腺癌輔助診斷的miRNA試劑盒的制作miRNA試劑盒的制作和操作流程是基于solexa測序，TLDA芯片檢測，RT-PCR和 real-time PCR等技術(shù)。試劑盒包括血清/血漿miRNA引物(包括下列引物miR_16的引物 為 SEQ ID No. 19 和 SEQ ID No. 20 ；miR-25 的引物為 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；miR-222 的引物為 SEQ ID No. 17 和 SEQ ID No. 18 ；miR-324_3p 的引物為 SEQ ID No. 13 和 SEQ IDNo. 14)，還可以有相應(yīng)PCR反應(yīng)所需的常用酶和/或試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液，dNTPs, MgC12，去核酸酶水，熒光染料或探針、Taq酶、通用反向引物(URP :TGGTGTCGTGGAGTCG，SEQ ID NO 23)等，可根據(jù)具體采用的實(shí)驗(yàn)方法選用，這些常用酶和/或試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員 熟知的，另外還可以有標(biāo)準(zhǔn)品和對照(如定量標(biāo)化的線蟲mir-39樣本等)及正常參考值
12(miR-16 5. 84*l(T2，mir-25 2. 26*l(T3，miR-222 2. 75*l(T3，miR-324-3p 3. 60*1(Γ4)。此試 劑盒的價(jià)值在于只需要血清/血漿而不需要其它組織樣品，通過最精簡的熒光或探針法檢 測miRNA的變化趨勢，再通過該趨勢輔助診斷乳腺癌，不僅穩(wěn)定，檢測方便，且定量精確，大 大提高疾病診斷的敏感性和特異性，因此將此試劑盒投入實(shí)踐，可以幫助指導(dǎo)臨床準(zhǔn)確做 出診斷。
表3探索性樣本人群單因 考值為界值)
logistic回歸分析結(jié)果(以對照組表達(dá)值的95%參 15
1、蟬蓉 lnr>v§ s 氺要 0 表4驗(yàn)證性樣本人群單因素logistic回歸分析結(jié)果(以探索性樣本對照組表達(dá) 值的95%參考值為界值) 表5運(yùn)用探索性樣本人群ROC曲線的界值所得的錯(cuò)判比例
權(quán)利要求
一種與乳腺癌相關(guān)的血清/血漿miRNA標(biāo)志物，其特征在于該標(biāo)志物為miR 16、miR 25、miR 222和miR 324 3p的組合。
2.權(quán)利要求1所述的血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物，其特征在于該引物為 miR-16 的引物為 SEQ ID No. 19 和 SEQ ID No. 20 ；miR-25 的引物為 SEQ ID No. 1 禾口 SEQID No. 2 ；miR-222 的引物為 SEQ ID No. 17 和 SEQ ID No. 18 ；miR-324_3p 的引物為 SEQ ID No.13 和 SEQ ID No. 14。
3.權(quán)利要求1所述的血清/血漿miRNA標(biāo)志物在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中 的應(yīng)用。
5.一種乳腺癌輔助診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒用于檢測血清/血漿中miR-16、 miR-25、miR-222 和 miR-324_3p。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有血清/血漿miRNA中 miR-16、miR-25、miR-222 和 miR-324_3p 的引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求2所述的血 清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常 用的酶和試劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤學(xué)領(lǐng)域，公開了一種與乳腺癌相關(guān)的血清/血漿miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用。該標(biāo)志物為miR-16、miR-25、miR-222和miR-324-3p的組合。該標(biāo)志物及其引物可用于制備診斷試劑盒，用于乳腺癌的輔助早期診斷。
文檔編號C12Q1/68GK101921760SQ20101027555
公開日2010年12月22日 申請日期2010年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月8日
發(fā)明者張辰宇, 沈洪兵, 胡志斌, 董靜, 馬紅霞 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)