專利名稱：大豆GmCOL4基因在植物花期調(diào)控中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一個(gè)大豆開花基因在植物花期調(diào)控中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大豆是重要的農(nóng)作物之一，是植物蛋白質(zhì)、食用油、生物柴油以及異黃酮和卵磷脂等次生代謝產(chǎn)物的重要來源。因?yàn)榇蠖故嵌倘罩参?，開花受光周期的嚴(yán)格控制，因而不同區(qū)域間的優(yōu)異品種不能相互引種、生育期也受環(huán)境光周期的制約(aiang等.，2008)。如果能降低大豆對(duì)光周期的敏感性，突破大豆開花對(duì)光周期的限制，就能解決大豆的引種問題，從而實(shí)現(xiàn)各區(qū)域間優(yōu)質(zhì)品種的相互交換，豐富各地優(yōu)異種質(zhì)資源，調(diào)節(jié)大豆生育期，提高大豆產(chǎn)量和品質(zhì)。以往解決大豆光周期敏感性主要是通過雜交的方法獲得新品種，但是，這種育種方法具有對(duì)親本的依賴性強(qiáng)和周期長等缺點(diǎn)，到目前為止尚未獲得大豆光周期廣適應(yīng)性品種。對(duì)擬南芥等植物的研究表明，植物的光周期是受極其復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)控制的 (Mouradov等，2002 ；Turck等，2008)。但是，其中一個(gè)關(guān)鍵蛋白對(duì)開花時(shí)間的調(diào)節(jié)起著至關(guān)重要的作用，它就是CONSTANS(CO)基因。Putterill等最早報(bào)道了擬南芥中的CO基因 (Putterill等，19%)。通過大量的研究發(fā)現(xiàn)CO介于生物節(jié)律鐘與下游開花基因之間，將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殚_花信號(hào)(Suarez等，2001)。隨著基因組學(xué)和生物信息學(xué)的興起和發(fā)展， 不同物種中的CO不斷被認(rèn)知，如水稻(Oryza sativa) (Yano等，2000)、小麥(Tritivum aestivum) (Nemoto 等，2003)禾口衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) (Serrano 等，2009)的 CO基因。在已研究的植物中，CO常以多個(gè)拷貝的形式存在于生物體中，各CO拷貝的功能有明顯差異。擬南芥的CO家族有17個(gè)成員(Robson等，2001)，水稻中有16個(gè)成員(Griffiths 等，2003)，甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)中也克隆得到4個(gè)CO同源基因(Robert等， 1998)，在溫帶裸子植物歐洲云杉(Picea abies)中鑒定到2個(gè)CO同源基因(Holefors等， 2009)。但大豆CO基因的功能及其應(yīng)用方面未見報(bào)道。通過調(diào)節(jié)大豆開花基因表達(dá)來改變植物對(duì)光周期的敏感性和開花時(shí)間也沒有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大豆GmC0L4基因植物花期調(diào)控中的應(yīng)用，通過在植物中過表達(dá)或抑制表達(dá)GmC0L4，實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)植物光周期和開花時(shí)間。本發(fā)明的通過RT-PCR的方法從大豆‘墾農(nóng)18，中分離到GmC0L4(全稱為Glycine max CONSTANSLike 4)的cDNA全長，它與擬南芥CO蛋白的氨基酸序列之間的同源性為對(duì)％，在保守功能域(兩個(gè)B-box和一個(gè)CCT domain)具有多個(gè)關(guān)鍵氨基酸的不同。因此推測(cè)與擬南芥CO基因促進(jìn)開花的功能不同，GmC0L4可能具有抑制開花的功能。通過Real-time PCR分析了大豆GmC0L4基因的表達(dá)模式，結(jié)果表明主要在大豆子葉、莖、葉、花、莢中均有表達(dá)，其中在開花期的葉中表達(dá)量最高，因此推測(cè)所述基因與開花
3相關(guān)。本發(fā)明將GmC0L4基因構(gòu)建到表達(dá)載體p35S-GW上，并在大腸桿菌DH5a中擴(kuò)繁。 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法，將P35S-GW攜帶的GmC0L4基因轉(zhuǎn)入擬南芥，獲得擬南芥轉(zhuǎn)化植株。結(jié)果表明，GmC0L4具有降低植物對(duì)光周期的敏感性并抑制擬南芥開花的作用。本發(fā)明的通過克隆大豆GmC0L4基因，并在在植物中過表達(dá)GmC0L4基因，延長植物生育期，抑制植物開花。因此，GmC0L4基因及其編碼的蛋白可以調(diào)節(jié)花期，可用于解決雜交育種中的花期不遇的問題，各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制的問題以及光周期敏感性問題和引種問題。


圖1為克隆載體pGWCm的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為大豆開花基因GmC0L4編碼蛋白的氨基酸序列與CO基因編碼蛋白的氨基酸序列的比較。圖3A為大豆開花基因GmC0L4在大豆中不同組織器官的表達(dá)水平。圖;3B為大豆開花基因GmC0L4在大豆中不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平。圖4為大豆開花基因GmC0L4在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞核中的定位；圖5為植物表達(dá)載體p35S-GW的結(jié)構(gòu)示意圖。圖6為大豆開花基因GmC0L4擬南芥轉(zhuǎn)化植株表現(xiàn)。其中，在圖3中，短線前面的字母表示植株的發(fā)育時(shí)期，短線后面的字母表示器官，U代表單葉；T代表復(fù)葉(T后面的數(shù)字為復(fù)葉的順序)；F代表花；Pd代表莢；Pt代表葉柄(其后數(shù)字表示不同時(shí)期的莢)；R代表根；HH代表上胚軸；EH代表下胚軸；SAM代表生長點(diǎn)Jt代表莖；L代表側(cè)生葉；C代表子葉Jeedling表示播種一周后的幼苗。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1大豆開花基因GmC0L4的克隆分別利用正向引物5 ‘ -ATGGGTTATATATGTGATTTTTGTG-3 ‘ 和反向引物 5' TCAGCAGCTTCTGGTTGTGC 3'從大豆‘墾農(nóng) 18，(G1 ycine max L. Kennong 18，)葉片 cDNA中，擴(kuò)增CO同源基因。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C 5min 預(yù)變性，95°C 30S,50°C !35S，72°C 2min，25 個(gè)循環(huán)， 72°C IOmin 延伸。將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物直接按照TA克隆方法克隆到如圖1所示的pGWCm載體上。 先將pGWCm載體用Ahd I內(nèi)切酶水解后用凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物以獲得T載體。然后PCR產(chǎn)物和T載體于16 °C進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，并在其中擴(kuò)增，篩選陽性克隆并測(cè)序。實(shí)施例2大豆開花基因GmC0L4編碼蛋白的氨基酸序列分析大豆開花基因的GmC0L4蛋白序列與擬南芥之間的同源性較低僅為對(duì)％，且在保守功能域(兩個(gè)B-box和一個(gè)CCT domain)多個(gè)關(guān)鍵氨基酸的不同，如圖2所示。因此推測(cè)GmC0L4與擬南芥CO的功能可能不同，可能具有抑制植物開花的活性。
4
實(shí)施例3大豆開花基因GmC0L4在大豆中不同組織器官及不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(quantitative real time RT-PCR)測(cè)定大豆開花基因 GmC0L4在大豆中的表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用ABI M^One進(jìn)行，用STOR Green I檢測(cè)熒光信號(hào)。上游引物5' -ACCCTTTGAGCACAACCAGA-3‘，下游引物5' -GTTTTTCTTTTGCTAC
TATAGGACTG-3'。反應(yīng)體系為SYBR Primix Ex Taq (2 X) (TaKaRa)7. 5 μ 1上游引物(10μ Μ)0. 3μ 1下游引物(10μ Μ)0· 3 μ 1ROX Reference Dye (50x)0. 3 μ 1cDNA1. 0μ 1滅菌雙蒸水5. 6μ1反應(yīng)參數(shù)為兩步法95°C 10S，熱啟動(dòng)；95°C 5S，60°C lmin，40個(gè)循環(huán)。用基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件Genesis對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并作圖。大豆開花基因GmC0L4主要在大豆子葉、莖、葉、花、莢中均有表達(dá)，其中在開花期的葉中表達(dá)量最高，如圖3所示。實(shí)施例4大豆開花基因GmC0L4編碼蛋白在植物細(xì)胞中的定位采用基因槍轟擊的方法，將大豆開花基因GmC0L4與YFP的融合基因，轉(zhuǎn)化至大豆葉片中。具體方法如下1)微粒子彈的制備將10 μ g重組質(zhì)粒DNA與6 μ 1 50mg/ml的金粉懸液(直徑為1. 0 μ m)、4 μ 1 0. lmol/L亞精胺(抽濾滅菌)和6 μ 1 2. 5mol/LCaCl2,渦旋振蕩混勻，冰上靜置15min，12，OOOrpm離心10s，收集金粉沉淀，用20 μ 1無水乙醇重懸。2)轟擊受體材料將大豆幼嫩葉片擺放在MS培養(yǎng)基上，22°C預(yù)培養(yǎng)4h。選用 IlOOpsi的壓力膜，將20 μ 1金粉-DNA混合物點(diǎn)在轟擊膜中央，采用PDS 1000/He型基因槍(Bio-Rad)進(jìn)行轟擊，轟擊距離6cm，真空度為25 . Hg。轟擊后的表皮細(xì)胞22°C暗培養(yǎng) 24h后，在激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP2)下觀察。轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的YFP熒光信號(hào)表示大豆開花基因GmC0L4編碼蛋白的定位，如圖4所示。圖4顯示大豆開花基因GmC0L4編碼的蛋白在大豆葉片中主要定位于核。實(shí)施例5大豆開花基因GmC0L4的植物表達(dá)載體將從實(shí)施例1中得到的大豆開花基因GmC0L4的克隆載體與如圖5所示的植物表達(dá)載體p35S-GW(購自Invitrogen)等比例混合后通過LR反應(yīng)(兩種質(zhì)粒各50ng，LR酶 1 μ 1，補(bǔ)H2O至終體積5 μ 1，混勻后25°C反應(yīng)6小時(shí)以上)，將GmC0L4構(gòu)建在p35S_GW上， 命名為P35S-GW-C0L4，用于在植物中過表達(dá)大豆開花基因GmC0L4，研究其功能。植物的轉(zhuǎn)化方法采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行。植物中的篩選標(biāo)記為Bar。實(shí)施例6GmC0L4的轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得1.農(nóng)桿菌液準(zhǔn)備將含有目的基因雙元表達(dá)載體的根瘤農(nóng)桿菌GV3101: :p35S-GW-C0L4接種于5ml 含有相應(yīng)抗性的液體LB培養(yǎng)基中，28 0C 200rmp培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化前Id接種于200ml含有相應(yīng)抗生素的液體LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)至0D600為0. 8 1. 2，5，OOOrmp離心15min收集菌體，菌體
5重懸于侵染緩沖液(含1/2MS大量，V2MS微量，5%蔗糖和0.02% Silweet L_77，pH5. 7)， 使0D600為0. 8左右。2.擬南芥轉(zhuǎn)化擬南芥在長日照條件下培養(yǎng)，待主莖抽苔后剪掉，待大多側(cè)枝現(xiàn)蕾時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將花序放進(jìn)盛有侵染緩沖液的容器中，浸泡10 30s，轉(zhuǎn)化完畢后，用黑色塑料袋罩住避光、保濕，16 24h后揭去塑料袋。常規(guī)管理至種子成熟。3. Basta抗性篩選轉(zhuǎn)基因植株種子收獲后于37°C烘干(1周左右)，然后均勻播在土中，罩上保鮮膜防止污染并保濕，播種7 IOd后待子葉完全張開時(shí)噴灑1 1000稀釋的Basta，篩選陽性植株。分別利用正向引物 5 ‘ -GTTATGGGTCAACGGTTTC-3 ‘和反向引物 5 ‘ -TCAGCAGCTTCTGGTTGTGC-3 ‘ 鑒定獲得的抗性植株，確保為GmC0L4轉(zhuǎn)基因植株。通過PCR鑒定獲得C0L4過表達(dá)轉(zhuǎn)基因 T1代植株共3株。實(shí)施例7大豆開花基因GmC0L4抑制擬南芥開花從實(shí)施例6獲得的擬南芥轉(zhuǎn)化植株與野生型Col對(duì)照在長日植株生長室中的條件(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的光周期，光強(qiáng)80 μ mol ·πΓ2 · s—1)下同時(shí)培育，給予同樣的栽培管理措施，對(duì)30株GmC0L4的轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行花期觀測(cè)。結(jié)果表明，大豆開花基因 GmC0L4轉(zhuǎn)化擬南芥，抑制擬南芥開花，對(duì)光周期不敏感，如圖6所示，其中右側(cè)代表對(duì)照野生型Col，左側(cè)代表轉(zhuǎn)基因植株。30株GmC0L4的T1代過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株從播種到開花為 35 45天，平均為41. 4，而其對(duì)照20株Col野生型的開花時(shí)間為25 30天左右，平均為 32. 5天。結(jié)果表明大豆GmC0L4蛋白具有抑制開花的活性。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。序列說明SEQ ID No 1所示為大豆GmC0L4核苷酸序列；SEQ ID No2所示為大豆GmC0L4氨基酸序列；SEQ ID No 3和SEQ ID No 4為擴(kuò)增GmC0L4全長的引物對(duì)；SEQ ID No 5禾口 SEQ ID No6 為 GmC0L4 Real-time PCR 引物對(duì)；SEQ ID No7 和 SEQ ID No 8 為檢測(cè)轉(zhuǎn)化植株的 PCR引物對(duì)。
權(quán)利要求
1.大豆GmC0L4基因植物花期調(diào)控中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，通過在植物中過表達(dá)或抑制表達(dá)GmC0L4， 實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)植物光周期和開花時(shí)間。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，在植物中過表達(dá)GmC0L4，使開花延遲，生育期延長。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一個(gè)大豆開花基因GmCOL4在植物花期調(diào)控中的應(yīng)用。過表達(dá)GmCOL4可明顯抑制植物(擬南芥)開花，使開花時(shí)間延遲，生育期延長?？捎糜诮鉀Q雜交育種中的花期不遇問題、各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制問題、光周期敏感性問題和引種問題。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102399788SQ20101027614
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者傅永福, 張曉玫 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所