專利名稱：一株富鉬釀酒酵母及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株富鉬釀酒酵母及其應用。
背景技術：
鉬是動植物及人體必需的微量元素。鉬是生物體內多種酶的重要組成成分；參與 并影響機體內的多種代謝過程；能抑制乳腺癌的生長，控制食道癌及其他癌癥的死亡率； 能保護心肌，預防心腦血管疾病和肝臟疾?。粚松讲?、齲齒、小細胞低色素性貧血以及區(qū) 域性脫發(fā)等地方病有很好的防治作用。此外，鉬能增加機體抵抗病菌的能力，提高機體免疫 能力，對動物的生長有明顯的促進作用。人體內鉬缺乏會引起心血管疾病、高血壓、糖尿病、 克山病、腎結石、大骨節(jié)病等，兒童和青少年鉬缺乏會導致生長發(fā)育不良、神經(jīng)異常、智力發(fā) 育遲緩，骨骼生長緩慢、異常。無機態(tài)的鉬元素不易被人體吸收，并有一定的毒性。由于酵母菌能夠富集培養(yǎng)基 中的無機鉬并將其轉變?yōu)槎拘缘偷挠袡C鉬，提高了鉬的生物利用率和安全性；同時，酵母本 身的生物活性物質對生物體也有保健作用，因此富鉬酵母作為生物體鉬源的補充，尤其是 作為預防和治療癌癥、心腦血管疾病和肝臟疾病的藥物的重要功效成分引起了人們極大重 視。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一株富鉬釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。本發(fā)明提供的富鉬釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株HG-7是通過自然 篩選、單倍體分離、誘變和原生質體融合技術獲得的，已于2010年7月19日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCC No 4014。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) HG-7 CGMCC No. 4014 為橢圓形，菌落凸 起、光滑、乳白色、邊緣整齊。最適生長溫度為30°C，最適生長pH值為6.0。本發(fā)明的另一目的在于提供釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HG-7 CGMCCNo. 4014 的發(fā)酵培養(yǎng)方法，是將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCCNo. 4014接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在如下的發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)25-35°C，180_250rpm 培養(yǎng) 35-45h ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為40-100g/L碳源、1000-2000mg/L可溶性鉬鹽、5_20g/L 酵母粉，其余為水。進一步，上述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為80g/L碳源、1750mg/L可溶性鉬鹽、10g/L酵母 粉，其余為水。上述可溶性鉬鹽為鉬酸鈉或鉬酸銨，優(yōu)選為鉬酸鈉；所述碳源為蔗糖或麥芽糖。上述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為4. 5-6. 5，優(yōu)選為5. 5。進一步，上述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為30°C，200rpm培養(yǎng)40h。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種制備含有機鉬的產品的方法。本發(fā)明提供的制備含有機鉬的產品的方法是將釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014在含無機鉬培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，收集所 述釀酒酵母，得到所述產品。上述含無機鉬培養(yǎng)基與上述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HG-7 CGMCCNo. 4014的發(fā)酵培養(yǎng)方法中的發(fā)酵培養(yǎng)基相同；所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件25_35 °C、 180-250rpm培養(yǎng)35_45h、通空氣的量為1. 1-1. 5L/min/升培養(yǎng)基，優(yōu)選條件30°C、200rpm 培養(yǎng)40h、通空氣的量為1. 3L/min/升培養(yǎng)基。上述制備含有機鉬的產品的方法還包括在收集所述釀酒酵母步驟之后，將收集的 所述釀酒酵母進行干燥、粉碎和包裝。任一上述方法制備得到的含有機鉬的產品也屬于本發(fā)明的保護范圍之內。本發(fā)明通過自然篩選、單倍體分離、誘變和原生質體融合技術獲得了一株遺傳性 狀穩(wěn)定的高生物量釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HG-7 CGMCC No. 4014。該菌株具 有生物量高和細胞有機鉬含量高的優(yōu)點，在其生長繁殖過程中能夠將培養(yǎng)液中無機態(tài)的鉬 富集到細胞內轉化成有機態(tài)的鉬，發(fā)酵培養(yǎng)該釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014，每升培養(yǎng)液的細胞干重可達llg，每克干細胞含鉬量可達3500 iig。本發(fā)明 的培養(yǎng)方法實用性強、操作簡便、成本低廉，對發(fā)酵設備及生產條件沒有特殊要求，利用一 般發(fā)酵廠的設備和生產條件即可生產，投資少、見效快、效益高，不但適合于大規(guī)模的生產 還適合于小批量的生產，具有廣闊的應用前景。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。所有原料均能夠從商業(yè)途徑獲得。實施例1、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014 的獲得1、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014 的選育1)根據(jù)酵母菌對鉬離子的抗性測定結果進行初篩取20 株不同的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No. 2. 1190、 CGMCCNo. 2. 1407,CGMCC No. 2. 1416,CGMCC No. 2. 1419,CGMCC No. 2. 1420,CGMCCNo. 2. 1422、 CGMCC No.2. 1423、CGMCC No.2. 1428、CGMCC No.2. 1435、CGMCCNo.2. 1436、CGMCC No. 2. 1445,CGMCC No. 2. 1453,CGMCC NO. 2. 1525,CGMCCNo. 2. 1538,CGMCC No. 2. 1542,CGMCC No. 2. 1546,CGMCC No. 2. 1643,CGMCCNo. 2. 1793,CGMCC No. 2. 1951,CGMCC No. 2. 2079 (由中 科院微生物研究所菌種保藏中心提供)，重新編號分別為ZB-1 ZB-20。將它們分別培養(yǎng) 在含有 1. 5mg/mL、2mg/mL、2. 5mg/mL、3mg/mL、3. 5mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL 禾口 8mg/mL鉬離子濃度的YEPD固體培養(yǎng)基(YEPD固體培養(yǎng)基的組成為酵母粉10g/L、蛋白胨 20g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂粉10g/L)上，從中選出8株在含有6mg/mL鉬離子濃度的YEPD固 體培養(yǎng)基上能夠生長的菌株。2)測定步驟1)初篩得到的8株菌在含有l(wèi)mg/mL鉬離子濃度的YEPD液體培養(yǎng)基 中的細胞生物量和細胞中鉬的含量。通過篩選，獲得4株細胞生物量較高的菌株(每升培 養(yǎng)液的細胞干重在10g以上，但每克干細胞的含鉬量在1000 P g以下)和4株細胞中鉬含量
4較高的菌株(每克干細胞的含鉬量在2000 u g以上，但每升培養(yǎng)液的細胞干重在6g以下)。 細胞生物量和細胞中鉬含量的測定方法如下細胞生物量的測定方法將培養(yǎng)有酵母菌的培養(yǎng)液于SOOOrpm離心5min，收集菌 體沉淀，用去離子水洗滌三次，將菌體沉淀放置在60°C烘箱中烘至恒重，稱量菌體的重量。 細胞生物量為每升培養(yǎng)液中的細胞干重。鉬標準曲線的制備分別配制鉬離子濃度為4iig/ml、10iig/ml、20iig/ml、 40 u g/ml和60ii g/ml的標準溶液，原子吸收測定460nm處的吸光度值，分別為0. 0942、 0. 2221,0. 4219,0. 7707和1. 1052。根據(jù)鉬離子濃度和吸光度值得到鉬離子濃度的計算公 式:OD460 = 0. 0179X 鉬離子濃度(i! g/ml)+0.042，相關系數(shù) r = 0.9984。細胞中鉬含量的測定在裝有1. 0g上述篩選得到的酵母濕菌體的100mL磨口圓底 燒瓶中加入20mL消化液(硝酸高氯酸的體積比為4 1)，燒瓶口放置小漏斗，以防止消 化液自圓底燒瓶口進濺出來，并將產生的氣體導流出圓底燒瓶，將燒瓶置于電爐上加熱消 化，直至燒瓶中的液體變?yōu)闊o色透明為止；在燒瓶中加5mL水，加熱以除去多余的硝酸；待 燒瓶中的液體接近2-3mL時，取下冷卻，用蒸餾水稀釋至合適的濃度，原子吸收法測定細胞 中鉬的含量，即每克干細胞中鉬離子的微克數(shù)。3)通過生孢實驗，從上述步驟2)篩選的菌株中挑選出一株生物量較高、生孢好 的二倍體釀酒酵母菌ZB-5和一株細胞含鉬量較高、生孢好的二倍體釀酒酵母菌ZB-12， 按常規(guī)方法對這兩株菌進行生孢培養(yǎng)和單倍體分離。分別測定單倍體菌株的細胞生物量 和細胞含鉬量，從中選出生物量較高的單倍體ZB-5-21 (a)和細胞含鉬量較高的單倍體 ZB-12-36(a)。4)用硫酸二乙酯分別對上述步驟3)獲得的單倍體ZB-5-21 (a)和ZB_12_36 (a) 進行誘變，獲得營養(yǎng)缺陷突變株；從獲得的營養(yǎng)缺陷突變株中篩選出帶有賴氨酸營養(yǎng)缺陷 標記的突變株ZB-5-21-17 (a, lys_)和帶有纈氨酸營養(yǎng)缺陷標記的突變株ZB-12_36_69 (a, vaD作為融合親株。5)將 ZB-5-21-17(a，lys_)和 ZB-12-36-69 (a，val—)進行原生質體融合，在酵母菌 基本培養(yǎng)基上篩選融合子。酵母菌基本培養(yǎng)基的組成為10g/L葡萄糖、10g/L瓊脂、6.7g/ L無氨基酵母氮源YNB (無氨基酵母氮源YNB的組成為硫酸銨5g、磷酸二氫鉀0. 85g、磷酸 氫二鉀0. 15g、硫酸鎂0. 5g、氯化鈉0. lg、氯化鈣0. lg、硼酸500 u g、硫酸銅40 u g、碘化鉀 lOOP g、氯化鐵200ii g、硫酸錳400ii g、鉬酸鈉200ii g、硫酸鋅400ii g、生長素2ii g、泛酸鈣 400 u g、肌醇2000 u g、煙酸400 u g、對氨基苯甲酸200 u g、硫胺素400 u g、核黃素200 u g、 吡哆醇400 u g)。6)測定步驟5)獲得的融合子在含有l(wèi)mg/mL鉬離子濃度的YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 細胞生物量和細胞中鉬含量，從中篩選出細胞生物量和細胞鉬含量高的融合菌株，將其命 名為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7，并于2010年7月19日保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC No. 4014。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) HG-7 CGMCC No. 4014 為橢圓形，菌落凸 起、光滑、乳白色、邊緣整齊。最適生長溫度為30°C，最適生長pH值為6.0。該融合菌株HG-7每升培養(yǎng)液的細胞干重在llg以上，每克干細胞的含鉬量在3500 y g以上，是一株優(yōu)良的富鉬酵母菌株。2、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HG-7 CGMCC No. 4014 的遺傳穩(wěn)定性分 析將上述步驟1 獲得的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014 在YEPD固體培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)30次，隨機挑取100個單菌落接種于無菌水中，室溫條件下 饑餓培養(yǎng)4-6小時。取饑餓培養(yǎng)后的菌液分別接種于含有6mg/mL鉬離子的YEPD培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)結果證明，挑取的100個單菌落在含有6mg/mL鉬離子的YEPD培養(yǎng)基上均能夠生長。隨 機挑取其中的10個單菌落接種在含有l(wèi)mg/mL鉬離子的YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測定細胞生物 量和細胞鉬含量，結果表明，細胞生物量和細胞鉬含量均無明顯變化。上述結果證明，釀酒 酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014 具有良好的遺傳穩(wěn)定性。實施例2、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014 發(fā)酵條件 的優(yōu)化采用單因子發(fā)酵實驗進行釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HG-7 CGMCCNo. 4014的培養(yǎng)條件優(yōu)化(包括培養(yǎng)基組分、糖濃度、鉬鹽種類、鉬鹽濃度、培養(yǎng)基的 PH值、發(fā)酵液體積及發(fā)酵時間等)，確定了最優(yōu)的培養(yǎng)條件。發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑是水，溶質組成為麥芽汁糖含量為80g/L、鉬酸鈉1750 y g/ ml、酵母粉10g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為5. 5。發(fā)酵培養(yǎng)條件為30°C、200rpm培養(yǎng)40h。250ml三角瓶中裝50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(裝 液量為 50ml/250ml)。先將篩選得到的菌株在5ml YEPD培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉 10g/L)中培養(yǎng)16hr，然后以10%的接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中。在上述優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，按照實施例1提供的方法測定干重以及含鉬量每升 發(fā)酵液的細胞干重可以達llg，每克干細胞的含鉬量達3500 y g。實施例3、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014 產品的制 備富鉬釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014 產品的生產工 藝包括以下步驟斜面菌種一液體菌種一一級液體種子培養(yǎng)一二級液體種子培養(yǎng)一三級液 體種子培養(yǎng)一發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)一收集酵母細胞及干燥一粉碎一得到富鉬釀酒酵母產品。下 面對生產工藝中的各個步驟做進一步的說明(1)斜面菌種將上述實施例1篩選得到的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) HG-7 CGMCC似.4014接種于￥￡ 0固體斜面培養(yǎng)基(葡萄糖2(^/1、蛋白胨2(^/1、酵母粉 10g/L、瓊脂粉10g/L)上，30°C培養(yǎng)48小時后，放入4°C冰箱保存。(2)液體菌種將上述步驟(1)保存的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HG-7CGMCC No. 4014活化后，接一環(huán)細胞于裝有150毫升YEPD培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L、蛋白 胨20g/L、酵母粉10g/L)的500ml三角瓶中，30°C振蕩培養(yǎng)36小時，得到液體菌種。(3) 一級液體種子培養(yǎng)按10%的接種量將上述步驟(2)的液體菌種接入裝有 1. 5升YEPD培養(yǎng)基的5L三角瓶中，30°C振蕩培養(yǎng)28小時，得到一級液體種子培養(yǎng)物。(4) 二級液體種子培養(yǎng)按10%的接種量將上述步驟(3)的一級種子培養(yǎng)物接入 裝有45升YEPD培養(yǎng)基的小卡氏發(fā)酵罐中，在25-35°C的條件下，攪拌培養(yǎng)28小時，得到二
6級液體種子培養(yǎng)物。(5)三級液體種子培養(yǎng)按10%的接種量將上述步驟(4)的二級種子培養(yǎng)物接入 裝有450升YEPD培養(yǎng)基的700L大卡氏發(fā)酵罐中，30°C攪拌培養(yǎng)28小時，得到三級液體種 子培養(yǎng)物。(6)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)按20%的接種量將上述步驟(5)的三級種子培養(yǎng)物接入裝 有2250升發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基的組成同實施例2的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基)的3500L發(fā)酵 罐中，30°C攪拌，攪拌轉速200rpm培養(yǎng)40小時，通空氣的量為1. 3L/min/升培養(yǎng)液。(7)收集酵母細胞及干燥采用板框壓榨法或離心收集上述步驟(6)獲得的釀酒 酵母(Saccharomyces cerevisiae) HG-7 CGMCC No. 4014 細胞，將收獲的菌體細胞在 45 85°C的條件下風干，使酵母細胞的含水量小于5%。結果表明，在上述培養(yǎng)條件下，每升發(fā)酵 培養(yǎng)基獲得的細胞干重為llg，每克干細胞的含鉬量為3500 y g。(8)粉碎及包裝用粉碎機將上述步驟(7)干燥后的釀酒酵母細胞粉碎。然后用 不透氣的包裝袋包裝，得到成品。2、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014 細胞內鉬離子的 有機轉化率分別測定釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014 細胞中總 鉬的含量和無機鉬的含量，總鉬含量測定方法見實施例1中步驟1的2)中細胞中鉬含量的 測定方法；無機鉬的測定即取適量菌體，超聲波破碎細胞，8000rpm離心5min，取上清液不 消化直接稀釋至合適濃度，原子吸收測無機鉬含量。實驗設三次重復，結果表明，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCCNo. 4014細胞中總鉬的平均含量為3560 y g/g，無機鉬的平均含量296y g/g，二者的 差值3264 y g/g即為細胞中有機鉬的平均含量，細胞中鉬離子的有機轉化率為91. 7%。以 上結果說明，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014對鉬的有機轉化 能力比較強。
權利要求
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG 7，保藏號為CGMCC No.4014。
2.釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)HG-7CGMCC No. 4014 的發(fā)酵培養(yǎng)方法，是將 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HG-7CGMCC No. 4014接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在如下 的發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)25-35°C，180-250rpm培養(yǎng)35_45h ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為40-100g/L碳源、1000-2000mg/L可溶性鉬鹽、5_20g/L酵母 粉，其余為水。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為80g/L碳源、 1750mg/L可溶性鉬鹽、10g/L酵母粉，其余為水。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的方法，其特征在于所述可溶性鉬鹽為鉬酸鈉或鉬酸銨， 優(yōu)選為鉬酸鈉；所述碳源為蔗糖或麥芽糖。
5.根據(jù)權利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為 4. 5-6. 5，優(yōu)選為 5. 5。
6.根據(jù)權利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為30°C， 200rpm 培養(yǎng) 40h。
7.一種制備含有機鉬的產品的方法，是將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014在含無機鉬培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，收集所述釀酒酵母，得到所述產品。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于所述含無機鉬培養(yǎng)基與權利要求2-5 中任一所述方法中的發(fā)酵培養(yǎng)基相同；所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件25-35°C、180-250rpm培養(yǎng) 35-45h、通空氣的量為1. 1-1. 5L/min/升培養(yǎng)基，優(yōu)選條件30°C、200rpm培養(yǎng)40h、通空氣 的量為1.3L/min/升培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權利要求7或8所述的方法，其特征在于所述方法還包括在收集所述釀酒酵 母步驟之后，將收集的所述釀酒酵母進行干燥、粉碎和包裝。
10.權利要求7-9中任一所述方法制備得到的含有機鉬的產品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株富鉬釀酒酵母及其應用。本發(fā)明提供的富鉬釀酒酵母是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7，保藏號為CGMCC No.4014。本發(fā)明還提供了一種制備含有機鉬的產品的方法。該方法是將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No.4014在含無機鉬培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，收集所述釀酒酵母，得到所述產品。本發(fā)明的培養(yǎng)方法實用性強、操作簡便、成本低廉，對發(fā)酵設備及生產條件沒有特殊要求，利用一般發(fā)酵廠的設備和生產條件即可生產，投資少、見效快、效益高，不但適合于大規(guī)模的生產還適合于小批量的生產，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12R1/865GK101942399SQ20101027758
公開日2011年1月12日 申請日期2010年9月8日 優(yōu)先權日2010年9月8日
發(fā)明者何秀萍, 奧杰, 張博潤, 郭雪娜 申請人:中國科學院微生物研究所