專利名稱：一種棉花epsp合成酶突變體基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程研究領(lǐng)域，具體涉及棉花EPSP合成酶基因的改造及表達(dá)載體的構(gòu)建，以及在抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物品種研制中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
草甘膦是一種非選擇性除草劑，具有廣譜除草和土壤中迅速降解的優(yōu)點(diǎn)，而且由于動(dòng)物體內(nèi)不存在這種酶，是對人、畜最安全的除草劑之一。草甘膦理化性質(zhì)穩(wěn)定、高效、廣譜、低毒、低殘留、易于被微生物分解，不破壞土壤環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中， 成為目前世界上生產(chǎn)量最大的農(nóng)藥品種。自從1976年美國孟山都公司的草甘膦類除草劑-農(nóng)達(dá)(Roundup)研制成功并得到廣泛應(yīng)用以來，作物抗草甘膦轉(zhuǎn)基因研究成為抗除草劑基因工程研究的熱點(diǎn)。隨著抗草甘膦基因克隆的發(fā)展，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物也相繼問世并大面積推廣應(yīng)用。草甘膦的作用機(jī)理主要是競爭性抑制莽草酸途徑中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。該酶是真菌、細(xì)菌、藻類和高等植物體內(nèi)芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成過程中一個(gè)關(guān)鍵性的酶。草甘膦是磷酸稀醇式丙酮酸 (PEP)的類似物，是EPSPS競爭性抑制劑，草甘膦、EPSPS和三磷酸莽草酸(S3P)結(jié)合形成 EPSPS-S3P-草甘膦復(fù)合體(此復(fù)合體非常穩(wěn)定)，抑制EPSPS的活性導(dǎo)致分支酸合成受阻， 阻斷芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，最終導(dǎo)致一些激素和關(guān)鍵性代謝物如類黃酮、木質(zhì)素和酚類化合物代謝失調(diào)，從而擾亂了生物體正常的氮代謝而使其死亡。目前植物抗草甘膦轉(zhuǎn)基因工程研究有四種方法1)選用對草甘膦不敏感的EPSPS 或通過氨基酸序列改變獲得抗性EPSPS基因；幻將編碼EPSPS在植物體中過量表達(dá)；3)導(dǎo)入降解草甘膦的基因(如編碼草甘膦氧化還原酶的gox基因)；4)導(dǎo)入氮乙酰轉(zhuǎn)移酶(GAT 基因)使草甘磷乙酰化等(Barry et al.，1992 ；Padgette et al.，1996 ；Dill,2005 ；Tan et al. ,2006 ；Castle et al.，2004)。其中商業(yè)化使用最廣泛的是在植物中過量表達(dá)對草甘膦不敏感或突變的EPSPS基因。選用抗性EPSPS基因是獲得轉(zhuǎn)基因作物的關(guān)鍵因子。改變EPSPS功能區(qū)的氨基酸序列，降低其與草甘膦的親和力，同時(shí)保持酶的催化活性。talker DM等(198 應(yīng)用化學(xué)誘變劑處理鼠傷寒沙門氏菌，從草甘膦抗性突變系中克隆了 aroA基因的突變體，經(jīng)DNA和蛋白質(zhì)序列分析證實(shí)突變體中第101位的義！·取代了野生型中的ftx)，將此突變體基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，獲得了抗草甘膦特性；Sost D等(1990)克隆并測序了來自野生型Klebsiella pneumoniae和具有草甘膦抗性的突變型Klebsiella pneumoniae Kl (它編碼一個(gè)對草甘膦不敏感的EPSPQ的aroA基因，顯示一個(gè)單堿基的不同導(dǎo)致在氨基酸序列中96位Gly變?yōu)?Ala0 Baerson SR等在馬來群島發(fā)現(xiàn)了一種具有草甘膦抗性的牛筋草(Eleusine indica), 該牛筋草比該地其它草甘膦敏感物種的LD50值要高出2-4倍，通過比較抗性牛筋草和感性牛筋草的EPSPS序列，發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)氨基酸不同，其中一個(gè)為有意突變，即抗性牛筋草EPSPS 的第106的Pro被Ser替代。我國的向文勝等(2001)，篩選出的抗草甘膦菜豆與感性菜豆比較，抗性菜豆的513位為Gln，感性菜豆該位點(diǎn)為Glu。何鳴等^00 獲得抗性提高的鼠傷寒沙門氏桿菌和大腸桿菌的EPSPS基因，兩個(gè)突變體在42位Met替換Thr。Monsanto公司將來自矮牽牛、番茄、擬南芥、大豆、玉米、鼠傷寒沙門氏菌的EPSPS基因的第80-120中的 Gly替換為Ala，第170-210中的Ala替換為Thr，獲得抗草甘膦的大豆、玉米、油菜等。植物中過量表達(dá)EPSPS基因可顯著增強(qiáng)植株抗草甘膦的功能。Amrhein等對通過逐漸增加草甘膦的選擇壓篩選到一個(gè)耐草甘膦矮牽牛細(xì)胞系，分析該細(xì)胞系EPSPS基因結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目的基因拷貝數(shù)增加了 20倍左右。利用35S啟動(dòng)子啟動(dòng)該基因在轉(zhuǎn)基因植株中大量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株對草甘膦施用量的耐受程度為殺死非轉(zhuǎn)基因植株用量的4倍以上。Todd A等對大量使用草甘膦農(nóng)田中的長芒莧研究發(fā)現(xiàn)，抗草甘膦植株中EPSPS酶活與敏感型一致，但基因拷貝數(shù)比敏感型增加了 5 160倍，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其抗性高低與蛋白表達(dá)量及基因拷貝數(shù)成正相關(guān)。EPSPS只有運(yùn)輸?shù)饺~綠體中才能發(fā)揮作用。因此在構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)在基因前需添加一段導(dǎo)肽序列，形成融合表達(dá)，便于目的蛋白向葉綠體中的定向轉(zhuǎn)移。構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，本發(fā)明選擇棉花EPSPS基因的葉綠體導(dǎo)肽(CTP)作為目的基因的融合表達(dá)導(dǎo)肽。載體構(gòu)建中啟動(dòng)子后面加了一段OK(Omega & Kozak)序列，在基因終止密碼子后加 PS(Processing & Splicing sequence)(已在 ZL 95 119563. 8 中充分公開)，可促進(jìn)外源基因在植物體內(nèi)的高效轉(zhuǎn)錄和翻譯。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種棉花5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)突變體基因的核苷酸序列，如SEQ ID N0:1所示。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種棉花EPSPS突變體的氨基酸序列，如SEQID NO 2所示。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種棉花EPSPS突變體融合基因的核苷酸序列，如 SEQ ID NO 3 所示。本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供一種棉花EPSPS突變體融合基因的氨基酸序列，如 SEQ ID NO 4 所示。本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供含有所述棉花EPSPS突變體基因或其融合基因的植物表達(dá)載體。本發(fā)明的第六個(gè)目的在于提供用所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或植株。本發(fā)明的第七個(gè)目的在于所述棉花EPSPS突變體基因或其融合基因在抗草甘膦植物品種中的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)1)提取陸地棉(鄂雜棉11F1)總RNA，利用Oligo dT反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，利用NCBI 上已公布的序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增棉花EPSPS及其融合導(dǎo)肽序列，分別命名為C-EPSPS，CTP。2)利用多點(diǎn)突變技術(shù)對C-EPSPS基因進(jìn)行修飾，獲得突變體基因MC-EPSPS。3)原核表達(dá)產(chǎn)物抗草甘膦功能鑒定構(gòu)建MC-EPSPS基因的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21(DE3)Plyk，在一濃度草甘膦選擇壓下培養(yǎng)，觀察其生長情況，同時(shí)以轉(zhuǎn)C-EPSPS及空載體的表達(dá)菌為對照。分析正常誘導(dǎo)條件下，MC-EPSPS與C-EPSPS的表達(dá)情況。4)酶催化活性鑒定分別將含有C-EPSPS及MC-EPSPS原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到EPSPS 缺陷型菌株ER2799中，在M9培養(yǎng)基上觀察其生長情況。5)含有MC-EPSPS植物表達(dá)載體構(gòu)建，所述方法包括選擇含雙增強(qiáng)子的35S啟動(dòng)子及Tnos作為MC-EPSPS基因的啟動(dòng)子和終止子，在啟動(dòng)子后面加了一段OK序列，在基因的終止密碼子后加PS序列。在目的基因的5’端加上棉花EPSPS基因的葉綠體導(dǎo)肽序列 (CTP)，使兩者在植物中獲得融合表達(dá)。將整個(gè)表達(dá)框插入到經(jīng)修飾的雙元表達(dá)載體pBI121 中，獲得抗草甘膦植物表達(dá)載體ρΒΙ-MC-EPSPS。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草及棉花。6)轉(zhuǎn)基因植物抗草甘膦功能鑒定在經(jīng)PCR鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因植株葉片上涂抹或噴施0. 2%的草甘膦，7天后觀察結(jié)果。


圖 1 分別含 MC-EPSPS-pET30a、C_EPSPS_pET30a 及 pET30a 的轉(zhuǎn)化子在含 IOOmM 草甘膦的M9培養(yǎng)基中的生長曲線 2 分別含 MC-EPSPS-pET30a、C-EPSPS-pET30a 及 pET30a 的 BL21 (DE3) PlysS 轉(zhuǎn)化子在含150mM草甘膦的M9液體培養(yǎng)基中的生長曲線3 :A是含MC-EPSPS-pET30a質(zhì)粒的EPSPS缺陷型菌株ER2799在M9固體培養(yǎng)基中的生長情況；B是含C-EPSPS-pET30a質(zhì)粒的EPSPS缺陷型菌株ER2799在M9固體培養(yǎng)基中的生長情況；C是含pET30a質(zhì)粒的EPSPS缺陷型菌株ER2799在M9固體培養(yǎng)基中的生長情況圖 4 分別含 MC-EPSPS-pET30a、C-EPSPS-pET30a 及 pET30a 的 BL21 (DE3) PlysS 轉(zhuǎn)化子的蛋白表達(dá)情況圖5 植物表達(dá)載體pBI-MC-EPSPS構(gòu)建路線6 :A是轉(zhuǎn)MC-EPSPS基因的煙草涂抹0. 2%草甘膦7天后結(jié)果；B是非轉(zhuǎn)基因煙草涂抹0.2%草甘膦7天后結(jié)果圖7 :A是轉(zhuǎn)MC-EPSPS基因棉花噴施0. 2%草甘膦7天后結(jié)果；B是非轉(zhuǎn)基因棉花噴施0.2%草甘膦7天后結(jié)果
具體實(shí)施例方式以下優(yōu)選的實(shí)施例可對本發(fā)明的技術(shù)路線做進(jìn)一步說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。 實(shí)施例1MC-EPSPS基因的獲得1、棉花總RNA的提取A.取0. Ig棉花葉片液氮研磨后，加0. 5ml植物RNA提取液(購自invitrogen)， 振蕩至徹底混勻。B.室溫放置5分鐘。C. 4"C 12，OOOrpm離心1分鐘，上清轉(zhuǎn)入新的無RNase離心管。D.加入 0. Iml 5M NaCl，溫和混勻。E.加入0. 3ml氯仿，上下顛倒混勻。
F. 4"C 12，OOOrpm離心10分鐘，取上層水相轉(zhuǎn)入新的無RNase離心管。G.加與所得水相等體積的異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘。H. 40C 12，OOOrpm離心10分鐘。棄掉上清，注意不要倒出沉淀。加Iml 75%乙醇。I. 40C 5，OOOrpm離心3分鐘。倒出液體，剩余的少量液體短暫離心，然后用槍頭吸出，室溫晾干2-3分鐘。J.加50 μ 1無RNase水，反復(fù)吹打、混勻，充分溶解RNA。2、RNA樣品中DNA污染的去除Α.在 RNase-free 的 Eppendorf■管中依次力口入 16 μ 1 總 RNA、2 μ 1 10XBuffer> 1 μ 1 RnaseOUTU μ 1 RNase-free DNaseI (2U/μ 1)；B.室溫放置 15min ；C.力卩入 2μ1 25mM EDTA，65°C保溫 15min。3、逆轉(zhuǎn)錄Α.在0. 2ml tube中，加入下列成分總RNA (0. 1 μ g/ μ 1) 2. 0 μ 1Oligo (dT12-18) (2 μ Μ) 2. 0 μ 1B. 70°C水浴10分鐘。立即放置在冰浴中；C.加入下列成分2. 0μ 1 10XRT buffer ；2. 0 μ 1 250 μ M dNTP mix ；2· 0 μ 1 IOOmM DTT ；9· 8 μ 1 DEPC Η20 ；0. 2μ 1 200υμ /1 SuperScriptIII ；D.進(jìn)行下列反應(yīng)42°C 90分鐘；70°C 15分鐘；_20°C保存。4、棉花EPSPS基因的獲得以cDNA為模板，擴(kuò)增得到包括棉花EPSPS基因的5端非翻譯區(qū)、葉綠體導(dǎo)肽 (CTP)、EPSPS基因和3端非翻譯區(qū)在內(nèi)的基因組序列，棉花EPSPS基因命名為C-EPSPS。擴(kuò)增引物序列如附錄SEQ ID No :5，SEQ ID No 6 PCR 條件-MV 5min、94°C 45s,56°C 45s,72°C 4min，5 個(gè)循環(huán)；94°C 45s,60°C 45s、 72 °C 4min，25 個(gè)循環(huán)；72 °C 7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和Me I酶切后構(gòu)建到克隆載體pBulescript，載體命名為 pBulescript-C-EPSPS。5、定點(diǎn)突變對C-EPSP合成酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，將其N端第三個(gè)α螺旋中的蘇氨酸改變?yōu)楫惲涟彼?如SEQ ID No :2中第102位氨基酸所示)，脯氨酸改變?yōu)榻z氨酸(如SEQ ID No: 2中第106位氨基酸所示)。為了表達(dá)載體構(gòu)建需要，將C-EPSPS中第208位的脯氨酸及第 406位的丙氨酸進(jìn)行同義突變，消除了原基因中存在的Nde I (CATATG突變?yōu)镃TTATG)和Nco I(CCATGG突變?yōu)镃TATGG)兩酶切位點(diǎn)對后續(xù)構(gòu)建的影響。突變體基因命名為MC-EPSPS。突變引物分別見附錄 SEQ ID No 7, SEQ ID No :8，SEQ ID No :9。將引物5’端磷酸化，利于后續(xù)PCR產(chǎn)物的連接、環(huán)化。磷酸化過程如下
反應(yīng)體系引物(IOiiM) :5 ill10XT4 DNA Polynucleotide Kinase Buffer :3u 1T4 DNA Polynucleotide Kinase 1 U 1ATP(IOmM) :3 ii 1補(bǔ)水至 30 U 1反應(yīng)條件37 °C反應(yīng)45min。多點(diǎn)突變以含棉花EPSP合成酶基因的克隆載體pBulescript-C-EPSPS為模板，反 應(yīng)過程參照STRATAGENE的QuikChange Multi突變試劑盒中的說明書操作。突變后載體命 名為 pBulescript-MC-EPSPS。突變子核苷酸序列如附錄SEQ ID No :1，氨基酸序列如附錄SEQ ID No :2，與原基 因的核苷酸同源性為99. 55%，氨基酸水平上只有第102位、106位的氨基酸發(fā)生改變，同源 性也為99. 55%。突變克隆子經(jīng)PCR及測序鑒定正確后保存?zhèn)溆?。?shí)施例2MC-EPSPS基因原核表達(dá)構(gòu)建設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增MC-EPSPS基因，使其5’端加Nde I酶切位點(diǎn)，3’端加Mc I酶切點(diǎn)， 以突變后的pBulescript-MC-EPSPS為模板，引物序列見附錄SEQ ID No 10, SEQ ID No :11。 PCR 條件-MV 5min、94°C 45s、54°C 45s,72°C 4min，30 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) Nde I和Sac I酶切后構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET30a中，獲得重組表達(dá)載體MC_EPSPS-pET30a，轉(zhuǎn) 化至原核表達(dá)菌株BL21(DE3) PlysS。實(shí)施例3MC-EPSPS基因原核表達(dá)產(chǎn)物抗草甘膦特性分析MC-EPSPS基因的抗草甘膦功能分析將轉(zhuǎn)化子BL21 (MC_EPSPS-pET30a)、 BL21 (C-EPSPS-pET30a)及BL21 (pET30a)分別接種到液體M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含卡那霉素 50iig/mL)，37°C下活化過夜后，按1 100稀釋，取300 y L接種到30mL液體M9基礎(chǔ)培養(yǎng) 基(含卡那霉素50ii g/mL)中，以200rpm，37°C空氣浴的條件培養(yǎng)。培養(yǎng)到OD6tltl = 0. 100 左右，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，加入草甘磷至終濃度100或150mM，以200rpm，37°C空 氣浴的條件培養(yǎng)，培養(yǎng)至14或16小時(shí)開始，每隔2小時(shí)測定一次培養(yǎng)液0D600，記錄其生長 情況，測定結(jié)果如附圖中圖1、圖2所示。從圖1、圖2的生長曲線可以看出，攜帯突變體基 因的轉(zhuǎn)化子在含有150mM草甘膦的M9基本培養(yǎng)基上仍能生存，而攜帶有野生型基因的轉(zhuǎn)化 子在含有150mM的草甘磷的M9基本培養(yǎng)基上的生長已受到嚴(yán)重的抑制。由此可見，突變子 的抗草甘膦能力比野生型有了明顯提高。原核表達(dá)情況分析挑取含BL21 (MC-EPSPS-pET30a)、BL21 (C_EPSPS_pET30a)及 BL21(pET30a)單菌落接種到液體LB(含卡那霉素50 y g/mL)中，37 °C下活化過夜后，按 1 100稀釋，取50iiL接種到5mL液體LB (含卡那霉素50iig/mL)中，37°C下培養(yǎng)到OD6tltl =0.6左右，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，于37°C振蕩誘導(dǎo)表達(dá)汕。離心收集菌液，用 0. 2倍體積凝膠上樣緩沖液重懸菌體，沸水中煮5min，分別取15 y L上梓，SDS-PAGE電冰分 析參考Sambrook等(1989)方法，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，0. 25%考馬斯亮藍(lán)R-250染 色。電泳結(jié)果如附圖中圖3所示，第1 3泳道為BL21 (C-EPSPS-pET30a)三個(gè)克隆子的蛋 白粗提物，第4 6泳道為BL21 (MC-EPSPS-pET30a)三個(gè)克隆子的蛋白粗提物，第7、8泳道 為BL21(pET30a)兩個(gè)克隆子蛋白粗提物。由電泳圖可以看出，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的攜帯有EPSPS基因的克隆子均可表達(dá)出大小約為47kDa的目的蛋白。表明在相同的表達(dá)條件下，野生型和突變體基因均可獲得有效表達(dá)，并且表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。由以上結(jié)果表明，MC-EPSPS抗性提高不是由于基因的過量表達(dá)引起的，而是由于蛋白結(jié)構(gòu)改變決定的。實(shí)施例4MC-EPSPS基因原核表達(dá)產(chǎn)物酶活鑒定為進(jìn)一步驗(yàn)證突變體基因酶催化活性，將轉(zhuǎn)化子BL21 (MC-EPSPS-pET30a)、 BL21 (C-EPSPS-pET30a)及BL21 (pET30a)分別接種到分別接種到液體LB培養(yǎng)基中，37°C， 200rpm，培養(yǎng)12h。利用堿裂解法提取質(zhì)粒，取0. 1 μ g質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到EPSP合成酶缺陷型菌株大腸桿菌ER2799中，轉(zhuǎn)化子在含ImM IPTG、卡那霉素50ug/ml的M9固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 后觀察生長情況，如圖4A、圖4B、圖4C。從附圖中圖4A、圖4B、圖4C轉(zhuǎn)化子的生長情況可以看出，ER2799(MC-EPSPS-pET30a)和 ER2799 (C_EPSPS_pET30a)轉(zhuǎn)化子的數(shù)量及大小基本一致，而ER2799(pET30a)沒有轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。說明突變蛋白仍具有一定酶催化活性。實(shí)施例5MC-EPSPS基因植物表達(dá)載體構(gòu)建選擇雙元表達(dá)載體PBI121作為植物表達(dá)載體，從載體pCambia2300擴(kuò)增含雙增強(qiáng)子的35S啟動(dòng)子，兩端分別帶Hind III和BamH I，引物序列如SEQ ID No 12及SEQ ID No :13所示，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后克隆到pUC18中。根據(jù)公布的OK(Omega & Kozak)序列及 PS(Processing & Splicing sequence)序列(兩者已在 ZL 95 119563. 8 中充分公開)合成OK-Pst I-Xho I-PS片段，兩端分別帶BamH I和&ic I酶切位點(diǎn)，在OK與PS 之間以I^st I.Xho I兩酶切位點(diǎn)相連，兩個(gè)酶切位點(diǎn)間插入保護(hù)堿基便于后續(xù)的酶切構(gòu)建，利用BamH I和&ic I將OK-Pst I-Xho I-PS克隆到重組質(zhì)粒!35S-pUC18中，獲得重組質(zhì)粒 35S-0K-PS-pUC18。以 pBulescript-MC-EPSPS 為模板擴(kuò)增 CTP-MC-EPSPS 片段， 基因序列如SEQ ID No :3所示，在融合序列兩端分別加I^st I, Xho I酶切位點(diǎn)，引物序列如SEQ ID No:14及SEQ ID No :15所示，利用兩端的酶切位點(diǎn)將CTP-MC-EPSPS連入 !35S-OK-PS-pUC18 中，獲得重組質(zhì)粒;35S-OK-CTP-MC-PS-pUC18。利用 Hind III 和 Sac I 將 35S-0K-CTP-MC-PS-pUC18中35S至PS的片段克隆到pBI121中，替換原來的35S-GUS，獲得重組植物表達(dá)載體pBI-MC-EPSPS，具體構(gòu)建流程如附圖中圖5所示。實(shí)施例6利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法獲得抗草甘膦煙草用75%酒精浸泡煙草種子30s，再用0. 升汞浸泡8min，進(jìn)行表面消毒。將消過毒的煙草種子置于MS培養(yǎng)基(加蔗糖30g/L)上無菌發(fā)芽，制備無菌苗。取無菌苗葉片剪成 5mmX5mm大小的葉盤，用處于對數(shù)生長期的含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌浸染葉盤lOmin，吸干菌液，在黑暗條件下共培養(yǎng)2天(MS培養(yǎng)基)。將葉片轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基(MS+lmg/L BA+0. Img/ L NAA+50mg/L卡那霉素+500mg/L頭孢霉素)上，光照條件下培養(yǎng)45天左右，待芽長大后切下轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(MS+50mg/L卡那霉素+500mg/L頭孢霉素)中培養(yǎng)30天左右，待根系發(fā)達(dá)后將小苗轉(zhuǎn)入僅加有500mg/L頭孢霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行編號保存。取獲得的轉(zhuǎn)基因煙草葉片，提取DNA后進(jìn)行PCR鑒定，用0. 2%的草甘膦噴PCR鑒定為陽性的煙草葉片，7天后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如附圖中圖6A和6B所示，轉(zhuǎn)MC-EPSPS基因的轉(zhuǎn)基因煙草均能正常生長(圖6A)，而非轉(zhuǎn)基因煙草生長顯著受抑制，葉片發(fā)黃、萎蔫(圖 6B)。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)pBI-MC-EPSPS質(zhì)粒的煙草具有較好的草甘膦抗性。
實(shí)施例7利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花獲得抗除草劑轉(zhuǎn)基因棉花農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是本領(lǐng)域科研人員熟知的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法。具體操作程序?yàn)?.菌株培養(yǎng)將所構(gòu)建的pBI-MC-EPSPS質(zhì)粒電激轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株LBA4404中，農(nóng)桿菌單菌落接種于含卡那霉素50mg/L、利福平25mg/L的LB或YEB液體培養(yǎng)基中。振蕩暗培養(yǎng)過夜到細(xì)菌生長對數(shù)期。用LB或YEB液體培養(yǎng)基稀釋菌液，再振蕩培養(yǎng)4 他，將菌液稀釋至 0D600 值 0. 3 0. 35。2.無菌苗制備(1)棉花種子用硫酸(H2SO4)脫去短絨，自來水洗掉種子表面的硫酸，晾干后用 70%乙醇對種子進(jìn)行表面消毒lmin，再用10% 15%過氧化氫(H2O2)處理2 4h，用無菌水沖洗2 3次；(2)在無菌水中浸泡18 Mh，待種子露白，再在無菌條件下剝?nèi)シN皮，種入種苗培養(yǎng)基(1/2MS+ 瓊脂 6g/L，pH 6. 8)中；(3)25°C 光培養(yǎng)3 5d時(shí)備用。3.棉花外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)取無菌苗的下胚軸，用解剖刀切成0. 5 0. 6cm小段，浸入稀釋好的菌液中5 lOmin，然后取出胚軸段，用滅菌濾紙吸干多余的菌液，放在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(MS+2.4-D 0. lmg/L+KT 0. lmg/L+ 葡萄糖 30g/L+ 乙酰丁香酮 200mg/L+ 瓊脂 6g/L，pH5. 0，表面鋪一層滅菌濾紙)，用封口膜封口。22°C 25°C共培養(yǎng)2天。4.誘導(dǎo)愈傷組織及抗性愈傷組織的篩選(1)愈傷組織的誘導(dǎo)經(jīng)共培養(yǎng)后的下胚軸段放入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(MS+2，4_D 0. lmg/L+KT 0. lmg/L+MgCl2 0. 91g/L+Gelrite 2. Og/L+ 卡那霉素 50 100mg/L+ 頭孢霉素 500mg/L+ 葡萄糖30g/L，pH 5. 8)，在常規(guī)條件下(25°C )培養(yǎng)2個(gè)月(一個(gè)月?lián)Q一次相同的培養(yǎng)基)。(2)抗性愈傷組織的檢測無菌條件下挑取愈傷組織少許進(jìn)行選擇標(biāo)記基因nptll的檢測，檢測結(jié)果為陽性的愈傷組織繼續(xù)繼代，非陽性的愈傷組織淘汰。通過對nptll表達(dá)的檢測，獲得棉花抗性愈傷組織的頻率為50 % 76 %。5.愈傷組織的增殖繼代誘導(dǎo)出的抗性愈傷組織接入增殖培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+MgCl2 0. 91g/L+Gelrite 2.(^/1+葡萄糖3(^/1，？!1 5.8)中，常規(guī)條件下(25°C)培養(yǎng)，每隔一個(gè)月繼代一次，直到愈傷組織分化。在第一次和第二次轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基后有部分愈傷組織褐化死亡，正常愈傷組織增殖也不快，第二次繼代后，愈傷組織增殖速度才加快。6.愈傷組織的分化及轉(zhuǎn)基因苗移栽愈傷組織經(jīng)繼代幾次后，有的愈傷組織轉(zhuǎn)成米粒狀顆粒，將其轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中 (無NH4+、且KNO3加倍的MS+谷氨酰胺1. Og/L+天門冬酰胺0. 5g/L+MgCl2 0. 91 1. 35g/ L+Gelrite 2. 0 3. 0g/L+葡萄糖20 30g/L，pH 5. 8)，進(jìn)一步分化成胚狀體，胚狀體長成為小植株后再轉(zhuǎn)入大的三角瓶中，待根長好后練苗移栽。洗去再生棉株根部的培養(yǎng)基，栽到滅菌蛭石中，澆足營養(yǎng)液。栽好的再生棉苗放入控溫22°C、控濕80 85%的人工培養(yǎng)箱中5 7d，再在溫室中培養(yǎng)10 20d后移栽到土盆或大田中。利用上述方法，抗除草劑基因植物表達(dá)載體導(dǎo)入棉花中獲得了轉(zhuǎn)基因棉花。鑒定方法如實(shí)施例6，結(jié)果如附圖中圖7A和7B所示，轉(zhuǎn)MC-EPSPS基因的轉(zhuǎn)基因棉花均能正常生長(圖7A)，而非轉(zhuǎn)基因煙草生長顯著受抑制，葉片發(fā)黃、萎蔫(圖7B)。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)pBI-MC-EPSPS質(zhì)粒的棉花具有較好的草甘膦抗性。
權(quán)利要求
1.一種棉花EPSP合成酶突變體基因，其具有如SEQ ID No 1所示的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的棉花EPSP合成酶突變體基因所編碼的蛋白質(zhì)，具有SEQID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一種棉花EPSP合成酶突變體融合基因，其具有如SEQ ID No :3所示的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求3所述的棉花EPSP合成酶突變體融合基因所編碼的蛋白質(zhì)，具有SEQID NO :4所示的氨基酸序列。
5.含有權(quán)利要求1、3所述棉花EPSP合成酶突變體基因或其融合基因的植物表達(dá)載體。
6.用權(quán)利要求5所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或植株。
7.權(quán)利要求1、3所述棉花EPSP合成酶突變體基因或其融合基因在抗草甘膦植物品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種棉花EPSP合成酶突變體以及編碼這種突變EPSP合成酶的人工突變體基因MC-EPSPS。根據(jù)文獻(xiàn)資料及蛋白結(jié)構(gòu)分析，設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)，利用DNA序列的同源重組特性及PCR擴(kuò)增法，以來自陸地棉的EPSP合成酶基因?yàn)槟０?，采用DNA序列多點(diǎn)突變的優(yōu)化方法，獲得兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變的、并具有抗草甘膦功能的突變體基因。其編碼的合成酶與草甘膦的結(jié)合效率明顯降低，并具有一定的酶催化效率。本發(fā)明所提供的EPSP合成酶突變體基因可應(yīng)用于抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物新品種培育。
文檔編號C12N15/62GK102399794SQ20101027766
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月8日
發(fā)明者何云蔚, 崔洪志, 王建勝 申請人:創(chuàng)世紀(jì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)有限公司