專利名稱：利用顛茄托品酮還原酶i型基因提高顛茄莨菪烷類生物堿含量的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學、育種學以及基因工程等領域，為一種利用基因工程技術培育莨菪烷類生物堿(Tropane alkaloids，TAs)高產(chǎn)的顛茄belladonna L .) 的方法，具體涉及目的基因的克隆、表達載體的構建、獲得TAs高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因顛茄的具體過程。本發(fā)明還提供利用基因工程獲得的TAs高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因顛茄及其培養(yǎng)的子代、再生植株、 植物組織或種子。
背景技術：
莨菪烷類生物堿(Tropane alkaloids，TAs)在臨床上應用廣泛。初期用于麻醉前給藥、抗暈動藥、治療帕金森癥以及改善微循環(huán)等，市場需求巨大。隨著對TAs藥理作用的研究深入，TAs逐漸廣泛用于戒毒脫癮、治療農(nóng)藥中毒等。在原有巨大市場基礎上，隨著TAs 新功能的不斷開發(fā)，其需求還在不斷迅速增長。目前TAs都是從天然植物中提取，例如顛茄、莨菪、曼陀羅等茄科植物，其中顛茄是TAs最主要的商業(yè)栽培藥源。顛茄各部位均富含生物堿，主要為莨菪堿(hyoscyamine， C17H23O3N)和東莨菪堿，但是天然的顛茄中TAs的量很低，而且東莨菪堿的含量比莨菪堿的含量要低得多。TAs的基本代謝途徑已經(jīng)研究得較為清楚。其生物合成的上游前體為多胺代謝物。 其中，托品酮還原酶(tropinone reductase, TR)是立體專一性依賴NADPH的還原酶，包括 TR-I、TR-II兩種，形成了 TAs生物合成的分支點，TR-I催化TA生物合成的中間產(chǎn)物托品酮還原成托品堿，TR-II催化托品酮還原成托品(假托品堿)，托品與來自于苯丙氨酸的托品酸反應，合成莨菪堿。本發(fā)明采用基因工程方法在顛茄過量表達TR-I基因，從而達到打破顛茄中TAs生物途徑上的限速反應，最終培育出TAs高產(chǎn)的顛茄。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的是提供一種利用基因工程技術遺傳改良顛茄的方法，該方法將轉(zhuǎn)移來源于顛茄的TR-I基因核苷酸編碼區(qū)到顛茄中高效表達，從而提高顛茄中TAs的合成能力。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種植物表達載體，它包含上述顛茄的TR-I 基因核苷酸的編碼區(qū)。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述植物表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。在實例中該宿主細胞是顛茄。本發(fā)明的技術方案如下
本發(fā)明分離出的一條DNA分子為顛茄的TR-I基因的編碼區(qū)，用引物f-TR-I 5'-GAAG ATCTATGGAAGAATCAAAAGATAACA-3，和 r-TR-I :5，-GGGTGACCTAAAA TCCACCATTAGCAGTG-3，可以從顛茄中擴增出來。一種利用基因工程技術提高顛茄中TA含量的方法，特征在于利用攜帶顛茄的 TR-I基因編碼區(qū)的植物表達載體，采用任何轉(zhuǎn)基因方法在顛茄細胞、組織、器官、植株中過量表達TR-I，從而提高顛茄中TAs生物合成能力。其步驟如下
(1)采用基因克隆的方法獲得顛茄的TR-I基因編碼區(qū)，即TR-I基因核苷酸的編碼區(qū) 克隆顛茄 TR-I 基因編碼區(qū)的引物為f-TR-I :5，- GAAGATCTATGGAAGAATCAAAAGATAA CA -3，，作為上游引物，攜帶勒·/ II 酶切位點；r f-TR-I :5，- GGGTGACCTAMATCCACCATTAGCAGT G-3’，作為下游引物，攜帶feii II酶切位點；
(2)把顛茄的TR-I基因編碼區(qū)連于表達調(diào)控序列，形成植物表達載體；
(3)獲得顛茄的無菌外植體；
(4)采用任何轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移顛茄的TR-I基因編碼區(qū)到顛茄細胞、組織、器官、植株
中；
(5)在特定的條件下篩選和鑒定顛茄轉(zhuǎn)化子；
(6)在適合的條件下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因的顛茄，獲得轉(zhuǎn)基因后代。本發(fā)明涉及的植物表達載體包含顛茄的TR-I基因編碼區(qū)的DNA。用上述方法獲得的生命體，它是轉(zhuǎn)基因的顛茄的細胞、組織、器官、植株，導入了在 CaMV 35S啟動子驅(qū)動下的顛茄TR-I基因編碼區(qū)，其TR-I表達水平得到大大提高，TAs合成能力得到大大提高，TAs含量也得到大大提高。在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒等。在本發(fā)明中，術語“生命體”指顛茄的細胞、組織、器官、植株。在本發(fā)明中，術語“莨菪烷類生物堿”、“ TAs，，包括莨菪堿和東莨菪堿。在本發(fā)明中，術語“任何轉(zhuǎn)基因方法”包括根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導基因轉(zhuǎn)化、發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導基因轉(zhuǎn)化、植物病毒載體介導基因轉(zhuǎn)化、如PEG介導基因轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)化、電擊法介導基因轉(zhuǎn)化、超聲波介導基因轉(zhuǎn)化、顯微注射介導基因轉(zhuǎn)化、激光微束介導基因轉(zhuǎn)化、基因槍法介導基因轉(zhuǎn)化、花粉管通道介導基因轉(zhuǎn)化、生殖細胞浸泡法介導基因轉(zhuǎn)化等。在本發(fā)明中，術語“在特定的條件下篩選和鑒定顛茄轉(zhuǎn)化子”是指在離體培養(yǎng)的條件下用抗生素(卡那霉素、潮霉素、G418等)選擇出有抗生素抗性的顛茄的轉(zhuǎn)化子；可以使用 PCR、Southern雜交、Northern雜交和Western印跡等方法來鑒定顛茄的轉(zhuǎn)化子。在本發(fā)明中，術語“在適合的條件下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因的顛茄，獲得轉(zhuǎn)基因后代”是指對經(jīng)過鑒定的轉(zhuǎn)化子離體培養(yǎng)，并檢測TR-I基因的表達水平，篩選TAs高產(chǎn)的優(yōu)良轉(zhuǎn)化子進行培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因后代。在本發(fā)明中，我們從顛茄中克隆TR-I基因的編碼區(qū)，并構建了植物高效表達載體，并遺傳轉(zhuǎn)化顛茄，以打破顛茄中TAs生物合成途徑中的限速反應步驟，從而提高TAs的生成能力，然后篩選獲得TAs高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因顛茄進行培養(yǎng)，并獲得轉(zhuǎn)基因后代。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如《分子克隆》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照生產(chǎn)廠商所建議的條件。實施例1
顛茄TR-I基因編碼區(qū)的克隆
從顛茄葉片中提總RNA (上海華舜生物工程有限公司的RNA提取試劑盒)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA (TaKaRa RNA PCR Kit),然后進行PCR擴增，擴增引物為f-TR_I :5，-GAAGATCTATGGAAGAATCAAAAGATAACA HPr-TR-I :5，- GGGTGACCTAAAAT CCACCATTAGCAGTG -3’； PCR擴增反應如下反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物lyL，10XPCR反應緩沖液5yL，25 mmol/L的 MgCl23y L,200 μ mol/L dNTPs，2.5 U Taq DNA 聚合酶，10 mmol X 10 一 6/L 的引物各 1 μ L， 最后用滅菌雙蒸水補齊總體系為50 μ L。PCR反應條件如下94°C預變性5 min，然后開始包括94°C變性45 sec、56°C退火45 sec、72°C延伸1 min的28個擴增循環(huán)，最后72°C延伸 8min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目標產(chǎn)物(V-gene純化試劑盒)，純化后與 PMD 19-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細胞，挑選陽性白色菌落單克隆測序并在LB+氨芐青霉素(AmpiCillin，Amp) 100mg/L液體培養(yǎng)基中振蕩擴大培養(yǎng)。利用質(zhì)粒提取試劑盒(北京天根)提取重組質(zhì)粒經(jīng)II、fe坊II雙酶切、PCR檢測驗證及測序確認序列，將獲得的重組質(zhì)粒命名為T-easy+77 -/。實施例2
構建攜帶顛茄TR-I基因編碼區(qū)的植物表達載體
選用pBI121和pCAMBIA1304為基本元件，構建雙元三價植物表達載體pCAMBIA1304+ (pl304+)。構建流程如下..Y、Hind III 禾Π&οΤΡΙ 雙酶切 ρΒΙ121 和 pCAMBIA1304 ；2)回收 PBI121表達盒，回收pCAMBIA1304大片段；3)連接這兩個回收產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化DH5 α，在卡那霉素LB平板上篩選得到單克隆，搖菌擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，Hindlll和^^TPI雙酶切驗證；即構建好P1304+。用II和fe坊II雙酶切重組質(zhì)粒T-easy+77 -/和表達載體ρ 1304+，回收 T-easy+77 -/ 的小片段和 pl304+大片段，將回收產(chǎn)物用 DNA Ligation KitCTakara, Japan) 16° C連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5 α，LB+Kan 50mg/L固體平板上篩選陽性克隆，在LB+Kan 50mg/ L液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，PCR檢測，分別用和fe坊II雙酶切驗證， 即可獲得重組質(zhì)粒P1304++77 -/。該質(zhì)?？梢詫朕r(nóng)桿菌LBA4404，獲得工程菌，命名為 LBA4404-P1304+-77 -/，可用于對顛茄的轉(zhuǎn)化。實施例3
顛茄無菌外植體的獲得
方法一利用外植體建立顛茄無菌外植體
采取顛茄幼芽和幼莖，流水沖洗1小時；然后用2% (M/V)NaC10溶液浸泡10分鐘，用無菌水沖洗3次；再用0. 1% (M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡15分鐘，用無菌水沖洗6次；然后接種在添加無菌叢生芽誘導培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基盛于150ml的三角瓶中，于121°C滅菌20分鐘)，該培養(yǎng)基配方為MS基本培養(yǎng)基，添加植物生長調(diào)節(jié)物1.25 mg/L BA (芐基腺嘌呤)， 30g/L蔗糖和0.6 g/L PVP (聚乙烯吡咯烷酮)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為5. 8，再添加5%瓊脂粉。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)顛茄的幼芽，培養(yǎng)條件為25°C，12小時光照，光照強度為55 μ mol. πΓ2. s—1。40天后，即可獲得無菌的顛茄無菌外植體，等到葉片長到3cmX3cm大小時可用于遺傳轉(zhuǎn)化。方法二 利用顛茄種子在無菌條件下萌發(fā)獲得無菌外植體
采取顛茄成熟的種子，用2% (M/V) NaClO溶液浸泡20分鐘，用無菌水沖洗3次；再用0. (M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡30分鐘，用無菌水沖洗6次；在無菌條件下去除其種皮；將顛茄胚接種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基盛于150ml的三角瓶中，于121°C滅菌20 分鐘)，該培養(yǎng)基配方為MS基本培養(yǎng)基，添加30g/L蔗糖，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為5. 8，再添加 5%瓊脂粉。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)顛茄的幼芽，培養(yǎng)條件為25°C，黑暗條件下培養(yǎng)。待種子萌動后，改變培養(yǎng)條件為25°C，12小時光照，光照強度為25 μ mol. m_2. s—1。等到葉片長到 3cmX 3cm大小時可用于遺傳轉(zhuǎn)化。實施例4
根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化顛茄獲得轉(zhuǎn)基因顛茄
1、根癌農(nóng)桿菌LBA4404-P1304+-77 -/(按照實施范例2的方法獲得，申請人實驗室保存，西南大學生命科學學院)。使用前自冰箱取出，接種于50ml YEP液體培養(yǎng)(添加卡那霉素100mg/L，利福平40mg/L，鏈霉素25 mg/L), 28°C, 200rpm振蕩培養(yǎng)兩次；
2、第二次活化OD6c 達0.3時，加lOOymol/mL乙酰丁香酮，繼續(xù)28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)，OD600達0. 6時，室溫下4000rpm離心10分鐘；
3、棄上清，菌體用MS液體培養(yǎng)基(100μ mol/mL乙酰丁香酮)懸浮，稀釋到原體積的5 倍，在28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)，使菌液濃度達到的0D_=0. 3-0. 5左右；稱轉(zhuǎn)化液；可用于顛茄的遺傳轉(zhuǎn)化；1、2、3個步驟稱為活化根癌農(nóng)桿菌；
4、取無菌顛茄頂芽、側(cè)芽、莖等植物不同部位，將莖切成1cm小段，或?qū)⑷~片切成2cm2 左右，用無菌的解剖刀劃以“ + ”字形傷口，放入上述轉(zhuǎn)化液中，侵染10分鐘后取出，用無菌衛(wèi)生紙吸干，接入添加100 μ mol/mL乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2天，培養(yǎng)條件為25°C，黑暗條件下培養(yǎng)。5、共培養(yǎng)結束后轉(zhuǎn)移至添加1. 25 mg/L BA的MS固體培養(yǎng)基(添加200 mg/L頭孢菌素以達到除菌的目的；添加10 mg/L潮霉素作為篩選壓獲得轉(zhuǎn)基因顛茄叢生芽)中培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件為25°C，12小時光照，光照強度為55 μ mol. m_2. s—1。40天后，獲得新生的顛茄叢生芽。6、待從顛茄轉(zhuǎn)化外植體上誘導出的叢生芽長到Icm左右是，分別切下單個的叢生芽，接種在無植物生長調(diào)節(jié)物的MS固體培養(yǎng)基上(添加200 mg/L頭孢菌素以達到除菌的目的；添加10 mg/L潮霉素作為篩選壓獲得轉(zhuǎn)基因顛茄叢生芽)繼代培養(yǎng)；在該培養(yǎng)基上生長正常的顛茄叢生芽即為轉(zhuǎn)基因顛茄。以后每25天繼代培養(yǎng)一次，繼代5次后，農(nóng)桿菌可以去除干凈。然后僅在添加0.25 mg/L NAA的MS固體培養(yǎng)基上生根即可。轉(zhuǎn)基因顛茄煉苗 1周后，即可移栽。實施例5
轉(zhuǎn)基因顛茄的分子檢測
1、顛茄基因組DNA的提取，方法如下
1)取少量顛茄，放入1.5ml的Eppendorf管中，加500微升抽提buffer ；
2)用小玻棒充分研磨后放于60°C水浴50min，其間經(jīng)常顛倒混勻；
3)12000rpm，室溫離心10分鐘；4)取上清液，加500ul飽和酚[Tris-HCl (pH8. 0)飽和，吸取下層]，輕輕混勻，4°C 靜置5分鐘至分層；
5)12000rpm，室溫離心 IOmin ；
6)吸上清(約250微升)，加2倍體積的無水乙醇(-20°C儲存)，充分混勻，室溫靜置至 DNA析出；
7)8000rpm，4°C離心 5 分鐘；
8)用75%的乙醇洗2次，稍離心，吸凈殘余乙醇，室溫放置，使乙醇揮發(fā)完全；
9)加50ul TE( 100ug/ml RNaseA, 50mM Tris. Cl, IOmM EDTA，pH 8.0)，溶解0離。37°C 水浴1小時；
10)加40ul氯仿/異戊醇(24:1)，輕輕混勻，靜置5分鐘至分層；
11)12000rpm，室溫離心10分鐘；
12)吸取上清(約35ul)到新Eppendorf管中，_20°C保存，用于PCR檢測。抽提緩沖液配方如下
IOOmMTris-HCl(ρΗ8. 0)
2. 5% (ν/ν)巰基乙醇
500mMNaCl
20mMEDTA
1.5%(w/v)SDS
2、轉(zhuǎn)基因顛茄的PCR檢測，方法如下
由于所用的目的基因顛茄TR-I基因源于顛茄自身，不可能用PCR直接檢測。由于這兩個基因在P1304+上是和潮霉素抗性基因在同一個邊界內(nèi)，因而可以在轉(zhuǎn)基因顛茄中DNA 中檢測潮霉素抗性基因以確認轉(zhuǎn)化子。潮霉素抗性基因(812bp)的檢測使用引物fhygr (5， -cgatttgtgtacgcccgacagtc-3，)和 rhygr (5， -CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG， -3)。 PCR 程序為94°C變性 5min — 30 個循環(huán)(94°C 50sec — 58°C 50sec — 72 °C lmin) — 72°C 6min。陽性對照為pl304+-TR-I作為模板擴增，陰性對照為顛茄的天然葉片DNA作為模板擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測。實施例6:
東莨菪堿高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因顛茄的獲得
以分子檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因顛茄為材料，采用Northern雜交檢測目的基因，即TR-I的表達水平，篩選出高表達的轉(zhuǎn)基因株系，Northern雜交檢測目的基因表達水平方法如下
①探針的制備與標記以測序驗證的目的基因作為模板，采用與目的基因克隆時相同的引物進行PCR擴增探針。使用Amersham Pharmacia公司Gene Images Contents CDP-StarTM labelling module，RPN3540)，按照試劑盒所附說明書進行操作。用DD水或 TE稀釋模板(DNA或RNA)濃度至2-25ng/ul ；模板一般來自PCR產(chǎn)物，或酶切產(chǎn)物，回收產(chǎn)物取5ul上樣電泳，如果清晰可見，標記探針應該沒有任何問題。在沸水浴中變性DNA模板10分鐘，體積至少要20ul，立即冰浴(放入冰盒中)。在離心管中加入如下試劑10ul Nucleotide mix ；5ul Primer ;50ng 變性 DNA 模板;Iul Klenow 酶(5U/ul)；補足水至 50ul ；溫柔混勻，稍稍離心，37度過夜；用2μ 1 EDTA (0. 5Μ ρΗ=8. 0)之后在2 X SSC的溶液中于65°C沖洗帶有探針的尼龍膜15分鐘，紫燈外下觀察探針是否標記上；-20°C避光保存探針備用；
②配制瓊脂糖甲醛變性凝膠于一支180°C干烤2h的三角瓶中加入37.5 mL DEPC處理過的水；7. 5 mL IOX MOPS ；0. 55 g RNase-free的低熔點瓊脂糖；總體積45 mL ；于微波爐中化膠，冷至60°C時加入10 mL甲醛，混勻后待冷至45°C左右倒膠，插上3 mm梳子，凝膠冷后備用；
③RNA變性樣品的制備和電泳提取轉(zhuǎn)基因顛茄葉總RNA；事先采用乙醇沉淀法將 RNA樣品濃縮至3 ？ g/ L以上，并計算出每個樣品所需RNA的？ L數(shù)，準備相應數(shù)量的 RNase-free 的 500 ？ L Eppendorf 管，編號后分別加入30 g 總 RNA ；7 ？ L 甲酸；20 ？ L 去離子甲酰胺；2 ？ L IOX M0PS;DEPC處理過的水補足至40 L;混勻后于65°C變性10 min，冰上急冷，加入微量溴乙錠和6 ？ L RNase-free的上樣buffer，立即上樣，在1 X MOPS 緩沖液中于1 v. cm-1電泳，待溴酚蘭遷移至凝膠的一半距離時轉(zhuǎn)膜；
④Northern凝膠轉(zhuǎn)膜、固定和雜交檢測1)電泳完畢后取出凝膠，切去多余的膠體， 切下左上角作為標記；2)凝膠用DEPC處理過的水稍事清洗；3)同Southern雜交一樣，采用DEPC處理過的20X SSC轉(zhuǎn)膜；4)同Southern雜交一樣，在RNase-free的環(huán)境下預雜交、雜交(同Southern雜交，僅雜交溫度變?yōu)?5 °C )和洗片；
⑤最后根據(jù)雜交信號的強弱區(qū)分基因表達的強弱，選出高表達的株系作進一步的分析。 實施例7
野生型顛茄和轉(zhuǎn)基因顛茄中莨菪堿和東莨菪堿的含量比較
莨菪堿和東莨菪堿含量測定參照Hashimoto等人建立的方法(1993年)。結果為莨菪堿在野生型顛茄主根、葉和莖中的含量分別為10.0 mg/g(干重)、3.0 mg/g(干重)、0.6 mg/ g (干重)；莨菪堿在轉(zhuǎn)基因顛茄主根、葉和莖中的含量分別為14. 2 mg/g (干重)、3.8 mg/ g (干重)、1.6mg/g (干重)；東莨菪堿在野生型顛茄主根、葉和莖中的含量分別為0.6 mg/g (干重)、0.4 mg/g (干重)、0.05 mg/g (干重);東莨菪堿在轉(zhuǎn)基因顛茄主根、葉和莖中的含量分別為1.3 mg/g (干重)、0.8 mg/g (干重)、0. 1 mg/g (干重)。
權利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括具有編碼顛茄托品酮還原酶 (tropinone reductase，TR) I型(TR-I)基因核苷酸序列的編碼區(qū)，采用弓I物f-TR-I 5，-G AAGATCTATGGAAGAATCAAAAGATAACA-3 ’ 和 r_TR_I 5 ’ -GGGTGACCTAAAA TCCACCATTAGCAGTG-3 ’ 從顛茄中擴增出來。
2.一種植物表達載體，它包含上述顛茄的TR-I基因核苷酸的編碼區(qū)。
3.一種利用基因工程技術提高顛茄中莨菪烷類生物堿含量的方法，特征在于構建攜帶權利要求1中的DNA分子的植物高效表達載體，采用轉(zhuǎn)基因方法在顛茄細胞、組織、器官、植株中過量表達權利1中的DNA分子，其步驟如下(1)采用基因克隆方法獲得來源于顛茄的的TR-I基因的編碼區(qū)，即TR-I 基因核苷酸的編碼區(qū)克隆顛茄TR-I基因編碼區(qū)的引物為f-TR-I :5’ -GAAGATCTATGGMGAATCAAAAGATTA CA _3，，作為上游引物，攜帶勒·/ II 酶切位點；r f-TR-I 5，- GGGTGACCTAAAATCCACCATTAGCAGT G-3，，作為下游引物，攜帶fe坊 II 酶切位點；(2)把來源于顛茄的TR-I基因核苷酸的編碼區(qū)連于表達調(diào)控序列，形成高效植物表達載體；(3)獲得顛茄無菌外植體；(4)采用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移來源于顛茄的TR-I基因的編碼區(qū)到顛茄細胞、組織、器官、植株中；(5)篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子在離體培養(yǎng)的條件下用抗生素卡那霉素、潮霉素或G418選擇出有抗生素和草胺膦、草甘膦抗性的顛茄的轉(zhuǎn)化子；使用PCR、Southern雜交、Northern雜交或Western印跡方法來鑒定顛茄的轉(zhuǎn)化子；(6)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，獲得轉(zhuǎn)基因后代對經(jīng)過鑒定的轉(zhuǎn)化子離體培養(yǎng)，并檢測TR-I基因的表達水平，篩選TAs高產(chǎn)的優(yōu)良轉(zhuǎn)化子進行培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因后代。
4.一種用權利要求2所述的植物表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，該宿主細胞是顛茄。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用顛茄托品酮還原酶(tropinonereductase，TR)I型(TR-I)基因提高顛茄莨菪烷類生物堿含量的方法。涉及包含目的基因TR-I基因的克??；攜帶TR-I基因的植物高效表達載體的構建；攜帶TR-I基因的植物表達載體對顛茄的遺傳轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)基因顛茄的獲得與檢測。其過程是用高保真RT-PCR分離目的基因，構建攜帶目的基因的植物高效表達載體，采用轉(zhuǎn)基因技術把目的基因?qū)腩嵡迅咝П磉_，打破顛茄中莨菪烷類生物堿生物合成途徑中的限速反應，推動代謝流往目標產(chǎn)物方向流動，提高顛茄中莨菪烷類生物堿的產(chǎn)量；在特定的篩選和誘導條件下獲得轉(zhuǎn)基因的顛茄；并對轉(zhuǎn)基因顛茄進行分子檢測和化學檢測，最終獲得莨菪烷類生物堿含量大大提高的轉(zhuǎn)基因顛茄。本發(fā)明能提高顛茄莨菪烷類生物堿含量。
文檔編號C12N15/82GK102399795SQ20101027772
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月9日 優(yōu)先權日2010年9月9日
發(fā)明者唐克軒, 廖志華, 張磊, 楊春賢, 陳敏 申請人:西南大學