專利名稱：一種可生物降解的非病毒基因載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種可生物降解的聚(β-氨基酯)類聚合物非病毒基因載體及其制備方法和應(yīng)用，具體地說，涉及一類可將核酸輸送至體外和體內(nèi)各種細(xì)胞中，并表達(dá)基因編碼產(chǎn)物或沉默靶基因表達(dá)的輸送載體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明也提供了一種可生物降解的且具有生物相容性的核酸的輸送載體，并提供了該載體與核酸組成的復(fù)合物及其輸送方法。
背景技術(shù)：
基因治療是通過合適的載體將目的基因運(yùn)送到特定的組織細(xì)胞內(nèi)并使其在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)治療蛋白或取代、修復(fù)有缺陷的基因，進(jìn)而達(dá)到治療疾病的目的，其已經(jīng)成為一種研究基因功能和調(diào)控，建立各種疾病模型，以及開發(fā)針對(duì)不同獲得性和遺傳性疾病的治療方法的重要工具。裸核酸分子通過靜脈注射進(jìn)入血液循環(huán)后，會(huì)由于血清中核酶的作用迅速降解。而且，由于其分子量大、帶有負(fù)電荷，難以有效被細(xì)胞攝取。因此，基因治療的主要挑戰(zhàn)就是開發(fā)合適的載體和輸送方法以保護(hù)核酸不被降解并輸送至靶細(xì)胞內(nèi)。病毒載體已被廣泛作為核酸載體而應(yīng)用，但是病毒載體同時(shí)也帶來毒性、免疫原性、插入突變、包裝容量有限和難以大規(guī)模生產(chǎn)等問題，促使人們開始關(guān)注具有安全性高、 免疫原性低、可攜帶大容量外源基因和具有大規(guī)模生產(chǎn)潛力等優(yōu)點(diǎn)的人工合成非病毒載體。目前非病毒載體主要包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、聚合物、樹狀大分子和多肽等。陽(yáng)離子脂質(zhì)體穩(wěn)定性較差，在有血清存在的條件下轉(zhuǎn)染效率很低。陽(yáng)離子聚合物能夠通過正負(fù)電荷相互作用與核酸分子結(jié)合，并將其壓縮成為納米級(jí)大小的顆粒，同時(shí)由于陽(yáng)離子聚合物中和了核酸分子的負(fù)電荷以及具有“質(zhì)子海綿”效應(yīng)，即為核酸分子被細(xì)胞所攝取和從內(nèi)涵體中逃逸提供了條件。目前，新型陽(yáng)離子聚合物基因輸送系統(tǒng)已成為基因非病毒載體選擇開發(fā)的主要方向，如聚左旋賴氨酸、聚乙烯亞胺(PEI)、聚酰胺-胺樹狀高分子等。但PEI等陽(yáng)離子聚合物也存在嚴(yán)重問題，如不能在體內(nèi)被降解，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大毒性而導(dǎo)致其體內(nèi)應(yīng)用受到限制，以及對(duì)核酸壓縮過于緊密，不能及時(shí)釋放核酸使其從內(nèi)涵體逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，造成了轉(zhuǎn)染效率低的結(jié)果。為了克服這一障礙，許多研究人員將細(xì)胞內(nèi)可降解的化學(xué)鍵引入聚合物中，這種降解包括單純的水解，在內(nèi)涵體低PH條件下水解，酶催化降解等。

發(fā)明內(nèi)容
由于在細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境中存在濃度較高的谷胱甘肽和硫氧蛋白還原酶，二硫鍵能夠迅速斷裂，因此可以考慮將這一性質(zhì)用于生物可降解的陽(yáng)離子聚合物非病毒基因載體的選擇中?；谏鲜鲈恚景l(fā)明首次選擇并制備出含有生物可還原性二硫鍵的陽(yáng)離子聚合物非病毒基因載體，在生理?xiàng)l件下，該聚合物載體可以與生物活性試劑例如核酸分子在靜電力作用下形成納米級(jí)大小的復(fù)合物，易于被細(xì)胞攝取。在細(xì)胞內(nèi)的還原性環(huán)境下，聚合物中的二硫鍵能夠迅速斷裂，導(dǎo)致聚合物降解成無毒的小分子，核酸等生物活性試劑分子及時(shí)從復(fù)合物中被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，發(fā)揮作用，達(dá)到更好的轉(zhuǎn)染或RNA干擾效果。本發(fā)明的目的是提供一種可生物降解的聚(β_氨基酯)類聚合物非病毒基因載體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明可生物降解的聚(β_氨基酯)類聚合物非病毒基因載體主鏈含有還原敏感性的二硫鍵；所述的聚合物分子量是300-100000Da，其結(jié)構(gòu)式如下
權(quán)利要求
1. 一種聚(β_氨基酯)類聚合物非病毒基因載體，其結(jié)構(gòu)式如下
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚(β_氨基酯)類聚合物非病毒基因載體，其中，在所述結(jié)構(gòu)式中R1為-烷基-0-烷基-或者-烷基-(NH-烷基)m_ ;m為1 4的整數(shù)； R2和民各自獨(dú)立地表示氫原子、烷基、氨基取代的烷基、烷基氨基取代的烷基或者羥基取代的烷基；R表示烷基、氨基取代的烷基、烷基氨基取代的烷基或者羥基取代的烷基； 所述的烷基是指具有1 5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚(β-氨基酯)類聚合物非病毒基因載體，其中，具體為
4.一種如權(quán)利要求1所述的聚(β_氨基酯)類聚合物非病毒基因載體的制備方法，其特征在于由伯胺或仲胺化合物與二丙烯酸酯類化合物聚合而成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的聚(β-氨基酯)類聚合物非病毒基因載體的制備方法，制備步驟如下步驟1 先通過丙烯酰氯與雙(2-羥乙基)-二硫的取代反應(yīng)合成二丙烯酸酯類化合物，
6.一種如權(quán)利要求1所述的聚(β_氨基酯)類聚合物非病毒基因載體的應(yīng)用，其在體外和體內(nèi)用作核酸的輸送載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的聚(β-氨基酯)類聚合物非病毒基因載體的應(yīng)用，其中，所述的核酸包括DNA、RNA、寡聚核苷酸和/或修飾的核酸。
8.一種復(fù)合物，其含有權(quán)利要求1所述的聚(β_氨基酯)類聚合物非病毒基因載體和核酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的復(fù)合物，其中，所述的核酸包括DNA、RNA、寡聚核苷酸和/或修飾的核酸。
10.一種如權(quán)利要求8或9所述的復(fù)合物的制備方法其特征在于制備步驟如下將所述聚(β_氨基酯)類聚合物非病毒基因載體和核酸分別溶于純水或緩沖液中，配制成N/P 比為0. 001-1000的溶液，邊渦旋化邊將核酸的溶液加入到所述聚合物的溶液中，或?qū)⑺鼍酆衔锏娜芤杭尤氲胶怂岬娜芤褐校没旌先芤簻u旋化20-30秒，室溫下放置20-200分鐘至所述復(fù)合物形成。
11.一種將核酸輸送至體外和體內(nèi)靶細(xì)胞中的方法，其特征在于使用權(quán)利要求1所述的聚(β_氨基酯)類聚合物非病毒基因載體作為所述核酸的輸送載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可生物降解的聚(β-氨基酯)類聚合物非病毒基因載體，可作為非病毒陽(yáng)離子型生物活性試劑載體，其以伯胺或仲胺化合物和含還原敏感性二硫鍵的二丙烯酸酯類化合物為單體，通過Michael加成反應(yīng)聚合而成。通過靜電力作用，該聚(β-氨基酯)類聚合物載體可與核酸等生物活性試劑形成納米級(jí)大小的復(fù)合物，并可將生物活性試劑送至體外或體內(nèi)的特定細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明的聚(β-氨基酯)類聚合物非病毒基因載體具有聚合物反應(yīng)條件溫和、材料廉價(jià)易得、合成和后處理方法簡(jiǎn)單、回收率高、復(fù)合物制備方法簡(jiǎn)單、攜帶核酸的轉(zhuǎn)染效率高、生物毒性低等特點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)式如下
文檔編號(hào)C12N15/63GK102399808SQ201010279828
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者尹琦, 張志文, 李亞平 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所