專利名稱：一種干擾素發(fā)酵液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域，具體的說是提供一種干擾素發(fā)酵液的制備方法。
背景技術(shù)：
干擾素(interference，IFN)是一類多功能細(xì)胞因子，它是由培養(yǎng)的細(xì)胞或動物體受到適宜的刺激時所產(chǎn)生的一種微量的、具有高度生物學(xué)活性的非特異性抗病毒物質(zhì)。 英國科學(xué)家Aliek等(1957)利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感病毒干擾現(xiàn)象時，從中獲得了一種高活性多功能的糖蛋白，該蛋白能夠抑制流感病毒在絨毛尿囊膜細(xì)胞中的繁殖，他們稱其為干擾素(interferon，IFN)。Lamp son等(196 純化了干擾素，證明其是分子質(zhì)量為 20 34ku的蛋白質(zhì)。近年來，干擾素一直是病毒學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點。為了實現(xiàn)穩(wěn)定的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)工藝，獲得高產(chǎn)量高效價的工程菌體，設(shè)計適宜工程菌的培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝是一項非常重要的工作。目前，對工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)通常采用的是分批式培養(yǎng)方法。這種培養(yǎng)方式的培養(yǎng)初期，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)過高會抑制工程菌的生長，培養(yǎng)的中后期，又因營養(yǎng)物的消耗而降低培養(yǎng)效率，且單批產(chǎn)量和表達(dá)IFN活性不是很高。為解決這個問題，對發(fā)酵工藝進(jìn)行了改進(jìn)，采用了反饋式流加培養(yǎng)。連續(xù)或間斷測定限制性營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，并以此為目標(biāo)來調(diào)解流加速率或流加液中營養(yǎng)物質(zhì)濃度等。利用DO值及測定糖(碳源)來調(diào)控流加速度及量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種干擾素發(fā)酵液的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下(1)用YPD液體培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基，28 30°C有氧條件下培養(yǎng)畢赤酵母菌20 Mh，成為一級種子；(2)將一級種子液接種在YPD液體培養(yǎng)基二級種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，28 30°C有氧條件下培養(yǎng)畢赤酵母菌20 Mh，成為二級種子；(3)發(fā)酵罐實消，進(jìn)行發(fā)酵擴大培養(yǎng)首先將發(fā)酵罐的PH電極和溶氧電極進(jìn)行標(biāo)定，然后加入發(fā)酵培養(yǎng)基、甘油，同時在高壓滅菌前還需要將蠕動泵調(diào)節(jié)為手動方式，流加氨水，調(diào)PH至5.0，最后121°C 30min高壓滅菌。滅菌結(jié)束后，等培養(yǎng)基溫度降至?xí)r，用種子流加管接種，發(fā)酵培養(yǎng)基、甘油、種子的添加比例為50 3 5，必須確保無菌操作，同時記錄發(fā)酵罐參數(shù)。在觀 30°C有氧條件下，采用流加補料發(fā)酵方式培養(yǎng)90 120h。在發(fā)酵過程中，當(dāng)培養(yǎng)至30h (Α值達(dá)到72 90)時，工程菌便進(jìn)入加速生長階段，此時需要由蠕動泵來補加培養(yǎng)液，通過DO值控制流加速度。當(dāng)DO迅速上升時，準(zhǔn)備流加甲醇；發(fā)酵液 PH調(diào)節(jié)通過自動流加氨水；消泡劑同樣自動補料。培養(yǎng)至30h時每隔證抽樣一次，培養(yǎng)至 80h后間隔池抽樣一次，測濕重、A值及干擾素效價。(4)發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液經(jīng)5000rpm 15min離心，收集上清液。上清液即為重組酵母菌經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)的干擾素發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液用0. Olmol/L的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行脫鹽、濃縮，并用0. 22 μ m的微孔濾膜無菌過濾處理，即可得到干擾素原液；菌體沉淀在干燥箱中40°C烘干成干粉。所得干粉以1 5比例拌料使用。所述的步驟(1)中種子培養(yǎng)時間為優(yōu)選Mh，培養(yǎng)溫度。所述的步驟O)中種子培養(yǎng)時間為優(yōu)選Mh，培養(yǎng)溫度。所述的步驟(3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)時間最優(yōu)為IlOh本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的方法能改善固體發(fā)酵難于分離菌體及其代謝物的難題，使重組酵母菌及其代謝物被充分利用。采用流加式發(fā)酵方式使產(chǎn)菌量大大提高，利于工業(yè)化大量產(chǎn)生。因為該方法在菌體進(jìn)入減速期前，新的營養(yǎng)物質(zhì)不斷補充，使得工程菌自始至終處于最優(yōu)環(huán)境。 這樣延遲了穩(wěn)定期，也就延長了對數(shù)期。所以用本發(fā)明的方法制備的干擾素發(fā)酵液，它表達(dá)的IFN的活性和純度均比較高；菌體飼料添加劑應(yīng)用于畜禽類時，可不使用抗生素和激素， 并能促進(jìn)畜禽類的生長。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。實施例1 干擾素發(fā)酵液的制備方法，包括下述步驟(1)用YPD液體培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基，28 30°C有氧條件下培養(yǎng)畢赤酵母菌20 Mh，成為一級種子；(2)將一級種子液接種在YPD液體培養(yǎng)基二級種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，28 30°C有氧條件下培養(yǎng)畢赤酵母菌20 Mh，成為二級種子；(3)發(fā)酵罐實消，進(jìn)行發(fā)酵擴大培養(yǎng)首先將發(fā)酵罐的PH電極和溶氧電極進(jìn)行標(biāo)定，然后加入發(fā)酵培養(yǎng)基、甘油，同時在高壓滅菌前還需要將蠕動泵調(diào)節(jié)為手動方式，流加氨水，調(diào)PH至5.0，最后121°C 30min高壓滅菌。滅菌結(jié)束后，等培養(yǎng)基溫度降至?xí)r，用種子流加管接種，發(fā)酵培養(yǎng)基、甘油、種子的添加比例為50 3 5，必須確保無菌操作，同時記錄發(fā)酵罐參數(shù)。在觀 30°C有氧條件下，采用流加補料發(fā)酵方式培養(yǎng)90 120h。在發(fā)酵過程中，當(dāng)培養(yǎng)至30h (Α值達(dá)到72 90)時，工程菌便進(jìn)入加速生長階段，此時需要由蠕動泵來補加培養(yǎng)液，通過DO值控制流加速度。當(dāng)DO迅速上升時，準(zhǔn)備流加甲醇；發(fā)酵液 PH調(diào)節(jié)通過自動流加氨水；消泡劑同樣自動補料。培養(yǎng)至30h時每隔證抽樣一次，培養(yǎng)至 80h后間隔池抽樣一次，測濕重、A值及干擾素效價。(4)發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液經(jīng)5000rpm 15min離心，收集上清液。上清液即為重組酵母菌經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)的干擾素發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液用0. 01mol/L的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行脫鹽、濃縮，并用0. 22 μ m的微孔濾膜無菌過濾處理，即可得到干擾素原液；菌體沉淀在干燥箱中40°C烘干成干粉。所得干粉以1 5比例拌料使用。實施例2 流加式培養(yǎng)與批式培養(yǎng)的比較當(dāng)發(fā)酵結(jié)束時，分別記錄流加式培養(yǎng)與批式培養(yǎng)的菌體量及IFN產(chǎn)量。具體結(jié)果如下表所示表1流加式培養(yǎng)與批式培養(yǎng)的菌體量及IFN產(chǎn)量比較
權(quán)利要求
1.一種干擾素發(fā)酵液的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1)用YPD液體培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基，28 30°C有氧條件下?lián)u床培養(yǎng)畢赤酵母菌 20 Mh，成為一級種子；(2)將一級種子液接種于YPD液體培養(yǎng)基二級種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，28 30°C有氧條件下培養(yǎng)畢赤酵母菌20 Mh，成為二級種子；(3)發(fā)酵罐實消，進(jìn)行發(fā)酵擴大培養(yǎng)首先將發(fā)酵罐的PH電極和溶氧電極進(jìn)行標(biāo)定，然后加入發(fā)酵培養(yǎng)基、甘油，最后121°C 30min高壓滅菌，滅菌結(jié)束后，培養(yǎng)基溫度降至?xí)r，用種子流加管接種，確保無菌操作，同時記錄發(fā)酵罐參數(shù)，在觀 30°C有氧條件下，采用流加補料發(fā)酵方式培養(yǎng)90 120h ；(4)發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液經(jīng)5000rpm15min離心，上清液即為重組酵母菌經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)的干擾素發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液進(jìn)行脫鹽、濃縮、無菌過濾處理，即可得到干擾素原液；菌體沉淀用白色淀維粉吸附，在干燥箱中40°C烘干成干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種干擾素發(fā)酵液的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中種子培養(yǎng)時間為Mh，培養(yǎng)溫度^°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種干擾素發(fā)酵液的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中 YPD液體培養(yǎng)基含有1%蛋白胨、0. 5%酵母提取物、0. 5% NaCl。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種干擾素發(fā)酵液的制備方法，其特征在于所述步驟O)中種子培養(yǎng)時間為Mh，培養(yǎng)溫度^°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種干擾素發(fā)酵液的制備方法，其特征在于所述步驟(3) 中發(fā)酵培養(yǎng)基在IOOOml水中，加入IOml (1% )的黃豆餅浸出汁，IOg葡萄糖，3g蛋白胨， 2.5gNaCl，2gCaC03。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種干擾素發(fā)酵液的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中發(fā)酵培養(yǎng)時間為110h，發(fā)酵培養(yǎng)基、甘油、種子的添加比例為50 3 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種干擾素發(fā)酵液的制備方法，其特征在于所述步驟中脫鹽處理是用0. 01mol/L的磷酸緩沖液(pH7. 5-8. 0)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種干擾素發(fā)酵液的制備方法，其特征在于所述步驟中所述干粉以15比例拌料使用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種干擾素發(fā)酵液的制備方法，包括下述步驟(1)用YPD液體培養(yǎng)基復(fù)活畢赤酵母菌，作為一級種子；(2)將復(fù)活的全部菌液進(jìn)行擴大培養(yǎng)，作為二級種子；(3)發(fā)酵罐實消，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；(4)下罐，并將發(fā)酵液進(jìn)行離心、脫鹽處理，然后無菌過濾，即得干擾素發(fā)酵液。將發(fā)酵液離心，菌體沉淀用白色淀維粉作為載體吸附干燥制備干粉，作為飼料添加劑。本發(fā)明的方法能改善固體發(fā)酵難于分離菌體的問題，可極大提高純化效率，而且采用流加式發(fā)酵培養(yǎng)使產(chǎn)菌量大大提高，利于工業(yè)化大生產(chǎn)。同時酵母菌代謝物也被充分利用。本發(fā)明的菌體干粉飼料添加劑在應(yīng)用于畜禽類時，能促進(jìn)畜禽類的生長及免疫力提高。
文檔編號C12R1/84GK102399846SQ20101027986
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者劉桂蘭, 劉愛玲, 王偉穎, 聶麗娜 申請人:瑞普(天津)生物藥業(yè)有限公司