專利名稱：一種煙草黑脛病抗性的苗期恒溫水培鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于作物抗病性鑒定技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種煙草黑脛病抗性的苗期溫水水 培鑒定方法。
背景技術(shù)：
煙草黑脛病是煙草(Nicotiana tabacum)生產(chǎn)上的毀滅性病害之一，是制約我國 各煙區(qū)煙葉生產(chǎn)的最重要因素，可以危害烤煙、晾煙、曬煙、白肋煙、香料煙等所有的栽培煙 草。美國北卡羅萊納州每年因煙草黑脛病損失的煙葉約占總產(chǎn)量的 2%，1995年和 1996年兩年間因黑脛病造成的損失就達3610萬美元，占病害總損失的35. 13%，居各病害 之首。該病在我國分布范圍很廣，除黑龍江省尚未發(fā)現(xiàn)之外，其余各植煙省區(qū)(含臺灣省) 均有發(fā)生。平均發(fā)病率為5% 12%，嚴重田塊發(fā)病率高達75%，甚至造成絕收。據(jù)不完全 統(tǒng)計，我國煙草黑脛病平均每年發(fā)病面積高達76373hm2，產(chǎn)量損失2869. 26萬千克，產(chǎn)值損 失超過1. 23億元人民幣。生產(chǎn)實踐表明，防治黑脛病最經(jīng)濟、有效、環(huán)保的措施就是選育抗 病品種，抗性鑒定自然成為抗源挖掘利用、抗病育種、抗性監(jiān)測等工作中重要的一環(huán)?，F(xiàn)有的煙草抗性鑒定方法主要有溫室苗期鑒定接種法和病圃活體菌株人工接種 鑒定法。苗期鑒定法通常采用游動孢子或菌絲體懸浮液浸根接種，病圃活體菌株人工接種 鑒定是目前常用的鑒定方法，缺點是移栽緩苗后接種，時間長，工作量大。我國煙草普遍采用漂浮育苗，漂浮育苗是當前國際上先進的育苗新技術(shù)，具有壯 苗率高、操作簡便、專業(yè)化程度高、省工節(jié)時、方便管理、有利環(huán)境保護等許多優(yōu)點，近年來， 在我省得到了大面積推廣應(yīng)用，因此，在漂浮育苗基礎(chǔ)上，建立煙草黑脛病抗性的漂浮池水 培接種鑒定方法，對抗病種質(zhì)資源篩選、抗性遺傳特性研究和抗病育種具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的步驟，提供一種煙草黑脛病抗性的苗期恒溫水 培鑒定方法，用漂浮池恒溫水培接種鑒定結(jié)果代替?zhèn)鹘y(tǒng)的土壤盆栽和大田鑒定結(jié)果。消除 環(huán)境溫度和濕度對鑒定結(jié)果的影響，避免其他病害對鑒定結(jié)果的干擾，提高鑒定結(jié)果的準 確性，同時可節(jié)省場地和試驗成本、縮短鑒定時間。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)1)池水保溫循環(huán)漂浮池建造在玻璃溫室或塑料大棚溫室內(nèi)建造，池底墊一層厚約4cm的泡沫塑料板，鋪兩層 塑料膜，整個池壁四周用泡沫塑料板保溫，水深5cm 20cm。苗池一端設(shè)控溫電加熱棒(中 山超信電器廠產(chǎn)品)和池水循環(huán)泵(廣東海利集團有限公司產(chǎn)品)?？販仉娂訜岚艉统厮?循環(huán)泵通過控溫裝置聯(lián)動。池水為深井水或自來水。根據(jù)黑脛病適宜發(fā)病溫度和黑脛病區(qū) 土溫，設(shè)置水溫為24. 0°C 32. O0C。2)煙苗移植及日常管理煙苗一次剪葉后，苗齡30d 50d，每個待鑒定材料挑選45株，移植到新的漂浮盤中。以革新三號、G28品種為抗病對照，以紅花大金元品種為感病對照。漂浮池營養(yǎng)液的氮 素濃度控制在100mg/kg 250mg/kg。根據(jù)池水蒸發(fā)量，經(jīng)常補充池水至初始水深。采用自 動溫濕度記錄儀(杭州哈泰克公司產(chǎn)品)每小時記錄一次水溫。3)接種體制備及接種煙草黑脛病菌活化后，接種燕麥液體培養(yǎng)基，在28°C、150rpm的搖床上培養(yǎng)2周， 按質(zhì)量比加0. 硝酸鉀到培養(yǎng)基溶液，混合得到游動孢子懸浮菌液；莖基部創(chuàng)傷接種吸 取游動孢子懸浮菌液注射接種于40d苗齡煙苗的莖基部，每株接種5mL菌液(1000孢子/ mL)，每個品種設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)接種15株。接種后將育苗盤放入28°C恒溫池，及時噴水保持較高濕度，誘發(fā)病害產(chǎn)生。4)病情調(diào)查與分級接種后3d調(diào)查發(fā)病情況，以后每隔2d 3d調(diào)查一次發(fā)病情況。記錄發(fā)病率及病 情指數(shù)。以感病對照發(fā)病率達到70%左右的病情指數(shù)作為品種抗性評價標準。病害嚴重度分級標準按GB/T 23222-2008的規(guī)定。5)抗性評價抗性評價標準按GB/T 23224-2008的規(guī)定。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下的優(yōu)點和有益效果1)在塑料拱棚溫室中均勻提高土壤溫度難度大，恒溫溫室造價高。本發(fā)明通過在 普通漂浮池基礎(chǔ)上，增加簡單的保溫材料、加熱控溫設(shè)備和水循環(huán)泵，以低成本成功解決了 溫度問題。2)采用市售的肥料和自來水配制營養(yǎng)液，與MS營養(yǎng)液和無菌水相比，成本大幅度 降低。3)漂浮池恒溫水培鑒定可在一個月之內(nèi)完成，使得提高煙苗密度、減少水培面積 可行，從而大幅度減少接種菌的數(shù)量。漂浮池恒溫水培鑒定方法的實用性在于發(fā)病迅速，從接種到調(diào)查結(jié)束可在一個 月內(nèi)完成；占地面積小，在幾十平方米的面積上一次可同時鑒定上千株煙苗；結(jié)果重復(fù)性 高，能有效排除土壤溫度差異和其他病害對抗性結(jié)果的干擾，有利于年度間和不同實驗室 間結(jié)果重現(xiàn)和比較；結(jié)果可靠性高，抗感品種的發(fā)病率和病情指數(shù)差異明顯，品種的抗性評 價結(jié)果與他人多年的抗性評價結(jié)果基本一致。該方法在抗病資源和育種中間材料的抗性鑒 定、抗性遺傳規(guī)律研究中應(yīng)用潛力較大。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但它們不是對本發(fā)明的限定。實施例1 一種煙草黑脛病抗性的苗期恒溫水培鑒定方法，在玻璃溫室或塑料大 棚溫室內(nèi)建造保溫加熱漂浮池。池底墊一層厚約4cm的泡沫塑料板，鋪2層塑料膜，整個池 壁四周用泡沫塑料板保溫。苗池一端設(shè)控溫電加熱棒(中山超信電器廠產(chǎn)品)和池水循環(huán) 泵(廣東海利集團有限公司產(chǎn)品)。控溫電加熱棒和池水循環(huán)泵通過控溫裝置聯(lián)動。池水 為深井水或自來水。水深10cm。根據(jù)黑脛病適宜發(fā)病溫度設(shè)置水溫為28°C。煙苗一次剪 葉后，苗齡40d，每個待鑒定材料挑選45株，移植到新的漂浮盤中。以革新三號、G28品種為 抗病對照，以紅花大金元品種為感病對照。漂浮池營養(yǎng)液的氮素濃度控制在150mg/kg。根據(jù)池水蒸發(fā)量，經(jīng)常補充池水至初始水深。采用自動溫濕度記錄儀(杭州哈泰克公司產(chǎn)品) 每小時記錄一次水溫。將保存的黑脛菌菌株使用前在燕麥培養(yǎng)基活化后，接種燕麥液體培 養(yǎng)基28°C 150rpm搖床培養(yǎng)2周，加0. 硝酸鉀溶液。莖基部創(chuàng)傷接種，吸取游動孢子懸 浮液注射接種40d苗齡煙苗的莖基部，每株接種5mL菌液(1000孢子/mL)，每品種設(shè)3個重 復(fù)，每重復(fù)接種15株。接種后將育苗盤放入28°C恒溫池，及時噴水保持較高濕度，誘發(fā)病害 產(chǎn)生。接種后3d調(diào)查發(fā)病情況，以后每隔2d 3d調(diào)查一次發(fā)病情況。記錄發(fā)病率及病情 指數(shù)。以感病對照發(fā)病率達到70%左右的病情指數(shù)作為品種抗性評價標準。病害嚴重度分 級標準應(yīng)符合GB/T 23222-2008的規(guī)定?？剐栽u價標準應(yīng)符合GB/T23224-2008的規(guī)定。實施例2 重復(fù)實施例1，有以下不同點池水溫度設(shè)置為24°C。實施例3 重復(fù)實施例1，有以下不同點池水溫度設(shè)置為32°C。實施例4 重復(fù)實施例1，有以下不同點苗齡50d。實施例5 重復(fù)實施例1，有以下不同點苗齡30d。實施例6 重復(fù)實施例1，有以下不同點非創(chuàng)傷接種。下面為采用本發(fā)明的黑脛病苗期恒溫水培鑒定與苗期盆栽鑒定、大田病圃接種發(fā) 病鑒定結(jié)果的相關(guān)性分析。1材料與方法1. 1供試材料供試煙草材料革新三號、G28、K326、KM10、小黃金1025和紅花大金元，為國內(nèi)外報 道的抗、感黑脛病資源。以革新三號、G28為抗病對照，小黃金1025、紅花大金元為感病對 照。黑脛菌強致病力菌株162#，分離自云南省文山州文山縣。1.2室內(nèi)苗期抗性鑒定1. 2. 1漂浮池恒溫水培接種鑒定池水保溫循環(huán)漂浮池建造方法池底墊一層厚約4cm的泡沫塑料板，鋪2層池膜， 整個池壁四周用泡沫塑料板保溫。苗池一端設(shè)控溫電加熱棒(中山超信電器廠產(chǎn)品)和池 水循環(huán)泵(廣東海利集團有限公司產(chǎn)品)。電加熱棒和池水循環(huán)泵通過控溫裝置聯(lián)動。根 據(jù)黑脛病適宜發(fā)病溫度設(shè)置水溫為28°C。采用自動溫濕度記錄儀(杭州哈泰克公司產(chǎn)品) 每小時記錄一次水溫。煙苗一次剪葉后(苗齡40d)，每個材料挑選45株，移植到新的漂浮 盤中。將保存的黑脛菌菌株使用前在燕麥培養(yǎng)基活化后，接種燕麥液體培養(yǎng)基28°C 150rpm 搖床培養(yǎng)2周，加0. 1 %硝酸鉀溶液。莖基部創(chuàng)傷接種，吸取游動孢子懸浮液注射接種40d 苗齡煙苗的莖基部，每株接種5mL菌液(10000孢子/mL)，每品種設(shè)3個重復(fù)，每重復(fù)接種 15株。接種后將育苗盤放入28°C恒溫池，及時噴水保持較高濕度，誘發(fā)病害產(chǎn)生。接種后 3d調(diào)查發(fā)病情況，以后每隔2d 3d調(diào)查一次發(fā)病情況。記錄發(fā)病率及病情指數(shù)。以感病 對照發(fā)病率達到70%左右的病情指數(shù)作為品種抗性評價標準。1. 2. 2 土壤盆栽傷根接種鑒定在塑料拱棚溫室內(nèi)進行。盆栽苗齡50d煙苗，每材料30株。采用直徑12cm的一 次性黑色塑料花盆，每盆裝紅壤土約500g。移栽成活后，在煙株兩側(cè)將刀刮傷煙苗莖基部， 每株澆灌IX IO4CfuAiL菌懸液20ml。通過溫室通風(fēng)簾控制室內(nèi)白天溫度、傍晚關(guān)閉通風(fēng)簾 保溫。接種后每周觀察一次發(fā)病情況，在感病對照發(fā)病率達到20%左右詳細調(diào)查病情，以感 病對照發(fā)病率達到75%左右的調(diào)查結(jié)果作為品種抗性評價標準。
1.3病圃接種發(fā)病鑒定在煙田黑脛病圃中進行，田間設(shè)計隨機排列，3次重復(fù)，每個小區(qū)種植15株，行株 距為1. 2mX0. 50m ；其它田間栽培管理按當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)進行。1. 4病情調(diào)查與抗性評價病害嚴重度分級標準按照GB/T 23222-2008的規(guī)定。0級全株無病；1級莖部 病斑不超過莖圍得三分之一，或三分之一以下葉片萎焉；3級頸部病斑環(huán)繞莖圍三分之一 至二分之一，或三分之一至二分之一葉片輕度凋萎，或下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑；5級莖部 病斑超過莖圍得二分之一，但未全部環(huán)繞莖圍，獲二分之一至三分之二葉片凋萎；7級莖 部病斑全部環(huán)繞莖圍，或三分之二以上葉片凋萎；9級病株基本枯死?？剐栽u價標準按照GB/T 23224-2008的規(guī)定?？剐栽u價標準高抗或免疫(I)病 情指數(shù)為0 ；抗病(R)病情指數(shù)0. 1 20沖抗(MR)病情指數(shù)20. 1 40沖感(MS)病 情指數(shù)40. 1 60 ；感?、遣∏橹笖?shù)60. 1 80 ；高感(HS)病情指數(shù)80. 1 100。2.結(jié)果與分析2. 1苗期恒溫水培接種黑脛病抗性鑒定方法發(fā)病情況表1不同方法和不同濃度接種對黑脛病病情的影響
權(quán)利要求
1.一種煙草黑脛病抗性的苗期恒溫水培鑒定方法，其特征在于按以下順序步驟1)池水保溫循環(huán)漂浮池建造在玻璃溫室或塑料大棚溫室內(nèi)建造漂浮池，池底墊一層厚約4cm的泡沫塑料板，鋪兩 層塑料膜，池壁四周用泡沫塑料板保溫；池內(nèi)水深5cm 20cm，一端設(shè)控溫電加熱棒和池水 循環(huán)泵，控溫電加熱棒和池水循環(huán)泵通過控溫裝置聯(lián)動，池水為深井水或自來水，控制水溫 為 24. 0°C~ 32. O0C ；2)煙苗移植以革新三號、G28品種為抗病對照，以紅花大金元品種為感病對照，煙苗一次剪葉后，苗 齡30d 50d時，每個待鑒定材料挑選45株，移植到新的漂浮盤中；漂浮池營養(yǎng)液的氮素濃 度控制在100mg/kg 250mg/kg ；根據(jù)池水蒸發(fā)量，經(jīng)常補充池水至初始水深，采用自動溫 濕度記錄儀每小時記錄一次水溫；3)接種體制備及接種煙草黑脛病菌活化后，接種燕麥液體培養(yǎng)基，在28°C、150rpm的搖床上培養(yǎng)2周，按質(zhì) 量比例加0. 硝酸鉀到培養(yǎng)基溶液中，混合得到游動孢子懸浮菌液；吸取游動孢子懸浮 菌液注射接種于40d苗齡煙苗的莖基部，每株接種5mL菌液，1000孢子/mL，每個品種設(shè)3 個重復(fù)，每個重復(fù)接種15株；接種后將育苗盤放入28°C恒溫池，及時噴水保持較高濕度，誘 發(fā)病害產(chǎn)生；4)病情調(diào)查與分級接種后3d調(diào)查發(fā)病情況，以后每隔2d 3d調(diào)查一次發(fā)病情況，記錄發(fā)病率及病情指 數(shù)；以感病對照發(fā)病率，達到70%左右的病情指數(shù)作為品種抗性評價標準，病害嚴重度分 級標準按GB/T 23222-2008的規(guī)定；5)抗性評價抗性評價標準按GB/T 23224-2008的規(guī)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于步驟2)所述的營養(yǎng)液為市售的煙草 漂浮育苗專用肥料配制。
全文摘要
一種煙草黑脛病抗性的苗期恒溫水培鑒定方法，有以下順序步驟池水保溫循環(huán)漂浮池建造、煙苗移植、接種體制備及接種、病情調(diào)查與分級和抗性評價；本發(fā)明具有發(fā)病迅速、結(jié)果重復(fù)性好、可靠、無其他病害干擾等特點，實現(xiàn)了用苗期鑒定結(jié)果代替?zhèn)鹘y(tǒng)大田鑒定結(jié)果，實現(xiàn)了在較小面積上鑒定大量材料、一年多次鑒定，提高了結(jié)果的可靠性、縮短了鑒定周期、節(jié)省鑒定成本。
文檔編號C12R1/645GK101999287SQ201010280169
公開日2011年4月6日 申請日期2010年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月14日
發(fā)明者冷曉東, 劉勇, 盧秀萍, 李梅云, 李永平, 李祥, 肖炳光 申請人:云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院