專利名稱：大豆銹菌分子探針及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大豆銹菌分子探針及其制備方法，以及大豆銹菌分子探針的應 用，屬真菌分子生物學領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由豆屬層銹菌[擔子菌綱(Basidomycetes)銹菌目(Urediales)柵銹科 (Malampsoraceae)層繡屬(Phakopsora)大豆繡菌禾中(Phakopsora pachyrhizi Sydow)]弓| 起的大豆銹病曾經(jīng)是熱帶及亞熱帶地區(qū)大豆生產(chǎn)的主要病害，進入21世紀以來，大豆銹病 相繼在非洲、美洲大面積流行，每年造成數(shù)十萬噸的產(chǎn)量損失，在我國，大豆銹病是繼孢囊 線蟲、大豆花葉病毒病之后的第三大病害。對大豆銹病的控制主要是通過化學防治，化學防 治的前提是能夠準確地預報病情的發(fā)展。目前，對大豆銹病的測報主要是通過觀察植株的 發(fā)病癥狀以及病原菌的生理生化鑒定等常規(guī)病理學研究方法做出判斷，大豆銹菌在侵染大 豆后約1周后才出現(xiàn)侵染病斑，2周后孢子堆破裂才表現(xiàn)出典型的銹菌侵染特征。已有研 究表明大豆銹病主要通過孢子的擴散進行傳播，每個孢子經(jīng)過7-10天的繁殖可產(chǎn)生數(shù)以 千記的孢子。因此在發(fā)病早期對病原做出準確地鑒定，有利于減少病原數(shù)量，降低農(nóng)藥使用 量，有效控制病情的發(fā)展。分子生物學的研究結(jié)果表明生物的多樣性源于它們遺傳物質(zhì)一一核酸序列的 不同，每個物種均有自身特異的遺傳基因即核酸排列順序。根據(jù)每個物種特異的核酸序列 設(shè)計引物，通過鏈式聚合反應(PCR) (Gibbs 1990 ；MyLlis et al. 1986)將特異核酸序列在 短時間內(nèi)進行數(shù)百萬倍的擴增，擴增產(chǎn)物可直觀地通過瓊脂糖電泳顯示出來?；赑CR的 分子探針檢測方法最大優(yōu)點在于快速、靈敏，已廣泛用于醫(yī)療、食品、農(nóng)業(yè)中微生物的快速 檢測。2002年，美國科學家根據(jù)真菌的轉(zhuǎn)錄體間隔區(qū)ITS區(qū)域的序列開發(fā)出大豆銹菌分子 探針引物，能有效地區(qū)分大豆銹菌和細菌性葉斑病，但在早期檢測方面，早期開發(fā)的探針需 接種量為IO5孢子/mL在接種后第6天才能檢測到，而通常在這樣的接種強度下，被侵染葉 片已出現(xiàn)明顯的侵染病斑。參考文獻1)Gibbs, R. A. 1990, DNA amplification by the polymerase chain reaction. Analytical Chemistry 62,1202-1214。2) Reid D. Frederick, Christine L. Snyder, Gary L. Peterson, and Morris R.Bonde Polymerase Chain Reaction Assays for the Detection and Discrimination of the Soybean Rust Pathogens Phakopsora pachyrhizi and P. meibomiae, Mycology. Vol. 92，No.2,2002 217。3)Kurt H. Lamour, Ledare Finley, Karen L. Snover-Clift, James P. Stack, Joy Pierzynski, Ray Hammerschmidt, Janette L. Jacobs, Janet M. Byrne, Philip F. Harmon Anne M. Vitoreli,Gail C. ffisler,Carrie L. Harmon, Laurene Levy and Kurt A. Zeller, Christine L. Stone, Douglas G. Luster, Reid D. Frederick,2006, Early Detection of
4Asian Soybean Rust Using PCR, Plant Management Network。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種大豆銹菌分子探針及其制備方法，以及大豆銹菌分子 探針的應用，該探針可快速、準確的鑒定大豆銹菌。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是大豆銹菌分子探針，其特征在 于該探針是上游引物和下游引物進行PCR擴增后形成，上游引物、下游引物序列如下上游引物5，GTTATCAGCAAGCAGTACAA-3，下游引物5，GGGCCAATCTCTTGTTTGAA-3，；該探針的序列是由大豆銹菌基因組中一段序列編碼而成，該片段長度為447bp，核 酸序列如下caatatgccatcagcaagcagtacaaagggcgctccacaccaatctctttgtaaactgtt60
ttaagagatttgagggaaacagaagcaacactagattttgcatttttaccttttcctatt120
gaacttggtgttgaagtggtgtcttgactttttctatgggcttgaaccatatttaatgct180
atgagtacgtgaatgattctgtcaagaaattcatcaagatttttgaaagtatccatggca240
gagtttttctgggtattttcatttccttcaacgccctctatagatagtattgatttttga300
ttcttgttgaaagaaaagcaagatgccaaaaatcctgctaaagcacattcaatagataaa360
ggattttctgaagtaactttttctggcctaaattgaactggagctataatatccctggct420actaaattca gtgattcaaa caagaga447。上述大豆銹菌分子探針的制備方法，其特征在于它包括如下步驟1).根據(jù)已公布的大豆銹菌基因組序列信息，在大豆銹菌基因組JGIAFNA-61H15 Phakopsora pachyrhizi克隆選取447個堿基構(gòu)成的基因組片段，通過在Genebank上進行 序列比對，未發(fā)現(xiàn)與之同源的片段，由此推斷其為大豆銹菌特異片段，其序列信息如下caatatgccatcagcaagcagtacaaagggcgctccacaccaatctctttgtaaactgtt60
ttaagagatttgagggaaacagaagcaacactagattttgcatttttaccttttcctatt120
gaacttggtgttgaagtggtgtcttgactttttctatgggcttgaaccatatttaatgct180
atgagtacgtgaatgattctgtcaagaaattcatcaagatttttgaaagtatccatggca240
gagtttttctgggtattttcatttccttcaacgccctctatagatagtattgatttttga300
ttcttgttgaaagaaaagcaagatgccaaaaatcctgctaaagcacattcaatagataaa360
ggattttctgaagtaactttttctggcctaaattgaactggagctataatatccctggct420
actaaattcagtgattcaaa (^aagaga4472).根據(jù)上述序列信息設(shè)計PCR擴增引物，上游引物、下游引物序列如下上游引物5，GTTATCAGCAAGCAGTACAA-3，下游引物5，GGGCCAATCTCTTGTTTGAA-3，；對上游引物和下游引物進行PCR擴增后，得到大豆銹菌分子探針。上述大豆銹菌分子探針的應用，其特征在于大豆銹菌分子探針應用于大豆銹菌分 子檢測，具體步驟如下1)大豆銹菌基因組DNA提取大豆銹病的病原菌為擔子菌綱(basidomycetes) 銹菌目(Urediales)柵銹科(Malampsoraceae)層銹屬(Phakopsora)大豆銹菌種(Phakopsora pachyrhizi Sydow)，其基因組DNA提取方法如下從田間采集大豆銹病葉片， 用毛筆將孢子刷下，將20至100 μ L孢子收集入直徑6CM的研缽中，DNA提取系統(tǒng)采用天根 植物DNA提取試劑盒DP321-02，得到大豆銹菌基因組DNA提取液(每20 μ L銹菌孢子可制 得20 μ L大豆銹菌基因組DNA提取液)，歷時約1. 5小時；2)以大豆銹菌基因組為模板，用PCR方法對銹菌特異進行擴增，反應體系25 μ L， 反應體系中各組分為大豆銹菌基因組DNA提取液1 μ L，lOpmol/μ L上游引物、lOpmol/μ L 下游引物各 1 μ L，25mM MgCl2 2. 5 μ L, IOXTaq buffer 2. 5 μ L, lOmM/LdNTP 0. 5μ L,5U/ μ L taqg|0. 3yL,力口水 16. 7 μ L ；清水做為陰性對照，反應體系中各組分為清水lyL，10pmOl/yL上游引物、 lOpmol/μ L 下游引物各 1 μ L，25mM MgCl2 2. 5 μ L, IOXTaq buffer 2. 5 μ L, lOmM/LdNTP 0. 5μ L, 5U/ μ L taqg|0. 3yL,力口水 16. 7 μ L ；3) PCR 擴增條件為95°C預變性 3min，然后 94°C 30s，55°C 45s，72°C lmin，共 30 個 循環(huán)，72°C延伸lOmin，歷時約3小時，得到PCR產(chǎn)物；4) PCR產(chǎn)物于瓊脂糖膠進行電泳，瓊脂糖膠在凝膠成像系統(tǒng)上進行觀察，有 大豆銹菌存在的樣品中，可見在350-500bp處有一特征帶(大豆銹菌DNA提取液的PCR產(chǎn) 物電泳后可見在350-500bp處有一特征帶)，沒有大豆銹菌存在的樣品中，則無特征帶出現(xiàn) (清水中因不含銹菌，無特征帶出現(xiàn))。本發(fā)明與常規(guī)植物病理學檢測方法、已有的分子探針相比具有如下優(yōu)點1)準確性高本發(fā)明所述的大豆銹菌分子探針選取核酸片段為大豆銹菌特有，至 今尚未在genebank上找到與之同源的序列片段，不必擔心與其他豆科銹菌發(fā)生混淆。而常 規(guī)病理學檢測需要通過形態(tài)和侵染特征區(qū)分不同銹菌，容易發(fā)生判斷錯誤。2)操作簡單本發(fā)明工藝簡單，每個樣品只需采集50_100mg即可滿足3次以上的 PCR鑒定，DNA提取已有商業(yè)化的試劑盒，PCR產(chǎn)物觀察直觀，操作人員稍加培訓即可掌握。 常規(guī)病理學檢測要求操作人員具有較強的專業(yè)知識，需要通過對菌源的培養(yǎng)、生理生化等 多項鑒定才能做出判斷。3)周期短分子檢測從樣品DNA提取到獲得結(jié)果僅需5_8個小時，而常規(guī)病理學 鑒定完成一個病原的鑒定往往需要幾天甚至幾周的時間。4)檢測潛伏侵染PCR檢測所用的樣品不需要有明顯的發(fā)病特征，即可檢測到侵 入寄主體內(nèi)的病原DNA，鑒定時間比常規(guī)病理學鑒定提前5-10天。5)與已有分子探針相比源序列來源于基因組DNA高度特異的序列，有極高的 靈敏度，可檢測的靈敏度為10孢子/mL，在單個孢子接種后第3天即可檢測到銹菌的特異 DNA。本發(fā)明的有益效果是1)準確性高大豆銹菌分子探針大豆銹菌基因組中高度特異的片段，只有來自大 豆銹菌的DNA才能和引物結(jié)合形成特異的PCR產(chǎn)物，分子探針的應用使銹菌鑒定更具有準 確性。2)靈敏度高PCR反應體系的檢測靈敏度為IOpgDNA模板，相當于幾個孢子的DNA 數(shù)量。在進行檢測鑒定時不需要大量取樣，通常每個樣品僅需采集50-100mg即可滿足3次 以上PCR反應的模板需要。單個孢子接種后第3天即可檢測銹菌的DNA。
3)對取樣沒有嚴格限制分子檢測的基礎(chǔ)是生物體內(nèi)核酸序列，同一物種的核酸 序列高度穩(wěn)定，不因環(huán)境條件和發(fā)育階段的不同而改變，因此，分子檢測取樣時，只要保持 樣品低溫、干燥，即可獲得很好的結(jié)果，樣品DNA提取后，可保存數(shù)月甚至數(shù)年之久，鑒定結(jié) 果重復性好。常規(guī)病理學鑒定在取樣則需考慮病原的發(fā)育階段、病原的培養(yǎng)條件，大豆銹菌 是專性寄生菌，不能用人工培養(yǎng)，鑒定結(jié)果受環(huán)境因素限制很大。4)不必擔心病原交叉感染田間、野外采集的樣品常常受到不止一種病原的侵 染，由于分子探針的高度特異性，即使樣品DNA中混有其他病原的DNA，其也不會與引物結(jié) 合形成特異的PCR產(chǎn)物。此外，分子檢測對樣品DNA的質(zhì)量要求不高，當前通用的DNA提取 方法均可滿足PCR檢測的需要；而常規(guī)病理學鑒定時則要求樣品盡可能純，如有其他病原 混雜，則會給病原鑒定增加很多難度。5)早期診斷分子探針可在銹菌侵染初期作出診斷，此時寄主還沒有顯示出任 何發(fā)病癥兆，常規(guī)病理診斷則等到寄主出現(xiàn)典型的發(fā)病特征，鑒定結(jié)果比分子診斷晚5-10 天。而早期診斷能夠做到早期防治，減少損失。本發(fā)明利用已知的大豆銹菌基因組序列信息，重新設(shè)計的高度特異的探針。新探 針序列高度特異，至今未發(fā)現(xiàn)與之同源的序列，能有效地區(qū)別大豆銹菌與其他病原，此外， 新的探針還具高靈敏度，可檢測出10孢子/mL，單孢接種后第3天即可檢測銹菌的存在，可 以滿足大豆銹菌早期診斷的需要。


圖1是本發(fā)明大豆銹菌分子探針特異性檢測圖。圖2是本發(fā)明大豆銹菌分子探針靈敏度的檢測圖，1-4道1孢子/mL，5、6、7分別 為1000、100、10孢子/mL時的檢測結(jié)果，8道為清水。圖3是本發(fā)明大豆銹菌的早期診斷分子探針電泳結(jié)果圖A1.接種1天后；2.接種 2天后；3.接種3天后；4.接種4天后；5.接種5天后；6.接種7天后，B.接種3天后的葉 片，無病斑。圖4是本發(fā)明大豆銹菌分子探針序列圖。
具體實施例方式為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的 內(nèi)容不僅僅局限于下面的實施例。大豆銹菌分子探針，該探針是上游引物和下游引物進行PCR擴增后形成，上游引 物、下游引物序列如下上游引物5，GTTATCAGCAAGCAGTACAA-3，下游引物5，GGGCCAATCTCTTGTTTGAA-3，；該探針的序列是由大豆銹菌基因組中一段序列編碼而成，該片段長度為447bp，核 酸序列如下caatatgcca tcagcaagca gtacaaaggg cgctccacac caatctcttt gtaaactgtt 60ttaagagatt tgagggaaac agaagcaaca ctagattttg catttttacc ttttcctatt 120gaacttggtg ttgaagtggt gtcttgactt tttctatggg cttgaaccat atttaatgct 180
7
atgagtacgt gaatgattct gtcaagaaat tcatcaagat ttttgaaagt atccatggca 240gagtttttct gggtattttc atttccttca acgccctcta tagatagtat tgatttttga 300ttcttgttga aagaaaagca agatgccaaa aatcctgcta aagcacattc aatagataaa 360ggattttctg aagtaacttt ttctggccta aattgaactg gagctataat atccctggct 420actaaattca gtgattcaaa caagaga447。大豆銹菌分子探針序列見圖4。上述大豆銹菌分子探針的制備方法，它包括如下步驟1).根據(jù)已公布的大豆銹菌基因組序列信息，在大豆銹菌基因組JGIAFNA-61H15 Phakopsora pachyrhizi克隆選取447個堿基構(gòu)成的基因組片段，通過在Genebank上進行 序列比對，未發(fā)現(xiàn)與之同源的片段，由此推斷其為大豆銹菌特異片段，其序列信息如下caatatgccatcagcaagcagtacaaagggcgctccacaccaatctctttgtaaactgtt60
ttaagagatttgagggaaacagaagcaacactagattttgcatttttaccttttcctatt120
gaacttggtgttgaagtggtgtcttgactttttctatgggcttgaaccatatttaatgct180
atgagtacgtgaatgattctgtcaagaaattcatcaagatttttgaaagtatccatggca240
gagtttttctgggtattttcatttccttcaacgccctctatagatagtattgatttttga300
ttcttgttgaaagaaaagcaagatgccaaaaatcctgctaaagcacattcaatagataaa360
ggattttctgaagtaactttttctggcctaaattgaactggagctataatatccctggct420
actaaattcagtgattcaaa (^aagaga447 ；2).根據(jù)上述序列信息設(shè)計PCR擴增引物，上游引物、下游引物序列如下上游引物5，GTTATCAGCAAGCAGTACAA-3，下游引物5，GGGCCAATCTCTTGTTTGAA-3，；對上游引物和下游引物進行PCR擴增后，得到大豆銹菌分子探針。應用實施例1 大豆銹菌分子探針特異性的檢測1)從田間采集大豆銹病、花生銹菌、花生葉斑病、大豆細菌性葉斑病、大豆花葉病 毒病的感染葉片，未感染健康葉片為陰性對照，每個樣本取帶病斑的葉片lOOmg，在直徑為 6CM的研缽中徹底研磨2-5分鐘，DNA提取系統(tǒng)采用天根植物DNA提取試劑盒DP321-02，得 到樣品基因組DNA提取液(每IOOmg葉片可制得20 μ L基因組DNA提取液)，歷時約1. 5小 時；2)以各樣品DNA為模板，用大豆銹菌分子探針的引物進行PCR擴增反應，用PCR方 法對銹菌特異進行擴增，反應體系25 μ L，反應體系中各組分為大豆銹菌感染葉片基因組 DNA 提取液 1 μ L，lOpmol/μ L 上游引物、lOpmol/μ L 下游引物各 1 μ L,25mM MgCl2 2. 5 μ L， IOXTaq buffer 2. 5 μ L, lOmM/LdNTP 0. 5μ L,5U/y L taq 酶 0. 3 μ L，力口水 16. 7 μ L ；花 生銹菌感染葉片基因組DNA提取液1 μ L，IOpmol/μ L上游引物、IOpmol/ μ L下游引物 各 lyL，25mM MgCl2 2. 5 μ L, IOXTaq buffer 2. 5 μ L, 10mM/LdNTP, 5U/μ L 0. 5 μ L taq 酶0. 3 μ L，加水16. 7 μ L ；花生葉斑病感染葉片基因組DNA提取液1 μ L，IOpmol/ μ L上游 引物、lOpmol/μ L 下游引物各 1 μ L，25mM MgCl2 2. 5 μ L, IOXTaq buffer 2. 5 μ L, IOmM/ LdNTP 0. 5μ L,5U/y L taq酶0. 3 μ L，加水16. 7 μ L ；大豆細菌性葉斑病感染葉片基因組 DNA 提取液 1 μ L，lOpmol/μ L 上游引物、lOpmol/μ L 下游引物各 1 μ L,25mM MgCl2 2. 5 μ L，IOXTaq buffer 2. 5 μ L, 10mM/LdNTP 0. 5μ L,5U/y L taq 酶 O. 3 μ L，加水 16. 7 μ L ；大豆 花葉病毒感染葉片基因組DNA提取液1 μ L，10pmol/yL上游引物、IOpmol/μ L下游引物 各 lyL，25mM MgCl2 2. 5 μ L, IOXTaq buffer 2. 5 μ L, 10mM/LdNTP 0. 5μ L,5U/y L taq 酶0. 3 μ L，加水16. 7 μ L ；以未感病健康葉片DNA為陰性對照，未感病健康葉片基因組DNA 提取液 lyL，10pmol/yL 上游引物、10pmol/yL 下游引物各 lyL,25mM MgCl2 2. 5μ L, 10 X Taq buffer 2. 5 μ L, 10mM/LdNTP 0. 5 μ L, 5U/ μ L taq 酶 0· 3 μ L，加水 16. 7 μ L ；3) PCR 擴增條件為95°C預變性 3min，然后 94°C 30s，55°C 45s，72°C lmin，共 30 個 循環(huán)，72°C延伸lOmin，歷時約3小時，得到PCR產(chǎn)物；4)PCR產(chǎn)物于瓊脂糖膠進行電泳，瓊脂糖膠在凝膠成像系統(tǒng)上進行觀察，電 泳結(jié)果顯示僅大豆銹病病葉的DNA提取液中可擴增出特異性條帶，而其他樣品以及未感病 健康葉片的DNA提取液中均無該條帶出現(xiàn)，表明大豆銹菌分子探針具有高度特異性(圖1)。 本實驗重復三次，銹菌檢測準確率達到100%。圖1說明圖1為電泳圖譜，自左向右檢測樣品順序為DNA分子量標記，大豆健康 葉片DNA、大豆病毒病葉片DNA、大豆葉斑病葉片DNA、花葉銹病葉片DNA、花生葉斑病葉片 DNA和大豆銹病葉片DNA，大豆銹菌分子探針僅在大豆銹病葉片DNA中能擴增出約450bp的 特異片段，在其他樣品中沒有擴增出相應的特異片段，表明大豆銹菌分子探針具有高度的 特異性。應用實施例2 大豆銹菌分子探針靈敏度的檢測1)將大豆銹菌制成IO5孢子/mL的孢子懸浮液，取ImL孢子懸浮液，12000rpm離 心2分鐘，去上清液，銹菌孢子沉于離心管底部，采用植物基因組DNA試劑盒提取銹菌孢子 基因組DNA提取液20 μ L，將總DNA分別稀釋至10、100、1000、10000、100000倍，相當于每 mL 含 10000、1000、100、10 和 1 孢子 /mL ；2)分別以各稀釋度DNA提取液為模板，用大豆銹菌分子探針的引物進行PCR擴增 反應，清水做為陰性對照，反應體系25 μ L，反應體系中各組分為大豆銹菌基因組DNA提 取液 10 倍稀釋液 1 μ L，IOpmol/μ L 上、IOpmol/μ L 下游引物各 lyL,25mM MgCl22. 5 μ L， IOXTaq buffer 2. 5 μ L, lOmM/LdNTP 0. 5μ L,5U/y L taq 酶 0· 3 μ L，加水 16. 7 μ L ；大豆 銹菌基因組DNA提取液100倍稀釋液1 μ L，IOpmol/μ L上、IOpmol/μ L下游引物各1 μ L， 25mM MgCl22. 5 μ L, IOXTaq buffer 2. 5 μ L, 10mM/LdNTP 0· 5 μ L，5U/ μ L taq 酶 0· 3 μ L，加 水16. 7μ L ；大豆銹菌基因組DNA提取液1000倍稀釋液1 μ L，IOpmol/μ L上、IOpmol/μ L 下游引物各 1 μ L，25mM MgCl22. 5 μ L，10 X Taq buffer 2. 5 μ L, lOmM/LdNTP 0. 5μ L,5U/y L taq酶0.3 μ L，加水16. 7 μ L ；大豆銹菌基因組DNA提取液10000倍稀釋液1 μ L，IOpmol/ 口1^上、10口11101/^1^下游引物各1口1^251111 MgCl2 2. 5 μ L, IOXTaq buffer 2. 5 μ L, IOmM/ LdNTP 0. 5μ L,5U/y L taq 酶 0. 3 μ L，加水 16. 7 μ L ；大豆銹菌基因組 DNA 提取液 100000 倍稀釋液 1 μ L, IOpmol/ μ L Jl、10pmol/ μ L 下游引物各 1 μ L, 25mM MgCl2 2. 5 μ L，10 X Taq buffer 2. 5 μ L, lOmM/LdNTP 0. 5μ L,5U/y L taq 酶 0. 3 μ L，加水 16. 7 μ L ；清水為陰性對 照，清水 1 μ L，IOpmol/μ L 上、IOpmol/μ L 下游引物各 lyL,25mM MgCl2 2. 5 μ L, IOXTaq buffer 2· 5 μ L，10mM/LdNTP 0. 5 μ L, 5U/ μ L taq 酶 0· 3 μ L，加水 16. 7 μ L ；3) PCR 擴增條件為95°C預變性 3min，然后 94°C 30s，55°C 45s，72°C lmin，共 30 個 循環(huán)，72 °C延伸IOmin ；
4)PCR產(chǎn)物于瓊脂糖膠進行電泳，瓊脂糖膠在凝膠成像系統(tǒng)上進行觀察，電 泳結(jié)果顯示當IO5孢子/ml銹菌基因組DNA提取液稀釋度為100、1000、1000時，均可擴增 出350-500bp的銹菌特異性條帶，稀釋度為IO5時，則擴增條帶不穩(wěn)定，由此推斷大豆銹菌 分子探針可檢測的靈敏度為10孢子/mL (圖2)，清水中不含銹菌，沒有特征帶出現(xiàn)。本實驗 重復三次，準確率為100%。圖2說明圖2為電泳圖譜，自左向右檢測樣品順序為DNA分子量標記、1、2、3、4 泳道為單個孢子DNA ；5泳道為1000個孢子/ml的DNA量；6泳道為100個孢子/ml的DNA 量；7泳道為10個孢子/ml的DNA量；8泳道為清水空白對照。采用大豆銹菌分子探針可以 在5、6、7泳道中均能擴增出450bp左右的特異片段，在清水中沒有特異片段出現(xiàn)，在檢測單 個孢子DNA時亦沒擴增出特異片段，表明大豆銹菌分子探針的靈敏度可以達到10個孢子/ ml,尚不能檢測到單個孢子的存在。應用實施例3 大豆銹病的早期診斷1)菌孢子制成IO3AiL懸浮液，接種于健康大豆葉片上，每個葉片接種1 μ L，即1個 孢子，未接種葉片對陰性對照。接種后，每天提取葉片DNA提取液，DNA提取采用天根植物 DNA提取試劑盒DP321-02，得到大豆葉片基因組DNA提取液(每IOOmg葉片可制得20 μ L大 豆葉片基因組DNA提取液)，歷時約1. 5小時；2) DNA為模板，用大豆葉片基因組DNA提取液 進行PCR擴增反應，反應體系25 μ L，反應體系中各組分為接種大豆銹菌的大豆葉片基因 組0嫩提取液1“1^，1(^11101/^1^上、下游引物各1“1^，251111 MgCl2 2. 5 μ L, IOXTaq buffer 2. 5 μ L，lOmM/LdNTP 0. 5 μ L, 5U/ μ L taq 酶 0· 3 μ L，加水 16. 7 μ L,以未接種健康葉片 DNA 提取液為陰性對照，反應體系中各組分為未接種大豆銹菌的大豆葉片基因組DNA提取 液 1 μ L，lOpmol/μ L 上、下游引物各 1 μ L，25mM MgCl2 2. 5 μ L, IOXTaq buffer 2. 5 μ L, lOmM/LdNTP 0. 5 μ L, 5U/ μ L taq 酶 0· 3 μ L，加水 16. 7 μ L ；3)PCR擴增條件為95°C預變性 3min，然后 94°C 30s，55°C 45s，72°C lmin，共 30 個 循環(huán)，72 °C延伸IOmin ；4)PCR產(chǎn)物于瓊脂糖膠進行電泳，瓊脂糖膠在凝膠成像系統(tǒng)上進行觀察，電 泳結(jié)果顯示從接種后第3天起，從葉片總DNA中均能擴出大豆銹菌特異條帶，而此時葉表 面沒有任何發(fā)病癥狀，接種葉片在第10天后才顯出侵染病斑。由此推斷大豆銹菌分子探 針可在單孢接種后第3天檢測到銹孢子的存在。大豆銹菌分子探針能在被侵染葉片沒有表 現(xiàn)任何發(fā)病癥狀時做出早期診斷(圖3)。本實驗重復三次，準確率為100%。圖3說明圖3的A為電泳圖譜，自左向右檢測樣品順序為DNA分子量標記，1泳 道為單孢接種后1天葉片DNA檢測結(jié)果；2泳道為單孢接種后2天葉片DNA檢測結(jié)果；3泳 道為單孢接種后3天葉片DNA檢測結(jié)果；4泳道為單孢接種后4天葉片DNA檢測結(jié)果；5泳 道為單孢接種后5天葉片DNA檢測結(jié)果；6泳道為單孢接種后6天葉片DNA檢測結(jié)果，大豆 銹菌分子探針在接種后第3天即可從接種的葉片DNA中擴增出大豆銹菌的特異片段。圖B 大豆葉片接種后第三天，葉片上未顯示任何可見病癥。圖3結(jié)果表明大豆銹菌分子探針可 以用于銹菌的早期診斷。
10
權(quán)利要求
大豆銹菌分子探針，其特征在于該探針是上游引物和下游引物進行PCR擴增后形成，上游引物、下游引物序列如下上游引物5’GTTATCAGCAAGCAGTACAA 3’下游引物5’GGGCCAATCTCTTGTTTGAA 3’；該探針的序列是由大豆銹菌基因組中一段序列編碼而成，該片段長度為447bp，核酸序列如下caatatgcca tcagcaagca gtacaaaggg cgctccacac caatctcttt gtaaactgtt 60ttaagagatt tgagggaaac agaagcaaca ctagattttg catttttacc ttttcctatt120gaacttggtg ttgaagtggt gtcttgactt tttctatggg cttgaaccat atttaatgct180atgagtacgt gaatgattct gtcaagaaat tcatcaagat ttttgaaagt atccatggca240gagtttttct gggtattttc atttccttca acgccctcta tagatagtat tgatttttga300ttcttgttga aagaaaagca agatgccaaa aatcctgcta aagcacattc aatagataaa360ggattttctg aagtaacttt ttctggccta aattgaactg gagctataat atccctggct420actaaattca gtgattcaaa caagaga447。
2.如權(quán)利要求1所述大豆銹菌分子探針的制備方法，其特征在于它包括如下步驟 1).根據(jù)已公布的大豆銹菌基因組序列信息，在大豆銹菌基因組JGIAFNA-61H15 Phakopsora pachyrhizi克隆選取447個堿基構(gòu)成的基因組片段，通過在Genebank上進行 序列比對，未發(fā)現(xiàn)與之同源的片段，由此推斷其為大豆銹菌特異片段，其序列信息如下caatatgccatcagcaagcagtacaaagggcgctccacaccaatctctttgtaaactgtt60ttaagagatttgagggaaacagaagcaacactagattttgcatttttaccttttcctatt120gaacttggtgttgaagtggtgtcttgactttttctatgggcttgaaccatatttaatgct180atgagtacgtgaatgattctgtcaagaaattcatcaagatttttgaaagtatccatggca240gagtttttctgggtattttcatttccttcaacgccctctatagatagtattgatttttga300ttcttgttgaaagaaaagcaagatgccaaaaatcctgctaaagcacattcaatagataaa360ggattttctgaagtaactttttctggcctaaattgaactggagctataatatccctggct420actaaattcagtgattcaaacaagaga4472).根據(jù)上述序列信息設(shè)計PCR擴增引物，上游引物、下游引物序列如下 上游引物5’ GTTATCAGCAAGCAGTACAA-3’ 下游引物5，GGGCCAATCTCTTGTTTGAA-3，； 對上游引物和下游引物進行PCR擴增后，得到大豆銹菌分子探針。
3.如權(quán)利要求1所述大豆銹菌分子探針的應用，其特征在于大豆銹菌分子探針應用于 大豆銹菌分子檢測，具體步驟如下1)大豆銹菌基因組DNA提取大豆銹病的病原菌為擔子菌綱(basidomycetes)銹菌 目(Urediales)柵銹禾斗(Malampsoraceae)層銹屬(Phakopsora)大豆銹菌種(Phakopsora pachyrhizi Sydow)，其基因組DNA提取方法如下從田間采集大豆銹病葉片，用毛筆將孢 子刷下，將20至100 μ L孢子收集入直徑6CM的研缽中，DNA提取系統(tǒng)采用天根植物DNA提 取試劑盒DP321-02，得到大豆銹菌基因組DNA提取液；2)以大豆銹菌基因組為模板，用PCR方法對銹菌特異進行擴增，反應體系25μ L，反應 體系中各組分為大豆銹菌基因組DNA提取液1 μ L，10pmol/yL上游引物、IOpmol/μ L下游引物各 lyL，25mM MgCl2 2. 5 μ L, IOXTaq buffer 2. 5 μ L, 10mM/LdNTP 0. 5μ L,5U/y L taq 酶 0. 3yL，加水 16. 7yL;3)PCR 擴增條件為95°C預變性 3min，然后 94°C 30s, 55°C 45s, 72°C lmin，共 30 個循 環(huán)，72°C延伸lOmin，歷時約3小時，得到PCR產(chǎn)物；4)PCR產(chǎn)物于瓊脂糖膠進行電泳，瓊脂糖膠在凝膠成像系統(tǒng)上進行觀察，有大豆 銹菌存在的樣品中，可見在350-500bp處有一特征帶，沒有大豆銹菌存在的樣品中，則無特 征帶出現(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大豆銹菌分子探針及其制備方法，以及大豆銹菌分子探針的應用。大豆銹菌分子探針，其特征在于該探針是上游引物和下游引物進行PCR擴增后形成，該探針的序列是由大豆銹菌基因組中一段序列編碼而成，該片段長度為447bp。其制備步驟如下1)根據(jù)已公布的大豆銹菌基因組序列信息，在大豆銹菌基因組JGIAFNA-61H15Phakopsora pachyrhizi克隆選取447個堿基構(gòu)成的基因組片段；2)根據(jù)上述序列信息設(shè)計PCR擴增引物，上、下游引物序列如下上游引物5’GTTATCAGCAAGCAGTACAA-3’，下游引物5’GGGCCAATCTCTTGTTTGAA-3’。本發(fā)明具有準確性高、靈敏度高，對取樣沒有嚴格限制，不必擔心病原交叉感染，早期診斷的特點。
文檔編號C12N15/11GK101955932SQ20101028137
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者單志慧, 周新安, 孫佃臣, 沙愛華, 田星星, 郝青南, 陳李淼, 陳海峰 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所