專利名稱：野蠶抗病毒蛋白sp-2的大量表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)、蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化，尤其涉及一種家蠶生產(chǎn)重組野 蠶抗病毒蛋白SP-2的方法。
背景技術(shù)：
野蠶是我國珍貴的野生資源，一直處于日曬雨淋、天敵侵害、農(nóng)藥污染和多種微生 物病原等的威脅，但仍以其強(qiáng)大的生命力在野外生存著，經(jīng)歷了嚴(yán)酷的自然環(huán)境的淘汰和 篩選，具有很強(qiáng)的抗逆性和環(huán)境適應(yīng)性。因此，發(fā)掘野蠶的優(yōu)良性狀及其相關(guān)基因?qū)τ诟?地利用家蠶無疑會有重要參考價(jià)值。近年科學(xué)家從中國野蠶中發(fā)現(xiàn)了具有較強(qiáng)抗家蠶核型 多角體病毒BmNPV活性的蛋白質(zhì)，名稱為絲氨酸蛋白酶，簡寫為SP-2。該基因大小855bp， 編碼284個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量29. 6kDa，在國際核酸序列庫GenBank中的登錄號為 AY945210。我國是養(yǎng)蠶大國，在實(shí)際生產(chǎn)中蠶病的威脅非常嚴(yán)重，特別是核型多角體病毒 BmNPV引發(fā)的病害尤其嚴(yán)重。因此，利用野蠶的抗病毒蛋白，可以預(yù)防和減少家蠶BmNPV病 毒病的發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種野蠶抗病毒蛋白SP-2的大量表達(dá)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明利用基因工程表達(dá)技術(shù)，構(gòu)建含有野蠶抗病毒蛋白SP-2 基因的重組基因工程病毒，并利用家蠶作為宿主，大量表達(dá)具有生物活性的重組野蠶抗病 毒蛋白SP-2。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案具體如下本發(fā)明野蠶抗病毒蛋白SP-2的大量表達(dá)方法的步驟如下(1)按以下方法進(jìn)行野蠶抗病毒蛋白SP-2基因的克隆解剖5齡野蠶的中腸后部組織，用Trizol法抽提總RNA，根據(jù)家蠶Bm SP_2基因 序列，設(shè)計(jì)一對引物，其中，上游引物的序列為5' -atgaaggtcttcgcagcagtac-3 ‘，下游引 物的序列為5' -attcgccagtcgtcatttaaattc-3‘；取2 μ 1 RNA為模板，用禽白血病病毒反 轉(zhuǎn)錄酶AMV第一鏈cDNA合成試劑盒合成第一鏈cDNA ；接著進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)體 系的總體積為20 μ 1，其中，模板0. 5 μ g、上游引物和下游引物各6pmol、DNA聚合酶1. 25U、 dNTP 5umol、PCR Buffer 2. 5 μ 1，所述PCR反應(yīng)按以下條件進(jìn)行94°C，3min;94°C，50s，55°C，30s，72°C，lmin，反應(yīng) 30 個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸 IOmin ；PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳后，切下相應(yīng)的DNA條帶，試劑盒回收，將上 述DNA條帶與pGEM T-Easy載體連接，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞；隨后篩選白色 菌落并挑斑培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定，以pGEMT-Easy多克隆位點(diǎn)兩端的T7和SP6 啟動子序列為引物進(jìn)行雙向測序，獲得克隆的野蠶抗病毒蛋白SP-2基因；
(2)按以下方法進(jìn)行含有野蠶抗病毒蛋白SP-2基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建將克隆的野蠶SP-2抗病毒蛋白基因克隆入桿狀病毒Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)所提供 的供體質(zhì)粒PFastBacHTc EcoRI位點(diǎn)，用BamHI、PstI酶切和電泳鑒定方法確認(rèn)插入方向 的正確性；然后將該含有野蠶SP-2基因的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DHlOBmBac細(xì)胞，并在 LB液體培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)4h，然后取部分稀釋菌液涂板，在含有KanamyciruX-gal的LB培 養(yǎng)板上培養(yǎng)48h ；挑取白斑進(jìn)行單菌斑培養(yǎng)，抽提得到重組BmBacmid基因；隨后將所述重組 BmBacmid基因分別轉(zhuǎn)染入家蠶培養(yǎng)細(xì)胞獲得含有野蠶抗病毒蛋白SP-2基因的重組桿狀病(3)按以下方法在家蠶體內(nèi)表達(dá)和純化野蠶SP-2 用所述含有野蠶抗病毒蛋白SP-2基因的重組桿狀病毒作為載體在家蠶5齡幼蟲 中進(jìn)行表達(dá)，將病毒液經(jīng)口接種所述家蠶幼蟲實(shí)現(xiàn)病毒感染，隨后從感染后96小時(shí)的所述 家蠶幼蟲中分離、純化重組野蠶SP-2蛋白。本發(fā)明與背景技術(shù)相比，具有的有益效果是本發(fā)明利用家蠶桿狀病毒作為載體， 構(gòu)建含有野蠶抗病毒蛋白SP-2基因的重組病毒；利用家蠶作為重組桿狀病毒的宿主，表達(dá) 了具有生物學(xué)活性的野蠶抗病毒蛋白SP-2。由此，本發(fā)明建立了一種能夠利用家蠶作為生 物反應(yīng)器大量表達(dá)野蠶抗病毒蛋白SP-2的技術(shù)，為野蠶抗病毒蛋白SP-2在養(yǎng)蠶生產(chǎn)中的 應(yīng)用開辟了廣闊的前景。


圖1是野蠶SP-2CDNA的克隆和重組SP_2的表達(dá)和純化(a)從野蠶中腸克隆的SP_2cDNA瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，左為DNA分子量標(biāo)記 Marker，右為獲得的 SP_2cDNA。(b)本發(fā)明重組SP-2的表達(dá)和純化后蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖2是抗病毒蛋白SP-2抑制ODV病毒經(jīng)口感染后幼蟲死亡率調(diào)查圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用材料RNA抽提試劑盒購于Qiagene ；RNA處理和PCR擴(kuò)增試劑盒購于 Takara Biomedicals (Kyoto, Japan) ；TA 克隆試劑盒、桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體 pBlueBacHisA、 Iipofectin和Ni-NTA樹脂均為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；DNA測序試劑盒購于PE Applied Biosystems ；胎牛血清FCS、家蠶BmN細(xì)胞培養(yǎng)基TC-100均為GibcoBRL的產(chǎn)品； 本發(fā)明使用家蠶雜交種，其品種名稱為秋豐X白玉，家蠶幼蟲桑葉飼養(yǎng)，溫度為23 25°C。本發(fā)明野蠶抗病毒蛋白SP-2的大量表達(dá)方法的步驟如下(1)野蠶抗病毒蛋白SP-2基因的克隆野蠶從浙江省德清縣境內(nèi)桑園抓獲，用桑 葉飼養(yǎng)，至5齡解剖野蠶中腸后部組織，用Trizol法抽提總RNA，根據(jù)家蠶Bm SP-2基因序 列，設(shè)計(jì)一對引物，其中，上游引物序列5' -atgaaggtcttcgcagcagtac-3 ‘，下游引物序 列5' -attcgccagtcgtcatttaaattc-3‘，上述上、下游引物由上海生工公司合成。取2 μ 1 RNA為模板，按照上海生物工程有限公司提供的禽白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶AMV第一鏈cDNA合 成試劑盒合成第一鏈cDNA。接著進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系的總體積為20μ 1，其中，RNA 模板 0. 5μ g，上、下游引物各 6pmol，DNA 聚合酶 1. 25U, dNTP5umol, PCR Buffer 2. 5μ 1。PCR反應(yīng)按下列條件進(jìn)行94°C,3min ；940C，50s, 55°C，30s, 72°C，lmin,反應(yīng) 30 個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸 IOmin ；PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳后，切下相應(yīng)的DNA條帶，試劑盒回收，將切 下的DNA條帶與pGEM T-Easy載體連接，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。隨后篩選 白色菌落并挑斑培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定。序列測定委托上海博亞生物技術(shù)有限 公司進(jìn)行分析，根據(jù)PGEM T-Easy多克隆位點(diǎn)兩端的T7和SP6啟動子序列為引物進(jìn)行雙向 測序，獲得克隆的野蠶抗病毒蛋白SP-2基因。獲得的基因序列登錄國際核酸序列庫，基因 登錄號為AY945210。(2)含有野蠶抗病毒蛋白SP-2基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建將克隆的抗病毒 蛋白野蠶SP-2基因克隆入商品化的桿狀病毒Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)所提供的供體質(zhì)粒 PFastBacHTc EcoRI位點(diǎn)，用BamHI、PstI酶切和電泳鑒定方法確認(rèn)插入方向的正確性；然 后將該含有野蠶SP-2基因的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DHlOBmBac細(xì)胞，并在LB液體培養(yǎng) 基上振蕩培養(yǎng)4h，然后取部分稀釋菌液涂板，在含有KanamyciruX-gal的LB培養(yǎng)板上培養(yǎng) 48h。根據(jù)菌落的顏色，挑取白斑進(jìn)行單菌斑培養(yǎng)，抽提得到重組BmBacmid基因。隨后將重 組BmBacmid基因分別轉(zhuǎn)染入家蠶培養(yǎng)細(xì)胞獲得重組病毒，申請人將此重組病毒命名為含 有野蠶抗病毒蛋白SP-2基因的重組桿狀病毒；(3)按以下方法在家蠶體內(nèi)表達(dá)和純化野蠶SP-2 用所述含有野蠶抗病毒蛋白SP-2基因的重組桿狀病毒作為載體在家蠶5齡幼蟲 中進(jìn)行表達(dá)，將病毒液經(jīng)口接種所述家蠶幼蟲實(shí)現(xiàn)病毒感染，隨后從感染后96小時(shí)的所述 家蠶幼蟲中分離、純化重組野蠶SP-2蛋白。由于以上重組SP-2蛋白的N-末端帶有6XHis標(biāo)記，因此用Ni-NTA親和柱在 非變性天然條件下純化重組SP-2蛋白，即從感染的幼蟲收集的血淋巴用非變性結(jié)合緩 沖液(Na3P0450mmol/L, NaCl 0. 5mol/L，pH 8. 0)稀釋，將重組SP-2蛋白樣品首先結(jié)合到 Ni-NTA親和柱上，然后用非變性洗脫緩沖液洗脫(結(jié)合緩沖液中加入250mmol/L咪唑)，通 過SDS-PAGE用考馬斯亮藍(lán)染色后進(jìn)行重組蛋白純度的鑒定；純化后的樣品經(jīng)透析、冷凍干 燥，最后加入磷酸緩沖液(40mM，PH 7. 4.0)，并進(jìn)行蛋白定量。以上純化重組SP-2蛋白的 具體方法可參考Invitrogen公司Manual說明。如圖1所示表明，克隆獲得了野蠶SP-2的cDNA，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)，其大 小與預(yù)測的855bp基本相同；利用該基因構(gòu)建的重組病毒作為載體，在家蠶幼蟲中表達(dá)該 基因，獲得了相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)M-NTA柱獲得了較為純的SP-2蛋白，分子量大小約為 30kDa,也與預(yù)測的29. 6kDa基本相同，表明家蠶能夠表達(dá)重組野蠶SP-2 ；通過純化獲得了 SP-2的產(chǎn)量，每頭家蠶表達(dá)野蠶SP-2約為600mg，這說明利用家蠶能夠大量表達(dá)野蠶抗病 毒蛋白SP-2。按以下方法進(jìn)行重組野蠶SP-2抗病毒活性的分析用純化的野蠶SP-2蛋白處理家蠶BmNPV病毒，混合后的SP_2蛋白終濃度200ug/ ml。充分混合后將樣品置于37°C水浴放置1小時(shí)，然后以IOul/每頭的劑量經(jīng)口接種5齡 起蠶。每30頭蠶為一組，每處理重復(fù)三次，并設(shè)立空白對照。接種120h后每隔12h調(diào)查幼蟲死亡率，取三次實(shí)驗(yàn)的平均值，分析野蠶SP-2的抗病毒效果。經(jīng)過野蠶SP-2處理的家蠶 BmNPV病毒，在隨后的感染調(diào)查結(jié)果表明家蠶幼蟲死亡率與對照相比都呈現(xiàn)明顯的下降趨 勢(參看圖2)。以感染后180小時(shí)后為例，BmNPV感染的幾乎全部死亡，而經(jīng)過SP-2處理 的蠶的死亡率僅為38%。這說明野蠶SP-2有顯著的抑制BmNPV病毒活性的能力，具備抵抗 家蠶BmNPV病毒的活性。
權(quán)利要求
一種野蠶抗病毒蛋白SP 2的大量表達(dá)方法，其特征在于步驟如下(1)按以下方法進(jìn)行野蠶抗病毒蛋白SP 2基因的克隆解剖5齡野蠶的中腸后部組織，用Trizol法抽提總RNA，根據(jù)家蠶Bm SP 2基因序列，設(shè)計(jì)一對引物，其中，上游引物的序列為5′ atgaaggtcttcgcagcagtac 3′，下游引物的序列為5′ attcgccagtcgtcatttaaattc 3′；取2μl RNA為模板，用禽白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶AMV第一鏈cDNA合成試劑盒合成第一鏈cDNA；接著進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)體系的總體積為20μl，其中，RNA模板0.5μg、上游引物和下游引物各6pmol、DNA聚合酶1.25U、dNTP 5umol、PCR Buffer 2.5μl，所述PCR反應(yīng)按以下條件進(jìn)行94℃，3min；94℃，50s；55℃，30s；72℃，1min；反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min；PCR產(chǎn)物經(jīng)1％低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳后，切下相應(yīng)的DNA條帶，試劑盒回收，將上述DNA條帶與pGEM T Easy載體連接，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞；隨后篩選白色菌落并挑斑培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定，以pGEMT Easy多克隆位點(diǎn)兩端的T7和SP6啟動子序列為引物進(jìn)行雙向測序，獲得克隆的野蠶抗病毒蛋白SP 2基因；(2)按以下方法進(jìn)行含有野蠶抗病毒蛋白SP 2基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建將克隆的野蠶SP 2抗病毒蛋白基因克隆入桿狀病毒Bac to Bac表達(dá)系統(tǒng)所提供的供體質(zhì)粒pFastBacHTc EcoRI位點(diǎn)，用BamHI、PstI酶切和電泳鑒定方法確認(rèn)插入方向的正確性；然后將該含有野蠶SP 2基因的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10BmBac細(xì)胞，并在LB液體培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)4h，然后取部分稀釋菌液涂板，在含有Kanamycin、X gal的LB培養(yǎng)板上培養(yǎng)48h；挑取白斑進(jìn)行單菌斑培養(yǎng)，抽提得到重組BmBacmid基因；隨后將所述重組BmBacmid基因分別轉(zhuǎn)染入家蠶培養(yǎng)細(xì)胞獲得含有野蠶抗病毒蛋白SP 2基因的重組桿狀病毒；(3)按以下方法在家蠶體內(nèi)表達(dá)和純化野蠶SP 2用所述含有野蠶抗病毒蛋白SP 2基因的重組桿狀病毒作為載體在家蠶5齡幼蟲中進(jìn)行表達(dá)，將病毒液經(jīng)口接種所述家蠶幼蟲實(shí)現(xiàn)病毒感染，隨后從感染后96小時(shí)的所述家蠶幼蟲中分離、純化重組野蠶SP 2蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種野蠶抗病毒蛋白SP-2的大量表達(dá)方法，其步驟為(1)進(jìn)行野蠶抗病毒蛋白SP-2基因的克??；(2)進(jìn)行含有野蠶抗病毒蛋白SP-2基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建；(3)在家蠶體內(nèi)表達(dá)和純化野蠶SP-2。本發(fā)明利用家蠶桿狀病毒作為載體，構(gòu)建含有野蠶抗病毒蛋白SP-2基因的重組病毒；利用家蠶作為重組桿狀病毒的宿主，表達(dá)了具有生物學(xué)活性的野蠶抗病毒蛋白SP-2。本發(fā)明表明利用重組桿狀病毒以家蠶作為宿主，表達(dá)SP-2的蛋白質(zhì)含量較高，因此可利用本發(fā)明進(jìn)行大量表達(dá)野蠶抗病毒蛋白SP-2，由此為抗病毒蛋白SP-2在養(yǎng)蠶業(yè)中的應(yīng)用開辟了廣闊的前景。
文檔編號C12N15/866GK101974545SQ201010281579
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月14日
發(fā)明者吳小鋒, 胡小龍, 陳琳 申請人:浙江大學(xué)