專利名稱：一種提取微生物dna的試劑盒及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種提取微生物DNA的試劑盒，還涉及一 種提取微生物DNA的方法。
背景技術(shù)：
微生物是一切肉眼看不見或看不清的微小生物的總稱，是包括細(xì)菌、病毒、真菌以 及一些小型的原生動(dòng)物、顯微藻類等在內(nèi)的一大類生物群體。它們個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡單，卻 與人類生活關(guān)系密切，涵蓋了有益有害的眾多種類，廣泛涉及健康、食品、醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)、 環(huán)保等諸多領(lǐng)域。土壤微生物資源豐富，是陸地生態(tài)系統(tǒng)中重要的生命體，其對外界環(huán)境很敏感，抗 逆性較差，很容易受到各種不良外界環(huán)境的影響。因此，土壤微生物是常用的土壤生態(tài)系統(tǒng) 變化的預(yù)警及敏感指標(biāo)。從土壤中獲得微生物的傳統(tǒng)方法是富集、培養(yǎng)、再分離，但是由于 自然生態(tài)環(huán)境中的絕大部分微生物還無法在實(shí)驗(yàn)室被成功培養(yǎng)，因此相當(dāng)多的菌種由于無 法培養(yǎng)而不能被充分的開發(fā)和利用。同時(shí)，在此過程中也造成微生物多樣性的丟失及種群 構(gòu)成發(fā)生變化，這樣就使得對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、功能以及動(dòng)態(tài)監(jiān)測的研究受到了極大 的局限性和偏差。隨著分子生物學(xué)和分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，不經(jīng)過傳統(tǒng)培養(yǎng)，直接從 土壤中提取微生物DNA，通過變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)或者 是限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)等分子生物學(xué)方法來研究土壤微生物的多樣性及種群情 況，已成為更能揭示土壤生態(tài)系統(tǒng)真實(shí)性的新途徑。因此，從自然環(huán)境中提取微生物的基因 組DNA，不僅能檢測不能培養(yǎng)的細(xì)菌，還能跟蹤某些目標(biāo)菌株或重組基因，從而揭示土壤微 生物生態(tài)系統(tǒng)中基因的多樣性和監(jiān)測土壤生態(tài)系統(tǒng)的變化。但是，土壤成分復(fù)雜，通常含有較多的可與微生物DNA共同提取出來的物質(zhì)，如腐 殖酸、黃酸、酚類化合物、重金屬離子等，這些物質(zhì)可抑制PCR擴(kuò)增中的Taq DNA聚合酶以 及酶切反應(yīng)中的限制性內(nèi)切酶的活性，影響下游實(shí)驗(yàn)；同時(shí)，微生物僅為土壤樣品中極小的 一部分，微生物細(xì)胞常常緊密吸附于土壤顆粒表面，因此，從土壤樣品中高效地獲得微生物 DNA具有相當(dāng)?shù)碾y度。另外，不同土壤樣品之間差異較大，使得不同類型的土壤會(huì)影響土壤 微生物DNA的提取效果，這對從環(huán)境樣品中高效的提取DNA來說就更為困難。目前從土壤中提取微生物DNA的方法可分為直接法和間接法兩類。直接法采用原 位裂解土壤微生物的方法，這種方法獲得的基因組DNA都是粗提液，含有較多的雜質(zhì)如腐 殖酸、黃酸等，會(huì)抑制下游實(shí)驗(yàn)，必需再經(jīng)過純化回收才能使用；而間接法則采用差速離心 回收菌體，然后再裂解菌體提取基因組DNA，但是這種提取方法需要專門的儀器，而且操作 步驟繁瑣，耗時(shí)較多，也容易造成物種的丟失。針對土壤中微生物DNA提取的難點(diǎn)和特點(diǎn)， 一些大型生物公司研發(fā)出了提取土壤中微生物DNA的商業(yè)試劑盒，如Mo Bio UltraClean Soil DNAKit (MoBio Laboratories, Inc. , Solana Beach，Calif.)，雖然這種商業(yè)試劑盒使 用起來非常方便、快捷，但提取微生物DNA的效果并不理想。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種提取微生物DNA的試劑盒，采用該試劑盒 提取微生物DNA純度高、通用性好、可靠性高、提取速度快。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種提取微生物DNA的方法，該方法提取的微生物 DNA純度高、通用性好、提取速度快，可直接用于下游實(shí)驗(yàn)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種提取微生物DNA的試劑盒，所述試劑盒包括裂解液I、裂解液II、抑制物去除液I，抑制物去除液II和結(jié)合液，所述裂解液I包 含 pH8. 0 50-200mM 的 Tris-HCl、ρΗ8· 0 50_150mM 的 EDTA、0. 5-3M 的 NaCl、0· 5-2% 的 CTAB 和0. 5-2%的PVP，所述裂解液II為使用終濃度為0. 5-2%的SDS，所述抑制物去除液I為 100-300mM的乙酸鉀、乙酸鈉或乙酸銨，所述抑制物去除液II為50_200mM的硫酸鋁、硫酸銨 或硫酸鋁銨，所述結(jié)合液包含3-6M的鹽酸胍、pH7. 5 10-50mM的Tris-HCl和5-50%的異丙 醇。本發(fā)明所述裂解液I、裂解液II既含有陽離子去污劑，又含有陰離子去污劑，能夠 針對廣泛的微生物群落，徹底裂解樣品，同時(shí)還含有去除多糖多酚效果的成分，能使核酸和 多糖多酚分離；所述的抑制物去除液I和抑制物去除液II能夠最大限度的去除腐殖酸、黃 酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；結(jié)合液能夠提高核酸和玻璃纖維素膜的結(jié)合能力。優(yōu)選地，所述裂解液I 包含 pH8. 0 IOOmM 的 Tris-HCl、ρΗ8· OlOOmM 的 EDTA、1. 5M 的 NaCl、1 % 的 CTAB 和 1 % 的 PVP。優(yōu)選地，所述裂解液II為使用終濃度為2%的SDS。優(yōu)選地，所述抑制物去除液I為250mM的乙酸銨。優(yōu)選地，所述抑制物去除液II為120mM的硫酸鋁銨。優(yōu)選地，所述結(jié)合液包含5M的鹽酸胍、pH7. 5 20mM的Tris-HCl和30%的異丙醇。本發(fā)明所述提取微生物DNA的試劑盒還包括提取緩沖液、漂洗液、洗脫液和玻璃纖維素膜，所述提取緩沖液包含50_150mM的 異硫氰酸胍和150-200mM的磷酸鈉，所述漂洗液包含pH7. 5 5_20mM的Tris-HCl、50-80%的 無水乙醇和50-200mM的NaCl，所述洗脫液為pH7. 0-8. 5 5-30mM的Tris-HCl，所述玻璃纖 維素膜孔徑為0. 45 μ m。本發(fā)明所述的提取緩沖液能夠降低土壤、糞便、淤泥、泥沙以及巖石樣品對微生 物細(xì)胞的吸附作用，為提取微生物DNA提供最優(yōu)的緩沖環(huán)境；漂洗液可以去除玻璃纖維素 膜上吸附的蛋白和其他代謝產(chǎn)物，如多糖、纖維素、脂類等；洗脫液是一種不含核酸酶的 低鹽高PH值的溶液，能夠把吸附在玻璃纖維素膜上的DNA洗脫下來；玻璃纖維素膜采用 Whatman公司的GF\B型號。優(yōu)選地，所述提取緩沖液包含120mM的異硫氰酸胍和ISlmM的磷酸鈉。優(yōu)選地，所述漂洗液包含pH7. 5 IOmM的Tris_HCl、80 %的無水乙醇和IOOmM的 NaCl。優(yōu)選地，所述洗脫液為pH8. 0 IOmM的Tris-HCl。本發(fā)明還提供一種提取微生物DNA的方法，包括以下步驟步驟1、將提取緩沖液和樣品充分混勻，加入裂解液I振蕩，再加入裂解液II水浴， 離心取上清液，所述樣品為土壤、糞便、泥沙、巖石或淤泥，所述提取緩沖液包含50-150mM的異硫氰酸胍和150-200mM的磷酸鈉，所述裂解液I包含pH8. 0 50_200mM的Tris_HCl、 pH8. 0 50-150mM 的 EDTA、0. 5-3M 的 NaCl、0. 5-2% 的 CTAB 和 0. 5-2% 的 PVP，所述裂解液 II 為使用終濃度為0. 5-2%的SDS ；步驟2、向步驟1所述上清液加入抑制物去除液I，充分混勻，冰浴，離心取上清液， 所述抑制物去除液I為100-300mM的乙酸鉀、乙酸鈉或乙酸銨；步驟3、向步驟2所述上清液加入抑制物去除液II，充分混勻，冰浴，離心取上清 液，所述抑制物去除液II為50-200mM的硫酸鋁、硫酸銨或硫酸鋁銨；步驟4、步驟3所述上清液與玻璃纖維素膜、結(jié)合液充分作用后漂洗，然后洗脫所 述玻璃纖維素膜上吸附的DNA，所述結(jié)合液包含3-6M的鹽酸胍、pH7. 5 10_50mM的Tris-HCl 和5-50%的異丙醇，所述漂洗液包含pH7. 5 5-20mM的Tris-HCl、50_80 %的無水乙醇和 50-200mM 的 NaCl，所述洗脫液為 pH7. 0-8. 5 5-30mM 的 Tris-HCl。優(yōu)選地，所述裂解液I 包含 pH8. 0 IOOmM 的 Tris-HCl、pH8. OlOOmM 的 EDTA、1. 5M 的 NaCl、1 % 的 CTAB 和 1 % 的 PVP。優(yōu)選地，所述裂解液II為使用終濃度為2%的SDS。優(yōu)選地，所述抑制物去除液I為250mM的乙酸銨。優(yōu)選地，所述抑制物去除液II為120mM的硫酸鋁銨。優(yōu)選地，所述結(jié)合液包含5M的鹽酸胍、pH7. 5 20mM的Tris-HCl和30%的異丙醇。優(yōu)選地，所述漂洗液包含pH7. 5 IOmM的Tris_HCl、80 %的無水乙醇和IOOmM的 NaCl。優(yōu)選地，所述洗脫液為pH8. 0 IOmM的Tris-HCl。由以上技術(shù)方案可知，采用本發(fā)明所述提取微生物DNA的試劑盒及方法，所提取 的微生物DNA純度高、通用性好、提取速度快，可直接用于下游實(shí)驗(yàn)。


圖1示從土壤中提取微生物DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；泳道M 分子量Marker，從上至下依次為23kb、9. 4kb、6. 5kb ；泳道1 本發(fā)明從土 壤中提取的微生物DNA條帶；泳道2 :Mo BioUltraClean Soil DNAKit從土壤中提取的微生 物DNA條帶；圖2示從土壤中提取微生物DNA的擴(kuò)增16S rRNA基因的瓊脂糖凝膠電泳圖；泳道M 分子量 Marker，從上至下依次為 2. Okb、1. 0kb、750bp、500bp、250bp、 IOObp ；泳道1-4 =Mo Bio UltraClean Soil DNA Kit方法從土壤中提取的微生物DNA梯度 稀釋0倍、10倍、50倍、100倍后作為模板擴(kuò)增16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物結(jié)果；泳道5_8 本發(fā)明從土壤中提取的微生物DNA梯度稀釋0倍、10倍、50倍、100倍后作為模板擴(kuò)增16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種提取微生物DNA的試劑盒，還公開了一種提取微生物DNA的方 法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有 類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的試劑盒及方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi) 容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本 發(fā)明技術(shù)。依照本發(fā)明，所述提取微生物DNA的試劑盒包括裂解液I、裂解液II、抑制物去除液I，抑制物去除液II和結(jié)合液，所述裂解液I包 含 pH8. 0 50-200mM 的 Tris-HCl、ρΗ8· 0 50_150mM 的 EDTA、0. 5-3M 的 NaCl、0· 5-2% 的 CTAB 和0. 5-2%的PVP，所述裂解液II為使用終濃度為0. 5-2%的SDS，所述抑制物去除液I為 100-300mM的乙酸鉀、乙酸鈉或乙酸銨，所述抑制物去除液II為50_200mM的硫酸鋁、硫酸銨 或硫酸鋁銨，所述結(jié)合液包含3-6M的鹽酸胍、pH7. 5 10-50mM的Tris-HCl和5-50%的異丙本發(fā)明所述裂解液I、裂解液II既含有陽離子去污劑，又含有陰離子去污劑，能夠 針對廣泛的微生物群落，徹底裂解樣品，同時(shí)還含有去除多糖多酚效果的成分，能使核酸和 多糖多酚分離；所述的抑制物去除液I和抑制物去除液II能夠最大限度的去除腐殖酸、黃 酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；結(jié)合液能夠提高核酸和玻璃纖維素膜的結(jié)合能力。優(yōu)選地，所述裂解液I 包含 pH8. 0 IOOmM 的 Tris-HCl、pH8. OlOOmM 的 EDTA、1. 5M 的 NaCl、1 % 的 CTAB 和 1 % 的 PVP。優(yōu)選地，所述裂解液II為使用終濃度為2%的SDS。優(yōu)選地，所述抑制物去除液I為250mM的乙酸銨。優(yōu)選地，所述抑制物去除液II為120mM的硫酸鋁銨。優(yōu)選地，所述結(jié)合液包含5M的鹽酸胍、pH7. 5 20mM的Tris-HCl和30%的異丙醇。本發(fā)明所述提取微生物DNA的試劑盒還包括提取緩沖液、漂洗液、洗脫液和玻璃纖維素膜，所述提取緩沖液包含50_150mM的 異硫氰酸胍和150-200mM的磷酸鈉，所述漂洗液包含pH7. 5 5_20mM的Tris-HCl、50-80%的 無水乙醇和50-200mM的NaCl，所述洗脫液為pH7. 0-8. 5 5-30mM的Tris-HCl，所述玻璃纖 維素膜孔徑為0. 45 μ m。本發(fā)明所述的提取緩沖液能夠降低土壤、糞便、淤泥、泥沙以及巖石樣品對微生 物細(xì)胞的吸附作用，為提取微生物DNA提供最優(yōu)的緩沖環(huán)境；漂洗液可以去除玻璃纖維素 膜上吸附的蛋白和其他代謝產(chǎn)物，如多糖、纖維素、脂類等；洗脫液是一種不含核酸酶的 低鹽高PH值的溶液，能夠把吸附在玻璃纖維素膜上的DNA洗脫下來；玻璃纖維素膜采用 Whatman公司的GF\B型號。 優(yōu)選地，所述提取緩沖液包含120mM的異硫氰酸胍和ISlmM的磷酸鈉。優(yōu)選地，所述漂洗液包含pH7. 5 IOmM的Tris_HCl、80 %的無水乙醇和IOOmM的 NaCl。優(yōu)選地，所述洗脫液為pH8. OlOmM的Tris-HCl。本發(fā)明還提供一種提取微生物DNA的方法，包括以下步驟步驟1、將提取緩沖液和樣品充分混勻，加入裂解液I振蕩，再加入裂解液II水浴， 離心取上清液，所述樣品為土壤、糞便、泥沙、巖石或淤泥，所述提取緩沖液包含50-150mM 的異硫氰酸胍和150-200mM的磷酸鈉，所述裂解液I包含pH8. 0 50_200mM的Tris-HCl、 pH8. 0 50-150mM 的 EDTA、0. 5-3M 的 NaCl、0. 5-2% 的 CTAB 和 0. 5-2% 的 PVP，所述裂解液 II為使用終濃度為0. 5-2%的SDS ；步驟2、向步驟1所述上清液加入抑制物去除液I，充分混勻，冰浴，離心取上清液， 所述抑制物去除液I為100-300mM的乙酸鉀、乙酸鈉或乙酸銨；步驟3、向步驟2所述上清液加入抑制物去除液II，充分混勻，冰浴，離心取上清 液，所述抑制物去除液II為50-200mM的硫酸鋁、硫酸銨或硫酸鋁銨；步驟4、步驟3所述上清液與玻璃纖維素膜、結(jié)合液充分作用后漂洗，然后洗脫所 述玻璃纖維素膜上吸附的DNA，所述結(jié)合液包含3-6M的鹽酸胍、pH7. 5 10_50mM的Tris-HCl 和5-50%的異丙醇，所述漂洗液包含pH7. 5 5-20mM的Tris-HCl、50_80%的無水乙醇和 50-200mM 的 NaCl，所述洗脫液為 pH7. 0-8. 5 5-30mM 的 Tris-HCl。優(yōu)選地，所述裂解液I 包含 pH8. 0 IOOmM 的 Tris-HCl、pH8. OlOOmM 的 EDTA、1. 5M 的 NaCl、1 % 的 CTAB 和 1 % 的 PVP。優(yōu)選地，所述裂解液II為使用終濃度為2%的SDS。優(yōu)選地，所述抑制物去除液I為250mM的乙酸銨。優(yōu)選地，所述抑制物去除液II為120mM的硫酸鋁銨。優(yōu)選地，所述結(jié)合液包含5M的鹽酸胍、pH7. 5 20mM的Tris-HCl和30%的異丙醇。優(yōu)選地，所述漂洗液包含pH7. 5 IOmM的Tris_HCl、80 %的無水乙醇和IOOmM的 NaCl。優(yōu)選地，所述洗脫液為pH8. 0 IOmM的Tris-HCl。取相同樣品量采用本發(fā)明的方法和MO BIO公司的Mo BioUltraClean Soil DNA Kit (MoBio Laboratories, Inc. , Solana Beach, Calif.)的方法分別提取 DNA，本發(fā)明所提 取的DNA的0D260/0D280值與MOBIO公司的試劑盒所提取的DNA相當(dāng)，但0D260/0D230值 比MO BIO公司的試劑盒所提取的DNA更接近標(biāo)準(zhǔn)值，表明本發(fā)明所提取的DNA雜質(zhì)較少； 在通過PCR擴(kuò)增16S rRNA基因的部分片段來進(jìn)一步檢測所提取DNA純度的實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明 提取的DNA在稀釋0倍、10倍、50倍、100倍后都擴(kuò)增出預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物，而MO BIO公 司的試劑盒所提取的DNA只有在稀釋DNA的前提下才擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果 進(jìn)一步表明本發(fā)明提取的DNA純度高，可用于下游實(shí)驗(yàn)。下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例1 本發(fā)明所述提取微生物DNA的試劑盒本發(fā)明所述提取微生物DNA的試劑盒包括提取緩沖液120mM的異硫氰酸胍、181mM pH值為7. 0的Na3P04。具體配制方法 稱取異硫氰酸胍1. 42克，加入足夠的蒸餾水進(jìn)行充分溶解，然后加入pH為7. 0、濃度為IM 的Na3P0418. 1ml，充分混勻，定容到100ml。裂解液 I IOOmM 的 Tris-HCl (pH 為 8. 0)、IOOmM 的 EDTA (pH 為 8. 0)、1. 5M 的 NaCl、 1 %的CTAB、1 %的PVP。具體配制方法分別稱取1克CTAB和1克PVP10，加適量蒸餾水分 別溶解，然后加入 IM 的 Tris-HCl (pH 為 8. 0) IOml, 0. 5M 的 EDTA(pH 為 8. 0) 20ml, 5M 的 NaCl 30ml，然后定容到100ml。裂解液11 終濃度為2 %的SDS。抑制物去除液I :250mM的乙酸銨。具體配制方法取250 μ 1 IOM的乙酸銨，加入 蒸餾水定容到10ml。
抑制物去除液II :120mM的硫酸鋁銨。結(jié)合液5M的鹽酸胍、20mM的Tris-HCl (pH為7. 5)、30%的異丙醇。具體配制方 法稱取47. 75克鹽酸胍，加蒸餾水充分溶解，然后加入IM的Tris-HCl (pH為7. 5) 2ml，異 丙醇30ml，定容到IOOml，充分混勻。漂洗液IOmM的pH值為7. 5的Tris-HClUOOmM的NaCl、80%的無水乙醇。具體 配制方法量取PH值為7. 5，濃度為IM的Tris-HCl lml，再量取5M的NaCl 2ml，加入適量 的RNase-free的蒸餾水混勻，再加入80ml的無RNase-free的無水乙醇，定容到100ml，充 分混勻。洗脫液=IOmM的 Tris-HCl, pH 值為 8. 0。玻璃纖維素膜吸附柱0. 45 μ m玻璃纖維素膜，Whatman公司，GF/B型，1. 5mL離心 柱。實(shí)施例2 從土壤中提取微生物DNA利用實(shí)施例1所述試劑盒進(jìn)行提取。1、提取試劑提取緩沖液120mM的異硫氰酸胍、181mM pH值為7. 0的Na3P04。裂解液I IOOmM 的 Tris-HCl (pH 為 8. 0)、IOOmM 的 EDTA (pH 為 8. 0)、1. 5M 的 NaCl、 的 CTAB、1% 的 PVP。裂解液11 終濃度為2 %的SDS。抑制物去除液I :250mM的乙酸銨。抑制物去除液II :120mM的硫酸鋁銨。結(jié)合液5M的鹽酸胍、20mM的Tris-HCl (pH為7. 5)、30%的異丙醇。漂洗液10mM的pH值為7. 5的Tris-HClUOOmM的NaCl、80%的無水乙醇。洗脫液=IOmM的 Tris-HCl, pH 值為 8. 0。玻璃纖維素膜吸附柱0. 45 μ m玻璃纖維素膜，Whatman公司，GF/B型，1. 5mL離心 柱。2、提取方法(1)取大樹下靠近根系的土壤樣品，用單層紗布篩去樹根和大塊土壤，稱取0.5 克，置于5ml的滅菌離心管中，加入1. 5ml提取緩沖液，渦旋振蕩30秒充分混勻；(2)加入120 μ 1的裂解液I，渦旋振蕩充分混勻，37°C，200rpm振蕩30分鐘；(3)加入200μ 1裂解液II，70°C水浴10分鐘，期間每隔3分鐘渦旋混勻一次， 12000rpm離心1分鐘，取上清；(4)加入上清1/2體積的抑制物去除液I，充分混勻，冰浴10分鐘，12000rpm離心
3分鐘，取上清；(5)加入上清1/3體積的抑制物去除液II，充分混勻，冰浴10分鐘，12000rpm離心
3分鐘，取上清；(6)加入上清1.5倍體積的結(jié)合液，充分混勻，把所得混合液(可以分幾次)加入 到含有玻璃纖維素膜的吸附柱中，12000rpm離心30秒，棄流出液；(7)在吸附柱上加入漂洗液，12000rpm離心30秒，棄流出液；再加入漂洗液洗滌一 次，棄流出液，然后再12000rpm離心2分鐘；
(8)轉(zhuǎn)移吸附柱到一個(gè)干凈的1. 5ml離心管中，在吸附柱中加入事先65°C溫浴的 洗脫液100 μ 1，室溫放置1分鐘，12000rpm離心1分鐘，收集流出液。收集的流出液再加入 到吸附柱中重復(fù)洗脫一次，收集流出液，流出液即為所提土壤樣品中微生物DNA。實(shí)施例3 提取的微生物DNA濃度及純度檢測與實(shí)施例1相同、等量的土壤樣品用Mo Bio UltraClean Soil DNAKit提取微生 物DNA，對實(shí)施例1所提取的微生物DNA及用Mo BioUltraClean Soil DNA Kit提取的微生 物DNA進(jìn)行濃度及純度檢測，結(jié)果參見表1。表1微生物DNA濃度及純度檢測
本發(fā)明方法Mo Bio UltraClean Soil DNA KitDNA 濃度(μ g/ml)104860D260/0D2801. 71. 860D260/0D2300. 940. 87結(jié)果顯示，實(shí)施例1所提取的微生物DNA濃度大于用Mo BioUltraClean Soil DNA Kit提取的微生物DNA濃度；本發(fā)明所提取的DNA的0D260/0D280值與標(biāo)準(zhǔn)值(1. 8)無明 顯差異，但0D260/0D230值比MO BIO公司的試劑盒所提取的DNA更接近標(biāo)準(zhǔn)值(1. 7-2. 0)。 以上結(jié)果表明，相同樣品量，本發(fā)明所提取的DNA濃度高，且雜質(zhì)較少。實(shí)施例4 提取的微生物DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測將實(shí)施例1所提取的微生物DNA及實(shí)施例2用Mo Bio UltraCleanSoil DNA Kit 提取的微生物DNA進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果參見圖1。結(jié)果顯示，本發(fā)明所提取的 DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示出單一的目的條帶，沒有出現(xiàn)雜帶，并且條帶亮度明顯亮于 Mo BioUltraClean Soil DNA Kit提取的微生物DNA的條帶。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，本發(fā)明 所提取的微生物DNA純度高、雜質(zhì)少。實(shí)施例5 提取的微生物DNA擴(kuò)增16S rRNA基因?qū)?shí)施例1所提取的微生物DNA及實(shí)施例2用Mo Bio UltraCleanSoil DNA Kit 提取的微生物DNA梯度稀釋為O倍、10倍、50倍、100倍后作為模板，使用16S rRNA基因通 用引物27F和1492R擴(kuò)增16SrRNA基因的部分片段來進(jìn)一步檢測所提取土壤樣品基因組 DNA的純度，結(jié)果參見圖2。其中，擴(kuò)增引物為27F 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，；1492R :5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，。PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件參見表1、表2。表1 PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
一種提取微生物DNA的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括裂解液I、裂解液II、抑制物去除液I，抑制物去除液II和結(jié)合液，所述裂解液I包含pH8.0 50 200mM的Tris HCl、pH8.0 50 150mM的EDTA、0.5 3M的NaCl、0.5 2％的CTAB和0.5 2％的PVP，所述裂解液II為使用終濃度為0.5 2％的SDS，所述抑制物去除液I為100 300mM的乙酸鉀、乙酸鈉或乙酸銨，所述抑制物去除液II為50 200mM的硫酸鋁、硫酸銨或硫酸鋁銨，所述結(jié)合液包含3 6M的鹽酸胍、pH7.5 10 50mM的Tris HCl和5 50％的異丙醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述裂解液I包含pH8.OlOOmM的 Tris-HCl、pH8. 0 IOOmM 的 EDTA、1. 5M 的 NaCl、l % 的 CTAB 禾口 1 % 的 PVP。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述裂解液II為使用終濃度為2%的SDS。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述抑制物去除液I為250mM的乙酸銨。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述抑制物去除液II為120mM的硫酸鋁銨。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述結(jié)合液包含5M的鹽酸胍、pH7.5 20mM 的Tris-HCl和30%的異丙醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括提取緩沖液、漂洗液、洗脫液和玻璃纖維素膜，所述提取緩沖液包含50-150mM的異硫 氰酸胍和150-200mM的磷酸鈉，所述漂洗液包含pH7. 55_20mM的Tris_HCl、50-80%的無水 乙醇和50-200mM的NaCl，所述洗脫液為pH7. 0-8. 5 5-30mM的Tris-HCl，所述玻璃纖維素 膜孔徑為0. 45 μ m。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述試劑盒，其特征在于，所述提取緩沖液包含120mM的異硫氰酸胍 禾口 18ImM的磷酸鈉，所述漂洗液包含pH7. 5 IOmM的Tris_HCl、80%的無水乙醇和IOOmM的 NaCl，所述洗脫液為 pH8. 0 IOmM 的 Tris-HCl。
9.一種提取微生物DNA的方法，包括以下步驟步驟1、將提取緩沖液和樣品充分混勻，加入裂解液I振蕩，再加入裂解液II水浴，離心 取上清液，所述樣品為土壤、糞便、泥沙、巖石或淤泥，所述提取緩沖液包含50-150mM的異 硫氰酸胍和150-200mM的磷酸鈉，所述裂解液I包含pH8. 0 50-200mM的Tris_HCl、pH8. 0 50-150mM 的 EDTA、0. 5-3M 的 NaCl、0. 5-2% 的 CTAB 和 0. 5-2% 的 PVP，所述裂解液 II 為使 用終濃度為0. 5-2%的SDS;步驟2、向步驟1所述上清液加入抑制物去除液I，充分混勻，冰浴，離心取上清液，所述 抑制物去除液I為100-300mM的乙酸鉀、乙酸鈉或乙酸銨；步驟3、向步驟2所述上清液加入抑制物去除液II，充分混勻，冰浴，離心取上清液，所 述抑制物去除液II為50-200mM的硫酸鋁、硫酸銨或硫酸鋁銨；步驟4、步驟3所述上清液與玻璃纖維素膜、結(jié)合液充分作用后漂洗，然后洗脫所述玻 璃纖維素膜上吸附的DNA，所述結(jié)合液包含3-6M的鹽酸胍、pH7. 5 10-50mM的Tris-HCl 和5-50 %的異丙醇，所述漂洗液包含pH7. 55-20mM的Tri s_HCl、50-80 %的無水乙醇和 50-200mM 的 NaCl，所述洗脫液為 pH7. 0-8. 5 5-30mM 的 Tris-HCl。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述方法，其特征在于，所述裂解液I包含pH8.OlOOmM的Tris-HCl, ρΗ8. O IOOmM 的 EDTA、1. 5Μ 的 NaCl、1 % 的 CTAB 禾Π 1 % 的 PVP，所述裂解液 II 為 使用終濃度為2%的SDS，所述抑制物去除液I為250mM的 乙酸銨，所述抑制物去除液II為 120mM的硫酸鋁銨，所述結(jié)合液包含5M的鹽酸胍、pH7. 5 20mM的Tris-HCl和30%的異丙醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種提取微生物DNA的試劑盒及方法。該試劑盒包括裂解液、抑制物去除液和結(jié)合液，所述裂解液包含50-200mM的Tris-HCl、50-150mM的EDTA、0.5-3M的NaCl、0.5-2％的CTAB、0.5-2％的PVP和0.5-2％的SDS；抑制物去除液為100-300mM的乙酸鉀、乙酸鈉或乙酸銨和50-200mM的硫酸鋁、硫酸銨或硫酸鋁銨；結(jié)合液包含3-6M的鹽酸胍、10-50mM的Tris-HCl和5-50％的異丙醇。本發(fā)明試劑盒及方法提取的微生物DNA純度高、通用性好、提取速度快，可直接用于下游實(shí)驗(yàn)，適用于從包含微生物的樣品中提取DNA。
文檔編號C12N15/10GK101935647SQ20101028159
公開日2011年1月5日 申請日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者李艷萍 申請人:原平皓(天津)生物技術(shù)有限公司