專利名稱：一種發(fā)酵性絲孢酵母菌株及其生產(chǎn)微生物油脂的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程和微生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種高效利用木質(zhì)纖維素水解 液生產(chǎn)微生物油脂的菌株發(fā)酵性絲孢酵母CCTCC M209060及該菌株利用木質(zhì)纖維素水解液 發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法。
背景技術(shù)：
生物柴油是一種以動(dòng)植物油脂為原料生產(chǎn)的能夠替代化石柴油的綠色可再生能 源，在石油能源替代戰(zhàn)略中具有十分重要的地位。目前生物柴油的工業(yè)化生產(chǎn)主要以大豆 油、菜籽油以及廢油脂為原料。我國人多地少，以食用油為原料生產(chǎn)生物柴油不符合國情， 而廢油脂的數(shù)量有限，無法滿足現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)社會(huì)對(duì)能源的巨大需求。微生物油脂，又稱單細(xì)胞 油脂，是微生物生命活動(dòng)中的一種代謝產(chǎn)物。某些微生物如酵母、霉菌、微藻、細(xì)菌能夠積累 大量油脂，有的菌體中油脂含量甚至達(dá)到干菌絲體的70%以上。這些油脂與一般植物油脂 有類似的脂肪酸組成，因此是一種具有巨大潛力的新型生物柴油生產(chǎn)原料。與動(dòng)植物油脂 相比，用微生物生產(chǎn)油脂具有如下優(yōu)點(diǎn)生長周期短，占地面積小，不受場地、氣候和季節(jié)限 制，能連續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)。然而對(duì)于大多數(shù)油脂微生物而言，油脂產(chǎn)率很低，并不能滿足微生 物油脂工業(yè)化生產(chǎn)的需求，篩選具有高油脂產(chǎn)率的油脂微生物尤其重要。此外，現(xiàn)有微生物 發(fā)酵產(chǎn)油脂一般以葡萄糖為培養(yǎng)基，導(dǎo)致微生物油脂生產(chǎn)成本高，難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源，其主要成分為纖維素、半纖維素和木 質(zhì)素。我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，各種農(nóng)業(yè)廢棄物，如農(nóng)作物秸稈、蔗渣等數(shù)量巨大，僅農(nóng)作物秸 稈每年就達(dá)7億噸以上。過去，這部分木質(zhì)纖維素資源經(jīng)常被廢棄或低值化利用，如農(nóng)作物 秸稈經(jīng)焚燒后用于農(nóng)田堆肥，但焚燒過程中產(chǎn)生的黑煙會(huì)污染環(huán)境。利用農(nóng)作物秸稈或蔗 渣等木質(zhì)纖維素資源來生產(chǎn)微生物油脂可大大降低微生物油脂的生產(chǎn)成本，但在木質(zhì)纖維 素的稀酸水解以及酶法水解前用稀酸預(yù)處理的過程中，會(huì)產(chǎn)生許多抑制微生物生長代謝的 物質(zhì)，如有機(jī)酸、醛類化合物和醇類化合物等。這些物質(zhì)降低了水解液中還原糖的可發(fā)酵 性，并抑制微生物細(xì)胞積累油脂。因此，獲得能夠在含抑制劑的木質(zhì)纖維素水解液中高效積 累油脂的菌株是實(shí)現(xiàn)廉價(jià)生產(chǎn)微生物油脂的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的首要目的之一是提供一種發(fā)酵性絲 孢酵母菌株(Trichosporon fermentans) HWZ004，該菌株已經(jīng)由中國典型培養(yǎng)物保藏中心 保藏，保藏編號(hào)為CCTCC M209060，保藏日期為2009年3月26日。本發(fā)明的另一目的是提供上述發(fā)酵性絲孢酵母利用木質(zhì)纖維素水解液生產(chǎn)微生 物油脂的應(yīng)用。本發(fā)明目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種發(fā)酵性絲孢酵母菌株(Trichosporon fermentans) HWZ004，該菌株是以發(fā)酵 性絲孢酵母CICC 1368 (購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)為出發(fā)菌株，先經(jīng)過誘變處理得到高產(chǎn)油脂菌株，然后該菌株在木質(zhì)纖維素水解液中馴化得到的。所述的誘變處理是經(jīng)過紫外線多次誘變，再經(jīng)過紫外線與LiCl的多次復(fù)合誘 變，然后通過發(fā)酵篩選得到高產(chǎn)菌株發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporon fermentans) HWZ003o 該菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖100g/L ；蛋白胨1. 8g/L ；酵母粉0. 5g/L ；MgSO4 · 7H20 0. 4g/ L ；KH2PO4 2g/L ；MnSO4 · H2O 0. 004g/L ；CuSO4 · 5H20 0. 0001g/L)中發(fā)酵，可以得到生物量為 35. lg/L，油脂含量為62%的干菌體，油脂產(chǎn)率21. 8g/L。

為了讓上述誘變后的發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporon fermentans)HWZ003能更好 地利用木質(zhì)纖維素水解液進(jìn)行微生物油脂生產(chǎn)，該誘變菌株在木質(zhì)纖維素水解液中進(jìn)行長 時(shí)間的馴化，馴化方法是把發(fā)酵培養(yǎng)基(木糖120g/L ；蛋白胨1. 8g/L ；酵母粉0. 5g/L)與 木質(zhì)纖維素水解液(水稻秸稈酸水解液或者甘蔗渣酸水解液)按一定比例(發(fā)酵培養(yǎng)基比 例從高到低)混合，組成馴化培養(yǎng)基，使發(fā)酵性絲孢酵母Trichosporon fermentans HWZ003 在馴化培養(yǎng)基中生長。逐步提高木質(zhì)纖維素水解液在馴化培養(yǎng)基中的比例，直到發(fā)酵性絲 孢酵母Trichosporon fermentans HWZ003能夠在含100%木質(zhì)纖維素水解液的馴化培養(yǎng)基 中獲得與發(fā)酵培養(yǎng)基中(木糖120g/L ；蛋白胨1. 8g/L ；酵母粉0. 5g/L)相近的油脂產(chǎn)率。 然后對(duì)該菌株進(jìn)行分離純化，得到能在木質(zhì)纖維素水解液(未經(jīng)預(yù)處理)中高效積累油脂 的目標(biāo)菌株，并且命名為Trichosporon fermentansHWZOCM，該菌株即為上述保藏的發(fā)酵性 絲孢酵母CCTCC M209060菌株。發(fā)酵性絲孢酵母CCTCC M209060菌株具有以下特征菌落呈圓形或者橢圓形，白 色，表面粗糙，因培養(yǎng)條件的不同，有時(shí)候也會(huì)呈粘質(zhì)狀。該菌株在一般培養(yǎng)基上即能存活， 在麥芽汁培養(yǎng)基上生長較快，在限氮培養(yǎng)基中(葡萄糖50 100g/L ；蛋白胨1. 2 2. 4g/L ； 酵母粉 0. 25 0. 75g/L ；MgSO4 ·7Η20 0. 3 0. 6g/L ；KH2PO4 1 3g/L ；MnSO4 .H2O 0. 002 0. 006g/L ；CuSO4 · 5H20 0. 0001 0. 0004g/L)生長有利于油脂積累，該菌株的生長的溫度 范圍為8-40°C，最適為25-28°C。該菌株在pH 4 10之間均可以生長，最適pH值為6. 5 7. 5。此外，該菌株在限氮培養(yǎng)基中發(fā)酵，可得油脂含量35 68%的干菌體，并且該菌株在 脫毒與未脫毒的木質(zhì)纖維素水解液中均能生長，且都有較高的油脂產(chǎn)率，脫毒預(yù)處理后的 油脂產(chǎn)率更高，如在脫毒后的甘蔗渣水解液中有13 18g/L的油脂產(chǎn)率(油脂產(chǎn)率=生物 量X油脂含量，生物量是指菌體干重)。 發(fā)酵性絲孢酵母CCTCC M209060利用木質(zhì)纖維素水解液高效發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂 的應(yīng)用通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。發(fā)酵性絲孢酵母CCTCC M209060利用木質(zhì)纖維素水解液生產(chǎn)微生物油脂的應(yīng) 用，步驟如下將該菌種接種在各種含有不同木質(zhì)纖維素水解液(水解液的還原糖濃度為 90 110g/L)、氮源與無機(jī)鹽的培養(yǎng)基(蛋白胨1. 2 2. 4g/L ；酵母粉0. 25 0. 75g/L ； MgSO4 · 7Η20 0. 3 0. 6g/L ；KH2PO4 1 3g/L ；MnSO4 · H2OO. 002 0. 006g/L ；CuSO4 · 5H20 0. 0001 0. 0004g/L)中，在22 30°C下發(fā)酵培養(yǎng)7 10天；發(fā)酵結(jié)束后通過離心，收集 菌體，經(jīng)有機(jī)溶劑提取方法獲得微生物油脂。在優(yōu)化條件接種量10% (ν/ν)，培養(yǎng)基初始 PH值6. 5，其油脂產(chǎn)率更高。所述有機(jī)溶劑提取方法為按每克干菌體加入IOmL濃度為3. 5 4. 5mol/L HCl, 于80 100°C處理30 60min ；冷卻后按體積比為2 1加入的氯仿和甲醇混合溶劑進(jìn)行 萃取，收集氯仿層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除有機(jī)溶劑，得到微生物油脂。
所述木質(zhì)纖維素酸水解液可以是木質(zhì)纖維素經(jīng)稀酸處理得到的，所述稀酸可以是 稀硫酸、硝酸和磷酸中的一種或幾種。優(yōu)選地，所述木質(zhì)纖維素水解液可以是木質(zhì)纖維素經(jīng)稀酸預(yù)處理得到的酸水解液 再依次經(jīng)Ca(OH)2預(yù)處理、活性炭吸附的脫毒預(yù)處理得到的水解液。優(yōu)選地，所述木質(zhì)纖維素水解液也可以是經(jīng)稀酸預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素再依次經(jīng) 堿預(yù)處理、酶解預(yù)處理后得到的水解液；所述酶為纖維素酶和β-葡萄糖苷酶，并分別按 15FPU/g纖維素和60IU/g纖維素的量添加，酶解溫度48 50°C，酶解時(shí)間3 3. 5天。
所述木質(zhì)纖維素可以是水稻秸稈、小麥秸稈、玉米秸稈等農(nóng)作物秸稈，也可以是甘 蔗渣、硬木或軟木等。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)及有益效果(1)在相同發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖100g/L ；蛋白胨1. 8g/L ；酵母粉0. 5g/L ； MgSO4 · 7H20 0. 4g/L ；KH2PO4 2g/L ；MnSO4 · H2O 0. 004g/L ；CuSO4 · 5H20 0. 0001g/L)中發(fā)酵， 本發(fā)明的發(fā)酵性絲孢酵母CCTCC M209060(油脂產(chǎn)率21.8g/L)與其原始菌株CICC 1368(油 脂產(chǎn)率10. 4g/L)相比，能夠更高效地積累油脂。(2)本發(fā)明的發(fā)酵性絲孢酵母CCTCC M209060能高效利用木質(zhì)纖維素水解液積累 油脂(油脂產(chǎn)率13.0 20. 4g/L)，而原始菌株CICC 1368在木質(zhì)纖維素水解液中的油脂產(chǎn) 率低于10. 4g/L，因此，發(fā)酵性絲孢酵母CCTCCM209060為大規(guī)模廉價(jià)生產(chǎn)微生物油脂提供 了可能。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。 實(shí)施例中所用方法無特別說明均為常規(guī)方法，所有培養(yǎng)基中的溶劑均為水。實(shí)施例1發(fā)酵性絲孢酵母HWZ004菌株的獲得通過多次紫外線誘變以及紫外線與LiCl復(fù)合誘變得到系列誘變發(fā)酵性絲孢酵母 (Trichosporon fermentans)菌株，其中篩選出最優(yōu)的一株命名為發(fā)酵性絲孢酵母HWZ003， 讓其在未經(jīng)任何吸附脫毒的水稻或者甘蔗渣酸水解液中進(jìn)行馴化，得到能在木質(zhì)纖維素水 解液中高效積累油脂的目標(biāo)菌株，命名為發(fā)酵性絲孢酵母HWZ004，具體的誘變與馴化過程 包括以下方法與步驟1)紫外線誘變將發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporon fermentans) CICC1368 (購買 于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)在活化培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨 10g/L)中培養(yǎng)24 30h后稀釋IO5倍，涂布于固體的活化培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L;蛋白胨 10g/L ；酵母粉10g/L，瓊脂0. 2g/L，pH 6. 0)中，在20W紫外燈下30cm處照射30-60秒，整 個(gè)操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。照射后的菌落在28 30°C下避光培養(yǎng)2 3天后檢查生 長情況并進(jìn)一步搖瓶發(fā)酵篩選較優(yōu)菌株。2) LiCl 誘變將發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporon fermentans) CICC 1368 (購買于 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)在活化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 30h后稀釋IO5倍，涂布于已經(jīng) 含有0. 2 0. 6%劑量LiCl的固體YEPD培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L ；蛋白胨10g/L ；酵母粉IOg/ L，瓊脂0. 2g/L，pH 6. 0)中，在28 30°C下培養(yǎng)2 3天后檢查生長情況并進(jìn)一步搖瓶發(fā)酵篩選較優(yōu)菌株。3)復(fù)合誘變將紫外線誘變與LiCl誘變依次應(yīng)用，即將一次或多次紫外誘變后篩 選到的較優(yōu)菌株使用一次或者多次LiCl誘變，每次誘變后在28 30°C培養(yǎng)2 3天后檢 查菌落生長情況并進(jìn)一步搖瓶發(fā)酵得到系列更優(yōu)中間菌株。4)馴化培養(yǎng)將木質(zhì)纖維素水稻秸稈或甘蔗渣粉碎至20目，稱取40g，按照水稻秸 稈或甘蔗渣(固體)與2% (重量)稀硫酸(液體)的固液比為Ig 20mL加入稀硫酸溶 液，于121°C下水解1. 5h，過濾后，用氫氧化鈣把水解液pH調(diào)至堿性(9. 0 11. 0)，過濾后 用硫酸把水解液PH值調(diào)到發(fā)酵pH (6. 0 7. 0)，然后濃縮至所需濃度(還原糖濃度在70 120g/L之間)，得到水解液。該水解液沒有經(jīng)過后續(xù)吸附等任何脫毒預(yù)處理。把發(fā)酵培養(yǎng)基 (木糖120g/L，蛋白胨1. 8g/L ；酵母粉0. 5g/L)與上述沒有經(jīng)過后續(xù)吸附等任何脫毒預(yù)處 理水解液按一定比例(水稻秸稈或甘蔗渣水解液原始量為20%，然后水解液由少到多，之 后到達(dá)100%水稻秸稈或甘蔗渣水解液的比例)混合，組成馴化培養(yǎng)基，使發(fā)酵性絲孢酵母 在馴化培養(yǎng)基中生長(25°C，pH 7. 0)。逐步提高木質(zhì)纖維素水解液在馴化培養(yǎng)基中的比例， 直到發(fā)酵性絲孢酵母在含100%水稻秸稈水解液的馴化培養(yǎng)基中獲得與發(fā)酵培養(yǎng)基(木糖 120g/L ；蛋白胨1. 8g/L ；酵母粉0. 5g/L)中相近的油脂產(chǎn)率(13 16g/L)。從以上誘變中間菌株進(jìn)一步篩選，最終獲得一株發(fā)酵性絲孢酵母菌株，該菌株為 依次經(jīng)過上述1)、2)、3)三種方法復(fù)合誘變得到的最優(yōu)菌株HWZ003。然后將菌株HWZ003按 照上述步驟4)的方法馴化培養(yǎng)得到利用木質(zhì)纖維素水解液高效積累生產(chǎn)微生物油脂的菌 株HWZ004。馴化后獲得的菌株保藏在麥芽瓊脂斜面(該培養(yǎng)基的成分麥芽膏粉130g、瓊 脂15g、氯霉素0. Ig ；該培養(yǎng)基主要用于酵母菌的培養(yǎng)、鑒定及菌種保藏)上，每隔一個(gè)月傳 代一次。該酵母(Trichosporon fermentans)HWZ004已經(jīng)于2009年3月26日在中國典型 培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC M209060。實(shí)施例2 菌株CCTCC M209060高效利用活性炭脫毒后的水稻秸稈酸水解液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)微生 物油脂的應(yīng)用水稻秸稈水解液的制備將水稻秸稈粉碎至20目，稱取40g，按照水稻秸稈(固 體)與2% (重量)稀硫酸(液體)的固液比為Ig 20mL加入稀硫酸溶液，于121°C下水 解lh，過濾后得水稻秸稈酸水解液。水稻秸稈水解液的脫毒預(yù)處理向水稻秸稈酸水解液中加入Ca (OH) 2粉末，調(diào)節(jié)其 pH至10.0，保持Ih后，過濾。用HCl調(diào)節(jié)濾液pH到5. 5，靜置lh，再離心IOmin除去沉淀。 按活性炭與水解液固液比Ig 10mL，將活性炭(ca. 2. 5mm，德國Merck公司)加入所得的 水解液中，在40°C下攪拌處理Ih后過濾除去活性炭。處理后的水解液在減壓條件下，于60°C下濃縮至還原糖濃度為100g/L，然后在還 原糖濃度為100g/L的水解液中添加如下物質(zhì)1. 8g/L的蛋白胨、0. 5g/L的酵母粉、0. 4g/L 的 MgSO4 · 7Η20、2· 0g/L 的 ΚΗ2Ρ04、0· 003g/L 的 MnSO4 ·Η20 和 0. 0001g/LCuS04 · 5H20,用 H2SO4 調(diào)節(jié)pH至6. 5，121°C滅菌20min，制得發(fā)酵培養(yǎng)基。在斜面上挑取3環(huán)發(fā)酵性絲孢酵母CCTCC M209060接種到Y(jié)EPD培養(yǎng)基(葡萄糖 20g/L ；蛋白胨10g/L ；酵母粉10g/L)中進(jìn)行活化，24小時(shí)后以10%的接種量轉(zhuǎn)接到50mL 上述制得的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C、160r/min搖瓶振蕩培養(yǎng)9天，停止發(fā)酵；將發(fā)酵液于4000r/min離心lOmin，收集菌體，用水洗滌后于105°C干燥至恒重，得干菌體34. lg/L。按每克干菌體加入IOmL 4. 5mol/L HCl，于90°C水浴處理40min ；冷卻后加入體積 比為2 1的氯仿和甲醇混合溶劑(30mL)進(jìn)行萃取，收集氯仿層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除 有機(jī)溶劑，得到微生物油脂，生物量36. lg/L，菌體油脂含量為48. 1%，油脂產(chǎn)率17. 4g/L。實(shí)施例3菌株CCTCC M209060高效利用未用活性炭脫毒的水稻秸稈酸水解液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)微 生物油脂的應(yīng)用本實(shí)施例與實(shí)施例2的不同之處在于發(fā)酵培養(yǎng)基所用的木質(zhì)纖維素水解液沒有經(jīng)過任何活性炭或者其他物質(zhì)的吸附 脫毒作用，而培養(yǎng)基中的其他組成與實(shí)施例2中的其他成分完全相同。在斜面上挑取3環(huán)發(fā)酵性絲孢酵母CCTCC M209060接種到Y(jié)EPD培養(yǎng)基(葡萄糖 20g/L ；蛋白胨10g/L ；酵母粉10g/L)中進(jìn)行活化，24小時(shí)后以10%的接種量轉(zhuǎn)接到50mL 上述制得的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C、160r/min搖瓶振蕩培養(yǎng)10天，停止發(fā)酵；將發(fā)酵液于 4000r/min離心lOmin，收集菌體，用水洗滌后于105°C干燥至恒重，得干菌體30. 4g/L。按每克干菌體加入IOmL 4. 5mol/L HCl，于90°C水浴處理40min ；冷卻后加入體積 比為2 1的氯仿和甲醇混合溶劑進(jìn)行萃取(30mL)，收集氯仿層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除有 機(jī)溶劑，得到微生物油脂，生物量31. 8g/L，菌體油脂含量為43. 1%，油脂產(chǎn)率13. 7g/L。實(shí)施例4菌株CCTCC M209060高效利用活性炭脫毒后的甘蔗渣水解液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)微生物油 脂的應(yīng)用本實(shí)施例與實(shí)施例2的不同之處在于水解液的制備所使用的原料是甘蔗渣，而其水解條件與水解液的處理方法，與實(shí) 施例2中的完全相同。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除了使用了甘蔗渣水解液外，其他成分與實(shí)施例 2中的完全相同。在斜面上挑取3環(huán)發(fā)酵性絲孢酵母CCTCC M209060接種到Y(jié)EPD培養(yǎng)基(葡萄糖 20g/L ；蛋白胨10g/L ；酵母粉10g/L)中進(jìn)行活化，24小時(shí)后以10%的接種量轉(zhuǎn)接到50mL 上述制得的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C、160r/min搖瓶振蕩培養(yǎng)8天，停止發(fā)酵；將發(fā)酵液于 4000r/min離心lOmin，收集菌體，用水洗滌后于105°C干燥至恒重，得干菌體36. 6g/L。按每克干菌體加入IOmL 4. 5mol/L HCl，于90°C水浴處理40min ；冷卻后加入體積 比為2 1的氯仿和甲醇混合溶劑進(jìn)行萃取(30mL)，收集氯仿層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除有 機(jī)溶劑，得到微生物油脂，生物量36. 6g/L，菌體油脂含量為47. 8 %，油脂產(chǎn)率17. 5g/L。實(shí)施例5菌株CCTCC M209060高效利用活性炭脫毒后的玉米秸稈酸水解液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)微生 物油脂的應(yīng)用本實(shí)施例與實(shí)施例2的不同之處在于水解液的制備所使用的原料是玉米秸稈。而其水解條件與水解液的處理方法，與 實(shí)施例2中的完全相同。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除了使用了玉米秸稈水解液外，其他成分與實(shí) 施例2中的完全相同。發(fā)酵性絲孢酵母CCTCC M209060在玉米秸稈酸水解液中發(fā)酵9天后獲得生物量
737. 6g/L，菌體油脂含量為46. 7%，油脂產(chǎn)率17. 6g/L。實(shí)施例6菌株CCTCC M209060高效利用活性炭脫毒后的小麥秸稈酸水解液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)微生 物油脂的應(yīng)用本實(shí)施例與實(shí)施例2的不同之處在于水解液的制備所使用的原料是小麥秸稈。而其水解條件與水解液的處理方法，與 實(shí)施例2中的完全相同。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除了使用了小麥秸稈水解液外，其他成分與實(shí) 施例2中的完全相同。發(fā)酵性絲孢酵母CCTCC M209060在小麥秸稈酸水解液中可以在發(fā)酵9天后獲得生 物量38. lg/L，菌體油脂含量為45. 3%，油脂產(chǎn)率17. 3g/L。實(shí)施例7菌株CCTCC M209060高效利用水稻秸稈酶水解液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)微生物油脂的應(yīng)用水稻秸稈酸預(yù)處理將秸稈粉碎至20目，稱取40g，按照水稻秸稈(固體)與2% (重量)稀硫酸(液體)的固液比為Ig IOmL加入稀硫酸溶液，于121°C下水解lh。水稻秸稈堿預(yù)處理將酸預(yù)處理后的秸稈經(jīng)過濾水洗后，按照固液比(水稻秸稈 與NaOH溶液)Ig 6ml加入2% (重量)NaOH溶液，于50°C、160r/min下處理12h。水稻秸稈酶解將經(jīng)過酸、堿預(yù)處理過后的水稻秸稈過濾、水洗和干燥后，按照 15FPU纖維素酶(Sigam-Aldrich公司)/克纖維素和60IU β -葡萄糖苷酶(Novozyme) /克 纖維素的加入量加入兩種酶，于50°C、160r/min下酶解3. 5天。在酶解后水解液(還原糖濃度為100g/L)中添加如下物質(zhì)1. 8g/L的蛋白胨、 0. 5g/L 的酵母粉、0. 4g/L 的 MgSO4 · 7H20、2. Og/L 的 ΚΗ2Ρ04、0· 003g/L 的 MnSO4 · H2O 和 0. 0001g/LCuS04 · 5H20，用 H2SO4 調(diào)節(jié) pH 至 6. 5，121°C滅菌 20min,制得發(fā)酵培養(yǎng)基。在斜面上挑取3環(huán)發(fā)酵性絲孢酵母CCTCC M209060接種到Y(jié)EPD培養(yǎng)基(葡萄糖 20g/L ；蛋白胨10g/L ；酵母粉10g/L)中進(jìn)行活化，24小時(shí)后以10%的接種量轉(zhuǎn)接到50mL 上述制得的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C、160r/min搖瓶振蕩培養(yǎng)9天，停止發(fā)酵；將發(fā)酵液于 4000r/min離心lOmin，收集菌體，用水洗滌后于105°C干燥至恒重，得干菌體35. 7g/L。按每克干菌體加入IOmL 4. 5mol/L HCl，于90°C水浴處理40min ；冷卻后加入體積 比為2 1的氯仿和甲醇混合溶劑進(jìn)行萃取(30mL)，收集氯仿層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除有 機(jī)溶劑，得到微生物油脂，生物量35. 7g/L，菌體油脂含量為57. 1 %，油脂產(chǎn)率20. 4g/L。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
8
權(quán)利要求
一種發(fā)酵性絲孢酵母菌株，其特征在于，所述菌株是發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporon fermentans)HWZ004，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC M209060，保藏日期為2009年3月26日。
2.權(quán)利要求1所述的發(fā)酵性絲孢酵母菌株在利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物 油脂中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述發(fā)酵性絲孢酵母菌株接種于含木 質(zhì)纖維素水解液的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于22 30°C下發(fā)酵培養(yǎng)7 10天，然后制備干菌體，再 從干菌體中提取微生物油脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述含木質(zhì)纖維素水解液的發(fā)酵培養(yǎng)基 是在還原糖濃度為90 110g/L的木質(zhì)纖維素水解液中添加如下物質(zhì)蛋白胨1. 2 2. 4g/ L、酵母粉 0. 25 0. 75g/L、MgS04 ·7Η20 0· 3 0. 6g/L,KH2PO4I 3g/L、MnS04 .H2O 0. 002 0. 006g/L、CuSO4 · 5H20 0. 0001 0. 0004g/L,調(diào)節(jié) pH 至 6. 5 7. 5，經(jīng)滅菌后制得的
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述木質(zhì)纖維素水解液是木質(zhì)纖維素經(jīng) 稀酸處理得到的。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述木質(zhì)纖維素水解液是木質(zhì)纖維素經(jīng) 稀酸預(yù)處理得到的酸水解液再依次經(jīng)Ca(OH)2預(yù)處理、活性炭吸附的脫毒預(yù)處理得到的水 解液。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述木質(zhì)纖維素水解液是經(jīng)稀酸預(yù)處 理后的木質(zhì)纖維素再依次經(jīng)堿預(yù)處理、酶法水解后得到的水解液；所述酶為纖維素酶和 β -葡萄糖苷酶，酶解溫度48 50°C，酶解時(shí)間3 3. 5天。
8.根據(jù)權(quán)利要求2至6任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述木質(zhì)纖維素是水稻秸 稈、小麥秸稈、玉米秸稈、甘蔗渣、硬木或軟木。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵性絲孢酵母菌株接種量為10% ν/ν,發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值6. 5。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述從干菌體中提取微生物油脂是通過 離心與細(xì)胞破碎，然后按每克干菌體加入IOmL濃度為3. 5 4. 5mol/L HCl，于80 100°C 處理30 60min;冷卻后按體積比2 1加入氯仿和甲醇的混合溶劑進(jìn)行萃取，收集氯仿 層，減壓蒸餾去除有機(jī)溶劑，得到微生物油脂。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種發(fā)酵性絲孢酵母及該酵母利用木質(zhì)纖維素水解液生產(chǎn)微生物油脂的方法。本發(fā)明以發(fā)酵性絲孢酵母CICC 1368為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外線誘變，再經(jīng)紫外線與LiCl的復(fù)合誘變，通過發(fā)酵篩選得到高產(chǎn)菌株，所得菌株在木質(zhì)纖維素水解液中進(jìn)行馴化，最終得到能在木質(zhì)纖維素水解液中高效積累油脂的油脂酵母菌株CCTCC M209060。該菌株不僅比原始菌株的油脂產(chǎn)率高，而且在含較高濃度抑制劑的木質(zhì)纖維素水解液中也能高效積累油脂，為廉價(jià)、高效、大規(guī)模地生產(chǎn)微生物油脂提供了可能。
文檔編號(hào)C12R1/645GK101967452SQ201010281869
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者吳虹, 宗敏華, 黃超 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)