專利名稱：甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)tt16基因家族及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)及其親本 物種白菜(Brassica rapa)和甘藍(lán)(Brassica oleracea) TT16 (TRANSPARENT TESTA16，透 明種皮 16 ；又稱 ABS，ARABIDOPSIS BSISTER ；或 AGL32，AGAM0US-LIKE 32)基因家族及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
十字花科(Brassicaceae)的蕓薹屬(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和觀賞 植物品種，為人類提供營養(yǎng)價值豐富的食用油、蔬菜和觀賞植物，并為畜牧業(yè)提供飼料，具 有重要的經(jīng)濟價值。在蕓薹屬物種中，異源四倍體物種甘藍(lán)型油菜是由2個二倍體物種白 菜和甘藍(lán)通過種間雜交后再加倍而形成的。甘藍(lán)型油菜是世界第二大油料作物，在全世界 廣泛種植，栽培面積和產(chǎn)量僅次于大豆。白菜和甘藍(lán)也是重要的油料、蔬菜和觀賞作物。對 甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)功能基因的比較基因組學(xué)研究將為揭示它們之間的 遺傳進化關(guān)系提供理論基礎(chǔ)，并為蕓薹屬作物的性狀改良提供應(yīng)用基礎(chǔ)。籽粒顏色是甘藍(lán)型油菜的重要性狀之一。甘藍(lán)型油菜黃籽品系具有種皮薄、皮殼 率低、粗纖維含量低、含油量高、餅粕蛋白含量高等優(yōu)點，與黑籽品系相比，餅粕的經(jīng)濟價值 和油的品質(zhì)都有所提高。雖然白菜和甘藍(lán)中均存在表型穩(wěn)定的天然黃籽基因型，但自然界 中不存在天然的甘藍(lán)型油菜黃籽基因型。已有的甘藍(lán)型油菜黃籽材料主要通過遠(yuǎn)緣雜交等 方式而創(chuàng)造，存在黃籽率和黃籽度不高，表型不穩(wěn)定，易受環(huán)境影響而變異，選育效率低，育 種周期長，負(fù)相關(guān)性狀難以克服等缺點，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)要求。因此，獲得穩(wěn)定遺傳的甘 藍(lán)型油菜黃籽性狀成為甘藍(lán)型油菜育種的重要目標(biāo)。長期以來，全世界眾多研究者對該性 狀進行了廣泛研究，但到目前為止對于黃籽性狀形成的分子機理仍不清楚，更沒有通過轉(zhuǎn) 基因分子育種創(chuàng)造黃籽性狀的任何報道。類黃酮物質(zhì)是廣泛存在于植物界的次生代謝物質(zhì)，是植物組織中紅色、藍(lán)色和紫 色等花青素苷色素的呈色物質(zhì)。擬南芥(Arabidopsis thaliana)等植物種皮色素的主 要成分為原花青素(proanthocyanidin，PA)單體的聚合物，其是經(jīng)公共苯丙烷途徑-類 黃酮途徑-原花青素途徑合成的。目前的研究表明，類黃酮生物合成的調(diào)控是由轉(zhuǎn)錄因 子的協(xié)同作用來完成的，而這些轉(zhuǎn)錄因子表達的時空特性受到精密調(diào)控。已知WD40、MYB、 bHLH、MADS-box、WRKY和bZIP轉(zhuǎn)錄因子都參與了類黃酮途徑的調(diào)控，其中MADS_box (TT16)、 WRKY(TTG2)和bZIP(TTl)轉(zhuǎn)錄因子在此途徑中的作用還沒有徹底明確。蕓薹屬和擬南芥同 屬十字花科，具有較近的親緣關(guān)系。擬南芥TT16(AtTT16)基因編碼MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，研 究發(fā)現(xiàn)其對于BAN基因的表達和原花青素在內(nèi)種皮中的積累是必需的。擬南芥ttl6突變 體表現(xiàn)為透明種皮即黃籽性狀，且內(nèi)種皮細(xì)胞變得不規(guī)則，推測該基因可能還參與調(diào)控內(nèi) 種皮細(xì)胞分化和發(fā)育，但具體作用和機制尚不清楚。因此，在蕓薹屬中對TT16基因進行同 源克隆和功能鑒定，是篩選甘藍(lán)型油菜黃籽位點的重要途徑。
蕓薹屬和擬南芥起源于同一祖先，約在1700 1800萬年前發(fā)生分離，蕓薹族植物 發(fā)生了基因組水平的三倍化，即蕓薹屬基本種白菜(AA組，529Mbp)、甘藍(lán)(CC組，696Mbp) 和黑芥(BB組，632Mbp)等的基因組約相當(dāng)于擬南芥基因組(157Mbp)的3倍，而甘藍(lán)型油 菜(AACC組，1132Mbp)的基因組相當(dāng)于甘藍(lán)和白菜兩個基因組之和，約相當(dāng)于擬南芥基因 組的6倍，也就是說，在擬南芥中為單拷貝的基因在甘藍(lán)和白菜中可能分別有3個對應(yīng)的拷 貝，而在甘藍(lán)型油菜中可能有6個拷貝。目前對TT16基因的研究報道較少，而TT16基因在 甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)等蕓薹屬物種中的成員數(shù)、蛋白特征、進化關(guān)系、表達的組織特異性 及與黃籽性狀的關(guān)系等都未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT16
基因家族。為達到上述目的，本發(fā)明采用cDNA末端快速擴增(RACE)技術(shù)，分別克隆了甘藍(lán)型 油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT16基因家族成員的全長cDNA和對應(yīng)的基因組序列，并進 行了系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示所述白菜TT16(BrTT16)基因家族包括以下3個成員BrTT16_l基因、BrTT16_2基 因和BrTT16-3基因；所述BrTT16_l基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 2所示，BrTT16_2 基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 4所示，BrTT16_3基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 6 所示；所述甘藍(lán)TT16(BoTT16)基因家族包括以下3個成員BoTT16_l基因、BoTT16_2基 因和BoTT16-3基因；所述BoTT16-l基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 8所示，BoTT16_2 基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 10所示，BoTT16_3基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 12所示；所述甘藍(lán)型油菜TT16(BnTT16)基因家族包括以下6個成員ΒηΤΤ16-1基因、 ΒηΤΤ16-2 基因、ΒηΤΤ16_3 基因、ΒηΤΤ16_4 基因、ΒηΤΤ16_5 基因和 ΒηΤΤ16_6 基因；所述 ΒηΤΤ16-1基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 14所示，BnTT16_2基因的全長cDNA序列如 SEQ ID No. 16所示，BnTT16_3基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 18所示，BnTT16_4基因 的全長cDNA序列如SEQ ID No. 20所示，BnTT16_5基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 22 所示，BnTT16-6基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 24所示。進一步，所述BrTT16-l基因的基因組序列如SEQ ID No. 1所示，BrTT16_2基因的 基因組序列如SEQ ID No. 3所示，BrTT16-3基因的基因組序列如SEQ ID No. 5所示；所述BoTT16-l基因的基因組序列如SEQ ID No. 7所示，BoTT16_2基因的基因組 序列如SEQ ID No. 9所示，BoTT16-3基因的基因組序列如SEQ ID No. 11所示；所述BnTT16-l基因的基因組序列如SEQ ID No. 13所示，ΒηΤΤ16_2基因的基因組 序列如SEQ ID No. 15所示，ΒηΤΤ16_3基因的基因組序列如SEQ ID No. 17所示，ΒηΤΤ16_4 基因的基因組序列如SEQ ID No. 19所示，ΒηΤΤ16_5基因的基因組序列如SEQ ID No. 21所 示，ΒηΤΤ16-6基因的基因組序列如SEQ ID No. 23所示。上述3個物種的12條ΤΤ16基因與AtTT16基因具有較高的同源性，基因組序列一 致性為67. 1 70. 3%，編碼區(qū)序列一致性為82. 9 87. 0%，編碼蛋白的氨基酸序列的一致性和相似性分別為73. 0 78. 2%和78. 2 85. 7 %，核酸水平和氨基酸水平的序列比 對、系統(tǒng)發(fā)生聚類等方面都表明，它們是AtTT16基因的垂直同源基因。這3個物種的12條 TT16基因之間也具有很高的同源性，基因組序列一致性為69. 4 100. 0%，編碼區(qū)序列一 致性為85. 2 100. 0%，編碼蛋白的氨基酸序列的一致性和相似性分別為75. 1 100%和 80. 4 100% ；其中，甘藍(lán)型油菜的BnTT16-l、BnTT16-4、BnTT16-6基因分別來源于白菜的 BrTT16-l、BrTT16-2、BrTT16_3 基因，而甘藍(lán)型油菜的 BnTT16_2、ΒηΤΤ16_3、ΒηΤΤ16_5 基因 分別來源于甘藍(lán)的 ΒοΤΤ16-1、ΒοΤΤ16-2、ΒοΤΤ16-3 基因。BnTT16、BrTT16、BoTT16 基因家族 保持了與AtTT16基因類似的器官特異性，主要在生殖器官中表達，以花和發(fā)育中的種子表 達最高，并隨著種子的發(fā)育進程而逐漸下降。此外，TT16基因在甘藍(lán)型油菜和白菜的黑籽 與黃籽材料中的表達存在著較明顯的差異，而在甘藍(lán)的黑籽與黃籽材料中無明顯差異，說 明甘藍(lán)型油菜和白菜的黃籽性狀與TT16基因表達下調(diào)有關(guān)，而甘藍(lán)的黃籽性狀與TT16基 因幾乎沒有關(guān)系。基于上述結(jié)果，利用本發(fā)明的BnTT16、BrTT16、BoTT16基因家族中的任一種或多 種基因或基因截短片段，可以構(gòu)建TT16基因重組表達載體和轉(zhuǎn)化體，用于TT16基因的正義 表達、反義抑制、RNA干擾等。本發(fā)明的目的之二在于提供所述甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT16基因 家族在蕓薹屬作物種子性狀的分子育種中的應(yīng)用。進一步，所述甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT16基因家族在甘藍(lán)型油菜 黃籽性狀的分子育種中的應(yīng)用。為達到上述目的，本發(fā)明選取甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT16基因家 族特異保守保守區(qū)段BTT16I(核苷酸序列如SEQ ID No. 14中第353 966位堿基所示)為 RNA干擾片段，以基于PTOC5941改造的植物RNA干擾基礎(chǔ)載體pFGC5941M為骨架，將BTT16I 分別以反義和正義方式同時插入ρΚΧ5941Μ的CaMV35S啟動子和OCS終止子之間形成反向 重復(fù)序列，構(gòu)建了蕓薹屬TT16基因家族RNA干擾載體preC5941M-BTT16I，并通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn) 化法轉(zhuǎn)化了甘藍(lán)型油菜典型黑籽品種中雙10號，所得陽性轉(zhuǎn)基因植株的性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)，通 過RNA干擾沉默BnTTie基因家族后，轉(zhuǎn)基因植株的背景性狀正常，轉(zhuǎn)基因種子明顯變小且 種皮色素明顯減少，多數(shù)呈黃褐色和黃棕色，與非轉(zhuǎn)基因種子的典型黑籽形成鮮明對比。說 明在甘藍(lán)型油菜等植物中，TT16基因同時調(diào)控種子大小發(fā)育、種皮色素積累等性狀的形成， 可以應(yīng)用于蕓薹屬作物種子性狀的分子育種，尤其是甘藍(lán)型油菜黃籽性狀的分子育種，利 于創(chuàng)造出新型的甘藍(lán)型油菜黃籽材料，也可以超量表達后用于增加種子的大小，提高種子 千粒重。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了 TT16基因在甘藍(lán)型油菜及其親本物種白 菜和甘藍(lán)中的成員數(shù)、各成員的全長cDNA序列和基因組序列、編碼蛋白特征、進化關(guān)系、表 達的組織特異性等，并確認(rèn)了 TT16基因家族同時參與種子大小的發(fā)育和種皮色素的積累， 由此本發(fā)明提供了 TT16基因在蕓薹屬作物種子性狀改良特別是甘藍(lán)型油菜黃籽性狀的分 子育種中的應(yīng)用，應(yīng)用前景好。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)描述，其中圖 1 為 BnTT16 (A)、BrTT16 (B)、B0TTI6 (C)基因家族 5，cDNA 末端的擴增。圖 2 為 BnTT16 (A)、BrTT16 (B)、B0TTI6 (C)基因家族 3，cDNA 末端的擴增。圖3為BnTT16(A)、BrTT16(B)、BoTT16(C)基因家族成員全長cDNA的擴增，其 中1采用引物組合FBT16-l+RBT16-2，2采用引物組合FBT16-3+RBT16-4，3采用引物組合 FBT16-5+RBT16-6。圖4為BnTTie (A)、BrTT16 (B)、BoTTie(C)基因家族成員基因組DNA的擴增，其 中1采用引物組合FBT16-l+RBT16-2，2采用引物組合FBT16-3+RBT16-4，3采用引物組合 FBT16-5+RBT16-6。圖5為BrTT16、B0TTI6、BnTT16基因家族成員及AtTT16基因mRNA的序列比對。圖6為BrTT16、BoTT16、BnTT16家族蛋白及AtTT16蛋白的氨基酸序列比對。圖7為肚1716、801716、8111716基因家族成員與六忖116基因1111 離的聚類分析。圖8為BrTT16、BoTT16、BnTT16家族蛋白與AtTT16蛋白的聚類分析。圖9為BrTT16、B0TTI6、BnTT16基因家族成員的Southern雜交鑒定，其中M為地 高辛標(biāo)記的分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖10為BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族總體和成員的器官特異性表達檢測。圖11為白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜的黑籽、黃籽材料主要生殖器官中TT16基因家族 總體和成員的表達。圖12為RNA干擾片段BTT161的PCR擴增。圖13為RNA干擾載體pFGC5941M_BTT16I的結(jié)構(gòu)圖。圖14為RNA干擾載體PreC5941M_BTT16I構(gòu)建中的酶切和PCR鑒定，其 中 A 為 Swa I+Aat11 雙酶切 pMD19-T_BTT16I，M 為 DNA marker, CK 代表酶切前的 PMD19-T-BTT16I ；B 為 Swa I+Aat11 雙酶切 pFGC5941M, M 為 DNA marker, CK 代表酶切前 的 pFGC5941M ；C 為 pFGC5941M_BTT16IA 的克隆子菌液 PCR 檢測；D 為 BamH I+Xba I 雙酶 切 pMD19-T-BTT16I, M 為 DNA marker, CK 代表酶切前的 pMD19-T_BTT16I ；E 為 BamH I+Xba I 雙酶切 pFGC5941M-BTT16IA ；M 為 DNAmarker，CK 代表酶切前的 pFGC5941M_BTT16IA ；F 為 PFGC5941M-BTT16I 的克隆子菌液 PCR 檢測，M 為 DNA marker 圖15為再生植株的Basta復(fù)檢鑒定，其中CK為非轉(zhuǎn)基因植株，1-3為再生植株。圖16為再生植株的PCR檢測結(jié)果，其中M為DNA marker, CK為陽性對照，1為陰 性對照，2-15為再生植株。圖17為轉(zhuǎn)基因種子(左)和非轉(zhuǎn)基因種子(右)的比較。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實施例中未注明 具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。優(yōu)選實施例采用的植物材料白菜材料均來自于白菜型油菜亞種(B.rapa ssp. oleifera)，包括黑籽系09L597和黃籽系09L600 ；甘藍(lán)材料均來自于羽衣甘藍(lán)變種 (B. oleracea var. acephala)，包括黑籽系09L598和黃籽系09L599 ；甘藍(lán)型油菜材料包括黑籽系5B和籽色近等基因系(黑籽系09L588、黃籽系09L587)，均由重慶市油菜工程技術(shù) 研究中心選育和大田常規(guī)種植，并經(jīng)過了 10代以上的單花序套袋自交；甘藍(lán)型油菜黑籽品 種中雙10號由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油菜作物所選育，種子由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心提供。優(yōu)選實施例采用的試劑Easy-Taq DNA聚合酶[5U/ μ 1，附10 X PCR Buffer (含 Mg2+)]購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；LA Taq DNA聚合酶[5U/μ 1，附10XLA PCR Buffer II (含Mg2+)]、λ-HindIII DNA marker等購自寶生物工程(大連)有限公司；限制 性內(nèi)切酶DraI、EcoRI、EcoRV, HindIII、尼龍膜、地高辛標(biāo)記的DNA marker等購自立陶宛 MBI Fermentas公司；pMD19_T載體購自寶生物工程(大連)有限公司，MS (Murashige and Skoog medium)培養(yǎng)基購自荷蘭Duchefa公司，結(jié)冷膠購自浙江中肯生物科技有限公司，其 它分子、生化和植物組織培養(yǎng)試劑購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和上海稼豐園 藝用品有限公司；改進型植物RNA干擾基礎(chǔ)載體PTOC5941M是在pTOC5941的基礎(chǔ)上改進而 成，改進之處是采用來自甘藍(lán)型油菜的BnPAP2基因第2內(nèi)含子(BnPAP2I2)替換pTOC5941 上過長的PhChsA間隔區(qū)，并在間隔區(qū)與啟動子間增加一個AatII切點。優(yōu)選實施例采用的試劑盒小量植物組織RNA抽提試劑盒(W7021)購自上海華舜 生物工程有限公司，小量膠回收試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)mego公司，PMD19-T載體連 接試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，GeneRacer Kit購自美國Invitrogen公司，PCR DIG ProbeSynthesis Kit、DIG Easy Hyb>DIG Wash and Block Buffer Set、DIG Nucleic Acid Detection Kit 均購自德國 Roche 公司，RNA PCR Kit(AMV) Ver. 3.0 購自寶生物工程 (大連)有限公司。一、甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT16基因家族的克隆1、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)基因組總DNA的提取取大田常規(guī)條件下栽培的甘藍(lán)型油菜5B、白菜09L597和甘藍(lán)09L598的嫩葉，采用 十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因組總DNA，采用電泳法和分光光度法評價核酸樣 品的質(zhì)量和濃度。1. 0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，提取的3個物種的基因組總DNA完整性 好，平均分子量均大于λ -HindIII DNA Marker的23kb條帶，RNA消化比較完全，經(jīng)分光光 度法檢測純度較高，可以直接用于PCR擴增及Southern雜交。2、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)各器官總RNA的提取取大田常規(guī)條件下栽培的甘藍(lán)型油菜5B、白菜09L597和甘藍(lán)09L598的蕾(Bu)、 花(Fl)以及4個發(fā)育階段的種子[甘藍(lán)型油菜和甘藍(lán)取開花后15天(15D)、30天(30D)、45 天(45D)和55天(55D)的種子；白菜取開花后10天(IOD)、25天(25D)、40天(40D)和45 天(45D)的種子]；以及大田常規(guī)條件下栽培的甘藍(lán)型油菜09L587和09L588、白菜09L597 和 09L600、甘藍(lán) 09L598 和 09L599 的根(Ro)、下胚軸(Hy)、子葉(Co)、莖(St)、葉(Le)、蕾、 花、莢果皮(SP)以及4個發(fā)育階段的種子(甘藍(lán)型油菜和甘藍(lán)取15D、30D、45D和55D的種 子；白菜取10D、25D、40D和45D的種子)共12個器官；采用小量植物總RNA抽提試劑盒提 取各器官總RNA，采用電泳法和分光光度法評價核酸樣品的質(zhì)量和濃度。1. 0%瓊脂糖凝膠 電泳結(jié)果顯示，獲得的總RNA特征條帶清晰，且無明顯RNA降解和DNA污染，經(jīng)分光光度法 檢測純度較高，能夠滿足RACE操作的基本要求。3、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)RACE第一鏈cDNA的獲得
分別取甘藍(lán)型油菜5B、白菜09L597和甘藍(lán)09L598的蕾、花和4個發(fā)育階段的種 子的總RNA混合成總量為5 μ g的RNA樣品，采用GeneRacer Kit按其說明書進行一系列的 RACE操作，最終反轉(zhuǎn)錄獲得在3’端和5’端同時錨定有人工接頭序列的第一鏈cDNA，PCR 放大后進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，三個物種的第一鏈cDNA呈現(xiàn)出大小在 200bp IOkb的拖帶，重心區(qū)域在500bp 4kb，最核心區(qū)在1. 5kb左右，說明反轉(zhuǎn)錄比較 完全，得到了較高質(zhì)量的總cDNA，可用于克隆甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TT16基因家族完整 的cDNA末端。4、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TT16基因家族5’ cDNA末端的克隆根據(jù)AtTT16基因序列多重比對的結(jié)果，設(shè)計了對應(yīng)于兩個最保守點的反向引物R TT16-50(5，-ggatcgttttgaagattaggctgagcaag-3，)和 RBT16RT(5，-gctcgtgtggaggaatgga gg-3’)。分別以白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜第一鏈cDNA為模板，用GeneRacer Kit提供的引物 5，P (5，-cgactggagcac-gaggacactga-3，)與 RTT16-50 配對,進行 5，cDNA 末端的 RACE — 擴。50 μ 1 標(biāo)準(zhǔn) Taq PCR 擴增體系為10 X PCR Buffer 5. 0 μ 1，25mmol/L 的 MgCl23. 0 μ 1， 10mmol/L 的 dNTPs 1.0 μ 1，10 μ mol/L 的正向引物 1. 0 μ 1，10 μ mol/L 的反向引物 1. 0 μ 1， 5U/ μ 1的Taq酶0. 5 μ 1，模板0. 5 μ 1，加雙蒸水至總體積為50 μ 1。PCR擴增循環(huán)參數(shù)為 94°C預(yù)變性2分鐘；再94°C變性1分鐘，52 °C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，共30個循環(huán)； 最后72°C延伸10分鐘。以一擴產(chǎn)物為模板，用 GeneRacer Kit 提供的引物 5’NP (5’-ggacactgacatggactg a-aggagta-3，)與RBT16RT配對，進行5，cDNA末端的RACE巢擴，PCR擴增體系與一擴相同 但模板改為0. 1 μ 1，PCR擴增循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性2分鐘；再94°C變性1分鐘，58°C退 火1分鐘，72°C延伸1分鐘，共25個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物進行1. 0%瓊脂 糖凝膠電泳檢測(圖1)，采用小量膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段，與PMD19-T載體連接，再轉(zhuǎn) 化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素(Amp)、IPTG和Χ-gal的LB平板培養(yǎng)至 藍(lán)白斑清晰，挑取白斑單菌落，用含有Amp的LB液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，取菌液進行PCR檢 測，結(jié)果陽性克隆子表現(xiàn)出明顯的長度多態(tài)性，各挑選10個具有代表性的陽性克隆子委托 上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進行測序。測序結(jié)果表明BrTT16基因家族的5’ cDNA末 端介于429 681bp之間，B0TTI6基因家族的5，cDNA末端介于448 658bp之間，BnTT16 基因家族的5，cDNA末端介于526 649bp之間。NCBI BLASTn表明，這些5，cDNA末端與 AtTT16/ABS mRNA(AJ318098)具有很高的一致性，表明它們的確為蕓薹屬TT16基因家族的 5’ cDNA 末端。5、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TT16基因家族3’ cDNA末端的克隆根據(jù)AtTT16基因序列多重比對的結(jié)果，設(shè)計了對應(yīng)于兩個最保守點的正向引物 FTT16-30(5，-tgagctctct(g/a)ttctctg(c/t)gatgc-3，)和 FTT16_3N(5，-ctcacatcggtctc atcgtcttctc-3')。分別以白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜第一鏈cDNA為模板，用GeneRacer Kit提 供的弓丨物 3，P(5，-gctgtcaacga-tacgctacgtaacg-3，)與 FTT16-30 配對，進行 3，cDNA 末 端的RACE—擴。PCR擴增體系和擴增循環(huán)參數(shù)與5’ cDNA末端的RACE—擴相同。以一擴產(chǎn)物為模板，用GeneRacer Kit提供的引物3’ N P (5，-cgctacgtaacggcatgacagtg-3，)與 FTT16-3N 配對，進行 3，cDNA 末端的 RACE 巢擴， PCR擴增體系和擴增循環(huán)參數(shù)與5’ cDNA末端的RACE巢擴相同。PCR產(chǎn)物如前法所述進行電泳檢測(圖2)、膠回收、PMD19-T載體克隆、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、陽性克隆子篩選、 菌液PCR鑒定和測序。測序結(jié)果表明BrTT16基因家族的3，cDNA末端介于778 853bp 之間，B0TTI6基因家族的3，cDNA末端介于733 936bp之間，BnTT16基因家族的3，cDNA 末端介于687 820bp之間[均不包括poly (A)]。NCBI BLASTn表明，這些3，cDNA末端與 AtTT16/ABS mRNA基因具有很高的一致性，表明它們的確為蕓薹屬TT16基因家族的3’cDNA 末端。6、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TT16基因家族成員全長cDNA的克隆根據(jù)BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族5，和3，cDNA末端的測序結(jié)果，設(shè)計了 3條 正向引物和3條反向引物(表1)，得到3對引物組合:FBT16-l+RBT16-2、FBT16-3+RBT16-4、 FBT16-5+RBT16-6 ；分別以白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜第一鏈cDNA為模板，采用上述引物組合 和50 μ 1標(biāo)準(zhǔn)Taq PCR擴增體系，擴增BnTT16、BrTT16、B0TTI6基因家族各成員的全長 cDNA，PCR擴增循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性2分鐘，再94°C變性1分鐘、54 57°C退火1分鐘、 72°C延伸2分鐘，共35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；再如前法所述進行電泳檢測(圖3)、 膠回收、PMD19-T載體克隆、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、陽性克隆子篩選、菌液PCR鑒定和測 序。表lBrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族成員全長cDNA的擴增引物
引物名稱引物序列(5’—3’)核苷酸數(shù)(nt)解鏈溫度(°c)FBT16-1ggatccgagaaagtctgattaagcatattattccc3561.80/67.01FBT16-3ggatccaaaagcaacttatagatgtatatatgtaagg3759.35/64.68FBT16-5ggatccacacacgctatacacacggagtta3062.86/68.73RBTl 6-2CCCggggatgatgaatgattattatgattaatataatC3856.96/64.69RBT16-4cccggggatggctagttaatcatataatcaagacc3561.80/69.36RBTl 6-6CCCgggagatgtaatgatgattgattatataattaaag3856.96/64.69 結(jié)果以白菜第一鏈總cDNA為模板，引物組合分別為FBNA10-6+RBRA10-10、 FBT16-3+RBT16-4、FBT16-5+RBT16-6，各擴增得到 1 條長度分別為 1060bp、1242bp、1123bp 的全長 cDNA，分別命名為 BrTT16-lmRNA、BrTT16_2mRNA 和 BrTT16_3mRNA。 以甘藍(lán)第一鏈總cDNA為模板，引物組合分別為FBNA10-6+RBRA10-10、 FBT16-3+RBT16-4、FBT16-5+RBT16-6，各擴增得到 1 條長度分別為 1087bp、1028bp、1134bp 的全長 cDNA，分別命名為 BoTT16-lmRNA、BoTT16_2mRNA 和 BoTT16_3mRNA。
以甘藍(lán)型油菜第一鏈總cDNA為模板，引物組合為FBT16-1+RBT16-2，擴增得到2條 長度分別為1060bp和1084bp的全長cDNA，分別命名為BnTT16_lmRNA和BnTT16_2mRNA ；引 物組合為FBT16-3+RBT16-4，擴增得到2條長度分別為1214bp和1243bp的全長cDNA，分別 命名為BnTTl6-3mRNA和BnTT16_4mRNA ；引物組合為FBT16-5+RBT16-6，擴增得到2條長度 分別為 1128bp 和 1123bp 的全長 cDNA，分別命名為 BnTT16_5mRNA 和 BnTT16_6mRNA。VectorNTI Advance 9. 0 多重比對表明，所得的 BnTT16、BrTT16、BoTT16 基因家族 的全長cDNA均有相應(yīng)的RACE末端克隆子序列與之對應(yīng)，說明它們均是可轉(zhuǎn)錄表達的基因。 多重比對還表明，3個物種中RACE末端所指示的各獨立基因均已獲得了對應(yīng)的全長cDNA。7、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TT16基因家族成員基因組DNA的克隆
9
根據(jù)BrTT16、B0TTI6、BnTT16基因家族成員全長cDNA的序列多重比對結(jié) 果，設(shè)計檢測各成員的特異引物組合FBT16-1S+RBT16-12S、FBT16-2S+RBT16-12S、 FBT16-34S + RBT16-3S、FBT 1 6 - 34 S + RBT16-4 S、FBT16 - 56 S + RBT16 - 5 S、 FBT16-56S+RBT16-6S (表 2)；根據(jù) BrTT16、BoTT16、BnTT16 基因家族 RACE 末端和全長 cDNA 的克隆結(jié)果，分別以白菜09L597、甘藍(lán)09L598、甘藍(lán)型油菜5B的基因組總DNA為模板，采用 上述全長cDNA的擴增引物組合和50 μ 1標(biāo)準(zhǔn)Taq PCR擴增體系進行相同PCR，擴增ΒηΤΤ16、 BrTT16、BoTT16基因家族各成員的基因組DNA，再如前法所述進行電泳檢測(圖4)、膠回收、 PMD19-T載體克隆、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、陽性克隆子篩選、菌液PCR鑒定和特異引物 鑒定(用上述特異引物組合進行梯度PCR)，最后測序。表2檢測BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族成員的特異引物
權(quán)利要求
甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT16基因家族，其特征在于所述白菜TT16基因家族包括以下3個成員BrTT16 1基因、BrTT16 2基因和BrTT16 3基因；所述BrTT16 1基因的全長cDNA序列如SEQ ID No.2所示，BrTT16 2基因的全長cDNA序列如SEQ ID No.4所示，BrTT16 3基因的全長cDNA序列如SEQ ID No.6所示；所述甘藍(lán)TT16基因家族包括以下3個成員BoTT16 1基因、BoTT16 2基因和BoTT16 3基因；所述BoTT16 1基因的全長cDNA序列如SEQ ID No.8所示，BoTT16 2基因的全長cDNA序列如SEQ ID No.10所示，BoTT16 3基因的全長cDNA序列如SEQ ID No.12所示；所述甘藍(lán)型油菜TT16基因家族包括以下6個成員BnTT16 1基因、BnTT16 2基因、BnTT16 3基因、BnTT16 4基因、BnTT16 5基因和BnTT16 6基因；所述BnTT16 1基因的全長cDNA序列如SEQ ID No.14所示，BnTT16 2基因的全長cDNA序列如SEQ ID No.16所示，BnTT16 3基因的全長cDNA序列如SEQ ID No.18所示，BnTT16 4基因的全長cDNA序列如SEQ ID No.20所示，BnTT16 5基因的全長cDNA序列如SEQ ID No.22所示，BnTT16 6基因的全長cDNA序列如SEQ ID No.24所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT16基因家族，其特征 在于所述BrTT16-l基因的基因組序列如SEQ ID No. 1所示，BrTT16_2基因的基因組序列 如SEQ ID No. 3所示，BrTT16-3基因的基因組序列如SEQ ID No. 5所示；所述BoTT16-l基因的基因組序列如SEQ ID No. 7所示，BoTT16_2基因的基因組序列 如SEQ ID No. 9所示，BoTT16-3基因的基因組序列如SEQ ID No. 11所示；所述BnTT16-l基因的基因組序列如SEQ ID No. 13所示，ΒηΤΤ16_2基因的基因組序列 如SEQ ID No. 15所示，ΒηΤΤ16_3基因的基因組序列如SEQ ID No. 17所示，ΒηΤΤ16_4基因 的基因組序列如SEQ ID No. 19所示，ΒηΤΤ16_5基因的基因組序列如SEQ ID No. 21所示， ΒηΤΤ16-6基因的基因組序列如SEQ ID No. 23所示。
3.含有權(quán)利要求1或2所述甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)ΤΤ16基因家族中任 一種或多種基因或基因截短片段的重組表達載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為含有甘藍(lán) 型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)ΤΤ16基因家族特異保守片段ΒΤΤ16Ι的RNA干擾載體，所 述ΒΤΤ16Ι片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 14中第353 966位堿基所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述RNA干擾載體是將ΒΤΤ16Ι 片段分別以反義和正義方式同時插入改進型植物RNA干擾基礎(chǔ)載體PTOC5941M的CaMV35S 啟動子和OCS終止子之間形成反向重復(fù)序列而得到。
6.含有權(quán)利要求3或4或5所述重組表達載體的轉(zhuǎn)化體。
7.權(quán)利要求1或2所述甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT16基因家族在蕓薹屬 作物種子性狀的分子育種中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT16基因家族的應(yīng)用，其 特征在于所述蕓薹屬作物種子性狀的分子育種為甘藍(lán)型油菜黃籽性狀的分子育種。
全文摘要
本發(fā)明公開了甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT16基因家族及其應(yīng)用，其中白菜TT16基因家族包括BrTT16-1基因、BrTT16-2基因和BrTT16-2基因，甘藍(lán)TT16基因家族包括BoTT16-1基因、BoTT16-2基因和BoTT16-3基因，甘藍(lán)型油菜TT16基因家族包括BnTT16-1基因、BnTT16-2基因、BnTT16-3基因、BnTT16-4基因、BnTT16-5基因和BnTT16-6基因；上述基因家族可應(yīng)用于蕓薹屬作物種子性狀的分子育種。
文檔編號C12N5/10GK101942455SQ20101028190
公開日2011年1月12日 申請日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月15日
發(fā)明者呂俊, 周清元, 李加納, 柴友榮, 諶利, 閆楠, 雷波, 馬麗娟, 馬赑 申請人:西南大學(xué)