專(zhuān)利名稱(chēng)：制備基因工程菌株的方法及生產(chǎn)藤黃綠菌素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的菌株及利用該菌株生產(chǎn)抗生素的方法，具體 是一種制備基因工程菌株的方法及生產(chǎn)藤黃綠菌素的方法。
背景技術(shù)：
假單胞菌(Pseudomonas sp. )M18是從上海郊區(qū)甜瓜根際分離篩選到的一株重要 的植物根際促生假單胞菌株，它能分泌一種聚酮類(lèi)抗生素-藤黃綠菌素(Huang XQ, etal. Identification and characterization of pltZ, a gene involved in therepression of pyoluteorin biosynthesis in Pseudomonas sp. M18. FemsMicrobiology Letters 2004,232:197 202)。藤黃綠菌素由一個(gè)間苯二酚環(huán)(起源于聚酮生物合成)和一個(gè)氯 化的吡咯環(huán)的部分結(jié)構(gòu)共同組成，具有廣譜活性，能抑制細(xì)菌和真菌，特別是抑制卵菌屬真 菌如終極腐霉等，可用于除草(Haas D, Defago G, Biological control of soi 1-borne pathogens by fluorescent pseudomonads. NatureReviews Microbiology 2005,3:307 319)。離體培養(yǎng)皿生物測(cè)定顯示，藤黃綠菌素對(duì)各種農(nóng)作物真菌性病原菌特別是對(duì)水稻紋 枯病菌、腐霉和疫霉等具有高效的廣譜抑菌作用。藤黃綠菌素在自然界中易降解、無(wú)殘留， 是一種高效、安全、低毒、低殘留、環(huán)保型的微生物源農(nóng)藥。假單胞菌(Pseudomonas sp.)M18 野生型分泌的藤黃綠菌素濃度非常低，不適合規(guī)?；墓I(yè)生產(chǎn)。為了進(jìn)一步提高藤黃綠 菌素產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)藤黃綠菌素的產(chǎn)業(yè)化，迫切需要大幅度提高藤黃綠菌素的發(fā) 酵效價(jià)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種制備基因工程菌株的方法及生 產(chǎn)藤黃綠菌素的方法。利用本發(fā)明制備的PqsR基因阻斷工程菌M18PRG，每升發(fā)酵液中，藤 黃綠菌素的發(fā)酵效價(jià)約為150毫克，與現(xiàn)有技術(shù)相比發(fā)酵效價(jià)提高了 3 4倍，該工程菌可 為進(jìn)一步構(gòu)建多基因高產(chǎn)工程菌株應(yīng)用于微生物源農(nóng)藥生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，第一方面，本發(fā)明涉及一種基因工程菌株的制備方法，包括如下步驟步驟一，從假單胞菌(Pseudomonas sp. )M18的總基因組DNA中克隆pqsR基因；步驟二，將pqsR基因亞克隆至攜帶抗生素抗性基因的質(zhì)粒，得重組質(zhì)粒；步驟三，在pqsR基因中插入抗生素抗性基因，構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒；步驟四，將重組自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，之后與假單胞菌(Pseudomonas sp.) M18野生型菌株雙親雜交；步驟五，利用含有步驟三所述抗生素的培養(yǎng)基和含有步驟二所述抗生素的培養(yǎng)基 進(jìn)行篩選，得到能在含步驟三所述抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，且在含步驟二所述抗生素的培 養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的菌株，即得基因工程菌株。步驟二中，所述質(zhì)粒為pEX18Tc、pEX18Gm或pEX18Ap。
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優(yōu)選地，所述質(zhì)粒為pEX18Tc。步驟二中，所述抗生素抗性基因?yàn)樗沫h(huán)素抗性基因、慶大霉素抗性基因或氨芐青 霉素抗性基因。優(yōu)選地，所述抗生素抗性基因?yàn)閼c大霉素抗性基因。步驟三中，所述抗生素抗性基因?yàn)閼c大霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因。步驟四中，所述大腸桿菌為大腸桿菌SM10。步驟五中，所述培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。第二方面，本發(fā)明還涉及利用前述基因工程菌株生產(chǎn)藤黃綠菌素的方法，包括如 下步驟步驟一，培養(yǎng)基因工程菌株，得發(fā)酵液；步驟二，提純發(fā)酵液，得藤黃綠菌素。步驟一中，所述培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基具體為該培養(yǎng)基的pH為7. 5，1L培養(yǎng)基的組分 為蛋白胨 20g，甘油 15mL，MgSO4 1. 5g，K2HPO4O. 3g，余量為水。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明克隆了假單胞菌 (Pseudomonas sp. )M18中強(qiáng)烈抑制藤黃綠菌素生物合成的負(fù)調(diào)控基因pqsR、阻斷了 pqsR 基因的功能，構(gòu)建了基因工程菌M18PRG，利用本發(fā)明制備的pqsR基因阻斷工程菌M18PRG， 每升發(fā)酵液中，藤黃綠菌素的發(fā)酵效價(jià)約為150毫克，與現(xiàn)有技術(shù)相比發(fā)酵效價(jià)提高了 3 4倍，該工程菌可為進(jìn)一步構(gòu)建多基因高產(chǎn)工程菌株應(yīng)用于微生物源農(nóng)藥生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明涉及的假單胞菌(Pseudomona sp. )M18菌株已在專(zhuān)利號(hào)為ZL 00119857. 2 的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利中公開(kāi)。


圖1為用于pqsR基因雙交換的重組自殺質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；圖2為pqsR基因阻斷工程菌M18PRG與假單胞菌(Pseudomonas sp. )M18野生型 菌株的藤黃綠菌素產(chǎn)量的HPLC定量測(cè)定圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，例如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例pqsR基因阻斷工程菌M18PRG的構(gòu)建及發(fā)酵生產(chǎn)藤黃綠菌素步驟一，pqsR基因的克隆(1)根據(jù)LysR家族調(diào)控蛋白PqsR編碼基因保守序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)從假 單胞菌M18基因組模板中擴(kuò)增包含pqsR基因的DNA片段。引物 1:5' -TAT AGA ATT CAC ATG CCG GCA TGC CAG-3‘，帶下劃線(xiàn)的堿基為 EcoRI酶切位點(diǎn)；引物 2:5' -TAA TAA GCT TTG GCC GAT GCC GAT GGC-3‘，帶下劃線(xiàn)的堿基為HindIII酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系(50 μ L) 10 X高保真DNA聚合酶緩沖液5 μ L，dNTP (2. 5mmol/ L) 4 μ L，引物1和引物2各1 μ L，模板DNA 3 μ L，高保真酶(5U/ μ L) 0. 2 μ L，重蒸水 35. 8 μ L0 PCR 反應(yīng)條件94°C 5min ;30 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)具體為94°C 40s，65°C 1. 5min, 72°C 90s ；之后72°C IOmin0染色體DNA提取采用UNIQ-10柱式基因組DNA抽提試劑盒(上 海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。(2)回收1. 5-kb的包含pqsR基因的PCR產(chǎn)物，委托英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行 DNA測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn)，所測(cè)序列中包含一個(gè)999-bp的開(kāi)放閱讀框(SEQID NO :1)，編碼一個(gè)大 小為332個(gè)氨基酸的細(xì)菌LysR家族調(diào)控蛋白(SEQID NO :2)。(3)包含pqsR基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和HindIII雙酶切后，克隆經(jīng) EcoR I 和 HindIII 雙酶切處理的 pEX18Tc 質(zhì)粒(Hoang TT, Karkhoff-Schweizer RR, et al.Abroad-host-range Flp-FRT recombination system for site-specific excision ofchromosomally-located DNA sequences !application for isolation of unmarkedPseudomonas aeruginosa mutants. Gene 1998, 212 :77 86),此重組質(zhì)粒命名為 pEXTc-pqsR。步驟二，pqsR基因的阻斷(l)pqsR基因中有一個(gè)BamHI位點(diǎn)(位于ATG下游第77個(gè)核苷酸)，將含有pqsR基 因的重組質(zhì)粒pEXTc-pqsR用BamHI酶切，回收；同時(shí)將慶大霉素抗性基因Gnf用BamH I從 ρUCGm(Keen NT,Tamaki S,et al. Improved broad-host-range plasmids for DNAcloning in gram-negative bacteria. Gene 1988,70 191 197)酶切得到 0. 85-kb 的片段，回收； 用T4DNA連接酶連接該兩段DNA片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選正確 的轉(zhuǎn)化子，得到用于pqsR雙交換的重組自殺質(zhì)粒，命名為pEXTcPRG(圖1)；(2)將含有 pqsR: Gmr 重組質(zhì)粒 pEXTcPRG 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 SMlO (Sambrook J, WatsonRD. Molecular Cloning -.a Laboratory Manual. 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY Cold Spring Harbor Laboratory，2001)，將其作為供體菌，假單胞菌(Pseudomonassp.) M18野生型作為受體菌。37 0C USOrpm的條件下分別過(guò)夜培養(yǎng)供體菌和受體菌，各自取500 μ L的菌液 10000rpm/min離心lmin，棄上清；分別用ImL的LB培養(yǎng)基(每升LB培養(yǎng)基含胰蛋白 胨IOg,酵母粉5g，NaCl IOg,相應(yīng)固體培養(yǎng)基加15g瓊脂粉 ’參考Sambrook J，Watson RD. Molecular Cloning -.a Laboratory Manual. 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY :Cold Spring Harbor Laboratory, 2001)洗一次；之后，讓兩種菌混合并懸浮于100 μ L的LB培 養(yǎng)基中。吸取混合菌液點(diǎn)于中央放有一片圓形細(xì)菌微孔濾膜的無(wú)抗生素的LB固體培養(yǎng)皿 中，37°C下培養(yǎng)18 24小時(shí)。刮取上述菌體稀釋于ImL的LB培養(yǎng)基中，涂布于含有40ug/ml慶大霉素篩選平 板，培養(yǎng)24小時(shí)后觀察結(jié)果。挑取單菌落，用滅菌牙簽挑取單一克隆同時(shí)分別點(diǎn)于含慶大 霉素(Gm，40ug/ml)與四環(huán)素(Tet，125ug/ml)的平板進(jìn)行篩選。重組自殺質(zhì)粒pEXTcPRG轉(zhuǎn) 入假單胞菌(Pseudomonas sp. )M18菌株后，不能在染色體外自主復(fù)制，其攜帶的pqsR: :Gmr 突變基因與受體菌M18的染色體發(fā)同源重組。在含四環(huán)素的平板上不生長(zhǎng)而在含慶大霉 素的平板上生長(zhǎng)的相應(yīng)克隆表明已發(fā)生雙交換，即獲得假單胞菌(Pseudomona sp.)M18的pqsR基因阻斷工程菌，命名為M18PRG。(3)抽提pqsR基因阻斷工程菌的染色體DNA，以假單胞菌(Pseudomonas sp. )M18 野生型染色體DNA作為對(duì)照，用引物 1(5' -TAT AGA ATT CAC ATG CCG GCA TGC CAG-3‘) 和引物 2(5' -TAA TAA GCT TTG GCC GAT GCC GAT GGC-3 ‘)進(jìn)行 PCR、酶切、測(cè)序驗(yàn)證。 pqsR基因阻斷工程菌的PCR產(chǎn)物較野生型的PCR產(chǎn)物大0. 85_kb ；通過(guò)BamHI酶切、DNA測(cè) 序進(jìn)一步驗(yàn)證pqsR基因阻斷工程菌M18PRG是正確的。步驟三，pqsR基因阻斷工程菌M18PRG發(fā)酵生產(chǎn)藤黃綠菌素的HPLC分析將pqsR基因阻斷工程菌M18PRG和假單胞菌(Pseudomonas sp. )M18野生 型菌株分別培養(yǎng)在 KMB 培養(yǎng)基(Kin EO，Ward MK，Raney DE，Two simple media for thedemonstration of pyocyanin and fluorescin. J. Lab. Clin. Med. 1954,44 301 ~ 307) 中，于28°C、220rpm搖床振蕩培養(yǎng)。定時(shí)取樣，利用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定樣品中藤黃 綠菌素的濃度。藤黃綠菌素發(fā)酵用KMB培養(yǎng)基(每升)蛋白胨20g，甘油15mL，MgS041.5g， K2HPO4O. 3g, pH 7.5。藤黃綠菌素的HPLC分析取200 μ L發(fā)酵菌液，加200 μ L乙酸乙酯進(jìn) 行抽提，離心取100 μ L上清，真空干燥，溶于100 μ L甲醇中，取5 μ L進(jìn)行C18反相高效液相 色譜(HPLC)分析，檢測(cè)條件檢測(cè)波長(zhǎng)308nm，保留時(shí)間為3. lmin，流動(dòng)相為70%甲醇，流 速lmL/min，探測(cè)范圍為0.01。以藤黃綠菌素純品作為標(biāo)樣。藤黃綠菌素產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖 2。藤黃綠菌素產(chǎn)量HPLC分析結(jié)果表明，pqsR基因阻斷工程菌M18PRG的藤黃綠菌素產(chǎn)量 與野生型菌相比提高了 3 4倍，pqsR基因阻斷工程菌的藤黃綠菌素產(chǎn)量峰值為149 μ g/ mL而野生型的峰值僅為37. 5 μ g/mL。
權(quán)利要求
一種基因工程菌株的制備方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，從假單胞菌M18的總基因組DNA中克隆pqsR基因；步驟二，將pqsR基因亞克隆至攜帶抗生素抗性基因的質(zhì)粒，得重組質(zhì)粒；步驟三，在pqsR基因中插入抗生素抗性基因，構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒；步驟四，將重組自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，之后與假單胞菌M18野生型菌株雙親雜交；步驟五，利用含有步驟三所述抗生素的培養(yǎng)基和含有步驟二所述抗生素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，得到能在含步驟三所述抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，且在含步驟二所述抗生素的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的菌株，即得基因工程菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌株的制備方法，其特征是，步驟二中，所述質(zhì)粒為 pEX18Tc、pEX18Gm 或 pEX18Ap。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因工程菌株的制備方法，其特征是，所述質(zhì)粒為pEXISTc。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌株的制備方法，其特征是，步驟二中，所述抗生素 抗性基因?yàn)樗沫h(huán)素抗性基因、慶大霉素抗性基因或氨芐青霉素抗性基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因工程菌株的制備方法，其特征是，所述抗生素抗性基因 為慶大霉素抗性基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌株的制備方法，其特征是，步驟三中，所述抗生素 抗性基因?yàn)閼c大霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌株的制備方法，其特征是，步驟四中，所述大腸桿 菌為大腸桿菌SM10。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌株的制備方法，其特征是，步驟五中，所述培養(yǎng)基 為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌株生產(chǎn)藤黃綠菌素的方法，其特征在于，包 括如下步驟步驟一，培養(yǎng)基因工程菌株，得發(fā)酵液；步驟二，提純發(fā)酵液，得藤黃綠菌素。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)藤黃綠菌素的方法，其特征是，步驟一中，所述培養(yǎng) 使用的培養(yǎng)基具體為該培養(yǎng)基的PH為7. 5，IL培養(yǎng)基的組分為蛋白胨20g，甘油15mL， MgSO4L 5g，K2HPO4O. 3g，余量為水。
全文摘要
一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的制備基因工程菌株的方法及生產(chǎn)藤黃綠菌素的方法；制備所述菌株的方法包括如下步驟從假單胞菌(Pseudomona sp.)M18的總基因組DNA中克隆pqsR基因；將pqsR基因亞克隆至攜帶抗生素抗性基因的質(zhì)粒，得重組質(zhì)粒；在pqsR基因中插入抗生素抗性基因，構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒；將重組自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，之后與假單胞菌(Pseudomonas sp.)M18野生型菌株雙親雜交，抗性篩選，即得基因工程菌株；利用前述基因工程菌株生產(chǎn)藤黃綠菌素的方法，包括如下步驟培養(yǎng)基因工程菌株，得發(fā)酵液；提純發(fā)酵液，得藤黃綠菌素。利用本發(fā)明制備的基因工程菌株使得藤黃綠菌素的發(fā)酵效價(jià)約為150毫克，與現(xiàn)有技術(shù)相比發(fā)酵效價(jià)提高了3～4倍。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101948790SQ20101028243
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月3日
發(fā)明者許煜泉, 黃顯清 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)