專利名稱：仔豬大腸埃希氏菌K88ac-K99-ST₁-LT_B四價基因工程滅活疫苗生產(chǎn)用菌株及其構(gòu)建方法 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及仔豬大腸埃希氏菌黃痢病疫苗技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是仔豬大腸埃希 氏菌KSSac-Kgg-ST1-LIe四價基因工程滅活疫苗生產(chǎn)用菌株及其構(gòu)建方法和滅活疫苗生產(chǎn) 方法。
背景技術(shù)：
產(chǎn)腸毒素性大腸埃希氏菌(ETEC)的致病力主要依靠產(chǎn)生粘著素和腸毒素兩類毒 力因子。經(jīng)試驗證明在ETEC的致病機制上粘著素和腸毒素缺一不可，粘著素是ETEC感染的 首要致病因子，是促進菌細(xì)胞在腸道內(nèi)定居的先決條件，已知來源于豬的ETEC主要有K88、 K99、987P和F41四種，其中以K88ac、K99居多；腸毒素是導(dǎo)致宿主腹瀉的直接致病因子，包 括耐熱性腸毒素ST1和不耐熱腸毒素LT兩種。現(xiàn)已證實ST1為18或19個氨基酸的小肽， 100°C加熱30分鐘仍保持活性，沒有免疫原性。目前國內(nèi)應(yīng)用的疫苗有K88-K99雙價基因工程滅活苗，K88、K99、987P四價全菌 體苗等。洪孟民、陳章水等于1985年前后構(gòu)建了含Κ88和Κ99抗原基因的大腸埃希氏菌， 將這種雙價基因工程菌株用于制備預(yù)防仔豬腹瀉的疫苗，在妊娠母豬產(chǎn)前21d左右注射該 K88-K99雙價基因工程疫苗，母豬分娩后初乳中存在K88、K99高效價抗體，仔豬吮吸初乳 后，能夠有效地阻止大腸埃希氏菌的感染。此后，1990年黃培堂等構(gòu)建了 K88ac-LTB雙價基 因工程菌株，也取得了較好的免疫效果，但是他們均沒有解決ST的免疫原性這一難題，所 以疫苗效力有限，不能完全預(yù)防仔豬大腸埃希氏菌性腹瀉。由于ST免疫原性極差，難以制備有效的疫苗進行預(yù)防，為了增強ST的免疫原性， 八十年代FRANTZ等將ST偶聯(lián)到載體蛋白上，加上福氏佐劑免疫動物(母豬和母牛)可以 產(chǎn)生抗體，新生動物對產(chǎn)腸毒素性大腸埃希氏菌的攻擊有保護作用。這提示將ST連接載體 蛋白，使ST成為全抗原，可以引起免疫系統(tǒng)對ST的免疫應(yīng)答。九十年代CLEMENTS(1990) 和⑶ZMEN-GERDUZC0等(1990)人致力于ST1與LTB基因融合研究，他們分別將ST1基因融 合到LTB結(jié)構(gòu)基因的上游或下游，最后得到了一株重組菌株，該重組菌可表達具有ST1和 LTB兩種抗原性的融合蛋白，這一成果使該方面的研究提高到一個新的水平；國外AITKEN 等(1993)采用ST1前體(Pre-ST1)構(gòu)建了 pre-STfLTB融合基因，動物實驗觀察到了表達 的融合蛋白具有免疫原性，并引起免疫應(yīng)答，且融合蛋白ST1毒性下降；許崇波等(1994)構(gòu) 建成了 Pre-ST1-LacZ融合基因，對其表達的融合蛋白進行了免疫原性研究，結(jié)果表明，免疫 的小白鼠產(chǎn)生的抗體具有中和天然ST1毒性的能力，這表明LacZ蛋白已賦予了 ST1免疫原 性，而且無ST1毒性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種克服上述缺 點，菌苗抗原成份能達到緩慢釋放、能更有效地預(yù)防仔豬黃痢的仔豬大腸埃希氏菌KSSac-Kgg-ST1-Lie四價基因工程滅活疫苗生產(chǎn)用菌株及其構(gòu)建方法和滅活疫苗生產(chǎn)方法。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種仔豬大腸埃希氏菌KSSac-Kgg-ST1-Lie四價基因工程滅活疫苗生產(chǎn)用菌株 BL21(DE3) (pXKKSL)，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰 西1號院3號，中科院微生物研究所，菌種保藏編號CGMCC No. 3491，建議的分類命名大腸 埃希氏菌(Escherichia coli)。一種仔豬大腸埃希氏菌KSSac-Kgg-ST1-Lie四價基因工程滅活疫苗生產(chǎn)用菌 株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟:A1、設(shè)計并合成4對PCR引物P1-P8 =Pl (C ATGCCATGGCATTTACTGACTATGAAG)、P2 (CCGGAATTCGGGAGAATATCATTTCTTGA)用于從大腸 埃希氏菌 C83902 質(zhì)粒中擴增 K88ac 抗原基因；P3 (CCGGAATTCAGATCTTGGGCAGGCTGCT)、 P4(CCGGAATTCATATAAGTGACTAAGAA)用于從大腸埃希氏菌C83539質(zhì)粒中擴增K99抗原基 因；P5 (CCGGAATTCAGATCTTTCTTCAAAAG)、P6 (ATAGGATCCCTATAGCACCCGGTACAAG)用于從大 腸埃希氏菌 C83902 質(zhì)粒中擴增 Pre-ST1 抗原基因；P7 (GCGGATCCTCTAGAGTCAATTCGAGCT)、 P8 (ATAGGATCCTCTAGAGTCAATTCGAGCT)用于從大腸埃希氏菌C83902質(zhì)粒中擴增LTb抗原 基因；所述PCR擴增程序為總體積為50 μ L，其中5 μ LlO倍反應(yīng)緩沖液，IOng質(zhì)粒DNA， 200ymol/L dNTPs，引物各 250ng，3U Taq DNA 聚合酶，按 94°C 60s — 50°C 60s — 72°C 90s 的溫度轉(zhuǎn)換模式，共進行30個循環(huán)；A2、將PCR產(chǎn)物分別進行酶切，將ST1突變基因融合在 LTb抗原基因的上游，然后將K88ac抗原基因融合在ST1-LTb融合基因的上游，再將K99抗 原基因插入在K88ac抗原基因和ST1突變基因的中間，構(gòu)建了融合基 因；A3、最后將構(gòu)建的融合基因插入到表達載體pET-28b相應(yīng)的酶切位 點上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒PXKKSL，通過氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入到受體菌BL21 (DE3)中，構(gòu)建了含 K88ac-K99-STrLTB融合基因表達載體的基因工程菌株BL21 (DE3) (pXKKSL)。一種仔豬大腸埃希氏菌KSSac-Kgg-STfLiB四價基因工程滅活疫苗的生產(chǎn)方法， 其特征是(1)把凍干菌種BL21 (DE3) (pXKKSL)用LB培養(yǎng)基制成一級種子、二級種子和生產(chǎn) 用三級種子；(2)將三級種子按2 5%的量接種于發(fā)酵罐中，進行通氣培養(yǎng)，通氣量3 4V/ MIN，50%滅菌葡萄糖調(diào)節(jié)PH值，調(diào)節(jié)范圍7. 2 .8，37°C培養(yǎng)18 24H ；(3)收獲的菌液添加滅活劑10%甲醛溶液至終濃度0. 4 0. 6%，37°C滅活48h ；(4)按50億活菌苗/mL比例加入氫氧化鋁膠和菌液，并按終濃度0. 01 %添加 1 2%硫柳汞溶液，磨制2分鐘，裝入大瓶子，沉淀后棄上清或添加生理鹽水，然后裝入分 裝筒，混勻，調(diào)PH6. 8 7. 2，制成含20%氫氧化鋁膠的佐劑菌苗，菌苗成品含BL21 (DE3) (pXKKSL)菌 50 億個 /mL。所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于，在培養(yǎng)過程中可以添加誘導(dǎo)劑0. lmmol/L異丙 基_硫代-d-半乳糖苷(IPTG)或0. lg/L乳糖。所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于，其特征在于，所述LB培養(yǎng)基的配方蒸餾水 lOOOmL，蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化鈉5g，用2mol/L氫氧化鈉調(diào)pH7. 6 7. 8，加入 適量消泡劑，116°C滅菌40分鐘，保存?zhèn)溆?。采用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了含有1(88肌-1(99-51\-1^融合基因的重組表達質(zhì)粒pXKKSL，并將構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至受體菌BL21 (DE3)中，動物試驗證實，構(gòu)建的基因 工程菌株表達的KSSac-Kgg-ST1-LIe融合蛋白沒有毒性且具有良好的免疫原性。本發(fā)明研制的大腸埃希氏菌四價基因工程疫苗，將使得由產(chǎn)腸毒素性大腸埃希氏 菌引起的仔豬黃痢的免疫預(yù)防問題得到有效的解決，大幅度地減少養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟損失，具 有廣闊的市場前景。待工業(yè)化生產(chǎn)后，該四價基因工程滅活苗每頭份成本為0.2元，而市場 價在0. 5 1. 0元左右，因母豬每年產(chǎn)仔豬2次，實際上每年國內(nèi)市場需要7000萬頭份，如 果按每年銷售3000萬頭份，每年可實現(xiàn)純利潤1800萬元，經(jīng)濟效益巨大。另外，更重要一 點是，該基因工程疫苗屬于I類安全生物制品，對環(huán)境是十分安全的，不存在任何的環(huán)境污 染，不會對環(huán)境造成任何破壞，還可減少抗生素使用帶來的藥物殘留問題，保護人類健康， 具有較高的社會效益。


圖1為含K88AC-K99-ST1-LTB融合基因的表達載體酶切鑒定圖；其中1 :LTb基因雙酶切鑒定；2 =STl基因雙酶切鑒定；3 :K99基因雙酶切鑒定；4 K88AC 基因雙酶切鑒定；M :TRANS2K II DNA MARKER(50 00，3000，2000，1000，750，500，250， 100)。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖和具體實施例，對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。實施例1一種仔豬大腸埃希氏菌KSSac-Kgg-ST1-LIe四價基因工程滅活疫苗生產(chǎn)用菌株 BL21 (DE3) (pXKKSL)，菌種保藏編號CGMCC No. 3491。本發(fā)明的這種新型基因工程滅活苗生產(chǎn)用菌株，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和基因 突變技術(shù)，從大腸埃希氏菌C83902質(zhì)粒中擴增出K88ac、Pre-ST1和LTb基因，從大腸埃希氏 菌C83539質(zhì)粒中擴增出K99基因。采用DNA重組技術(shù)和基因融合技術(shù)，將這四個基因連接 成KSSac-Kgg-ST1-LIe融合基因并插入pET-28b載體上，然后轉(zhuǎn)化至受體BL21 (DE3)中，構(gòu) 建了含1(88肌-1(99-51\-1^四價保護性抗原基因的基因工程菌株BL21 (DE3) (pXKKSL)(菌種 保藏號CGMCC No. 3491)，該菌株表達的有效抗原成份在菌體內(nèi)部，能達到緩慢連續(xù)釋放的 作用，克服了目前市場上使用的大腸埃希氏菌菌苗的缺點。該基因工程菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后， 用0.4%甲醛滅活，并輔以氫氧化鋁膠制成基因工程滅活苗。K88ac-K99-STrLTB融合基因表達質(zhì)粒pXKKSL的基因結(jié)構(gòu)式
權(quán)利要求
一種仔豬大腸埃希氏菌K88ac K99 ST1 LTB四價基因工程滅活疫苗生產(chǎn)用菌株BL21(DE3)(pXKKSL)，菌種保藏編號CGMCC No.3491。
2.一種仔豬大腸埃希氏菌KSSac-Kgg-ST1-LIe四價基因工程滅活疫苗生產(chǎn)用菌 株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟:Al、設(shè)計并合成4對PCR引物P1-P8 =Pl (C ATGCCATGGCATTTACTGACTATGAAG)、P2 (CCGGAATTCGGGAGAATATCATTTCTTGA)用于從大腸 埃希氏菌 C83902 質(zhì)粒中擴增 K88ac 抗原基因；P3 (CCGGAATTCAGATCTTGGGCAGGCTGCT)、 P4 (CCGGAATTCATATAAGTGACTAAGAA)用于從大腸埃希氏菌C83539質(zhì)粒中擴增K99抗原基 因；P5 (CCGGAATTCAGATCTTTCTTCAAAAG)、P6 (ATAGGATCCCTATAGCACCCGGTACAAG)用于從大 腸埃希氏菌 C83902 質(zhì)粒中擴增 Pre-ST1 抗原基因；P7 (GCGGATCCTCTAGAGTCAATTCGAGCT)、 P8 (ATAGGATCCTCTAGAGTCAATTCGAGCT)用于從大腸埃希氏菌C83902質(zhì)粒中擴增LTb抗原基 因；所述PCR擴增程序為總體積為50 μ L，其中5 μ L 10倍反應(yīng)緩沖液，IOng質(zhì)粒DNA， 200ymol/L dNTPs，引物各 250ng，3U Taq DNA 聚合酶，按 94°C 60s — 50°C 60s — 72°C 90s 的溫度轉(zhuǎn)換模式，共進行30個循環(huán)；A2、將PCR產(chǎn)物分別進行酶切，將ST1突變基因融合在LTb抗原基因的上游，然后將 K88ac抗原基因融合在ST1-LTb融合基因的上游，再將K99抗原基因插入在K88ac抗原基因 和ST1突變基因的中間，構(gòu)建了 KSSac-Kgg-ST1-LIe融合基因；A3、最后將構(gòu)建的融合基因插入到表達載體pET-28b相應(yīng)的酶切 位點上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒PXKKSL，通過氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入到受體菌BL21 (DE3)中，構(gòu)建了含 K88ac-K99-STrLTB融合基因表達載體的基因工程菌株BL21 (DE3) (pXKKSL)。
3.一種仔豬大腸埃希氏菌KSSac-Kgg-ST1-Lie四價基因工程滅活疫苗的生產(chǎn)方法，其 特征是(1)把凍干菌種BL21(DE3) (pXKKSL)用LB培養(yǎng)基制成一級種子、二級種子和生產(chǎn)用三 級種子；(2)將三級種子按2 5%的量接種于發(fā)酵罐中，進行通氣培養(yǎng)，通氣量3 4V/MIN， 50%滅菌葡萄糖調(diào)節(jié)PH值，調(diào)節(jié)范圍7. 2 .8，37°C培養(yǎng)18 24H ；(3)收獲的菌液添加滅活劑10%甲醛溶液至終濃度0.4 0. 6%，37°C滅活48H ；(4)按50億活菌苗/ML比例加入氫氧化鋁膠和菌液，并按終濃度0.01%添加1 2% 硫柳汞溶液，磨制2分鐘，裝入大瓶子，沉淀后棄上清或添加生理鹽水，然后裝入分裝筒，混 勻，調(diào)PH6. 8 7. 2，制成含20 %氫氧化鋁膠的佐劑菌苗，菌苗成品含BL21 (DE3) (PXKKSL) 菌50億個/ML。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于，在培養(yǎng)過程中可以添加誘導(dǎo)劑 0. lmmol/L異丙基-硫代-D-半乳糖苷(IPTG)或0. lg/L乳糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于，其特征在于，所述LB培養(yǎng)基的配方 蒸餾水lOOOmL，蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化鈉5g，用2mol/L氫氧化鈉調(diào)pH7. 6 7. 8， 加入適量消泡劑，116°C滅菌40分鐘，保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明公開了種仔豬大腸埃希氏菌K88ac-K99-ST1-LTB四價基因工程滅活疫苗生產(chǎn)用菌株BL21(DE3)(pXKKSL)，菌種保藏編號CGMCC No.3491。還公開了其構(gòu)建方法和疫苗生產(chǎn)方法。采用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了含有K88ac-K99-ST1-LTB融合基因的重組表達質(zhì)粒pXKKSL，并將構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至受體菌BL21(DE3)中，動物試驗證實，構(gòu)建的基因工程菌株表達的K88ac-K99-ST1-LTB融合蛋白沒有毒性且具有良好的免疫原性。
文檔編號C12N15/62GK101955905SQ20101028278
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月16日
發(fā)明者衛(wèi)廣森, 才學(xué)鵬, 竇永喜, 許崇波 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所