專利名稱：乳腺癌分子標志物相關探針的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及乳腺癌分子標志物相關探針的制備方法，還涉及利用這些探針制備乳腺癌熒光原位雜交檢測試劑盒，本發(fā)明的乳腺癌分子標志物相關探針及相應的試劑盒可以用于確定乳腺癌的類型，特別是可用于指導乳腺癌個體化治療方案的制定，評價治療效果、 監(jiān)測復發(fā)和轉移、估價預后等。
背景技術：
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7% 10%，僅次于宮頸癌。流行病學調查發(fā)現(xiàn)，5% 10%的乳腺癌是家族性的，有明顯的家族遺傳傾向。在40 60歲間、絕經期前后的婦女發(fā)病率較高。在我國，婦女乳腺癌發(fā)病率正逐年上升，并且顯示出年輕化趨勢。與30年前相比，我國乳腺癌死亡率上升了 34. 1 %，其中城市上升了 38. 8 %，它正以每年3 % 4%的速度遞增，死亡率已經排在女性癌癥死亡率之首。造成這一結果的原因，除早期診斷率低外，與治療方式的合理選擇密切相關。臨床上對于乳腺癌的治療手段較多，包括手術治療、放射治療、化學治療、內分泌治療、免疫治療和生物靶向治療等。一般在治療過程中會根據(jù)乳腺癌的臨床分期，選擇不同的治療方案。隨著分子生物學技術、醫(yī)療技術水平和臨床研究水平的發(fā)展提高，越來越多的研究表明，各種治療方案的效果和不同藥物的療效在不同個體間均存在明顯差異。腫瘤異質性、耐藥性，藥物反應性、療效的差異給治療帶來很多困難。因此，利用分子生物學檢測 (Albertson, D. G. ,2006. Gene amplification in cancer. Trends Genet. 22 (8),447-455. Albertson, D. G. , Collins, C. , McCormick, F. , Gray, J. W. , 2003. Chromosome aberrations in solid tumors. Nat. Genet. 34(4) :369-376.)對患者進行分別評估，根據(jù)不同分子分型制定不同治療方案，實行個體化診療，對于提高診療效果，減少復發(fā)率，降低死亡率都極具意義；同時也能夠避免將一些昂貴的藥物用于所有患者，從而有效控制醫(yī)療費用。目前，國外在乳腺癌的個體化治療方面取得很大成就，相應的檢測手段已經常規(guī)開展。而國內受各方面條件限制，個體化診療才剛剛起步，國內現(xiàn)狀主要表現(xiàn)在檢測方法滯后，缺少相應的分子診斷試劑，相關標志物的診斷試劑依賴進口，試劑價格高，很難在檢測人群中普及。本發(fā)明根據(jù)乳腺癌分子標志物的研究成果和美國臨床腫瘤學會(ASCO)推薦指標，選擇了以下四個指標的染色體作為乳腺癌檢測靶標來制備基因探針①HER2。 HER2(Human epidermal growth factor receptor-2,也禾爾 erbB2, c_erbB2, HER-2/neu), 編碼表皮生長因子受體蛋白2，屬酪氨酸激酶受體家族，HER2在20 30%的原發(fā)性乳腺浸潤性導管癌中有基因的擴增和蛋白的過度表達，是一個重要的臨床預后指標，直接影響乳腺癌的風險級別，過表達或基因擴增的乳腺癌患者無病生存期和總生存期縮短，腫瘤負荷更大，淋巴結轉移幾率高，復發(fā)風險高。針對HER-2擴增患者，臨床研究表明該群體對 CMF化療方案和他莫昔芬(TAM)內分泌治療的反應性低，但對高劑量強度的蒽環(huán)類藥物、 紫杉醇化療和曲唑的反應性明顯高于HER-2陰性患者。一種小分子靶向藥物拉帕替尼也適用于Her2高表達乳腺癌患者，F(xiàn)DA1998批準將一種重組DNA衍生的人源化單克隆抗體曲妥珠單抗(赫賽汀)用于HER2過度表達轉移性乳腺癌的一線聯(lián)合化療及接受過一個或多個化療方案晚期乳腺癌單藥治療，可以降低50%的復發(fā)風險和35%左右的死亡風險。(Jeffrey S. Ross, JonathanA. Fletcher, Gerald P. Linette, et al· The Her-2/neu gene and protein in breast cancer 2003 :biomarker and target of therapy. The Oncologist 2003 ；8 :307-325. Masafumi Kurosumi. Recent trends of HER-2 testing and trastuzumab therapy for breast cancer. Breast Cancer2009 ；16 :284-287. Walter P Carnery, Kim Leitzel，Suhail Ali，et al. HER-2/neu diagnostics in breast cancer. Breast Cancer Research. 9 :207.Edgerton SEiMerkel DiMoore DH,Thor AD :HER_2/neu/ erbb2 status by immunohistochemistry and FISH :clonality and regression with recurrence and metastases. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2003,111 :214-221. Johnston SRD, Leory A. Lapatinib :a novel EGFR/HER2 tryosinekinase inhibitor for cancer. Drugs Today 2006，42 :441-453.)、② T0P2A。T0P2A 基因(Topoisomerase II alpha, TOPII α)編碼DNA拓撲異構酶II ci，能調節(jié)核酸空間結構動態(tài)變化、控制核酸生理功能。T0P2A基因參與乳腺癌細胞的復制，存在T0P2A基因異常的患者預后差，無復發(fā)生存期縮短，尤其是T0P2A基因缺失的患者預后更差?；驍U增提示腫瘤有復發(fā)的可能，或者遠期的療效下降。研究表明，T0P2A基因異常的患者對于含蒽環(huán)類藥物的治療方案更敏感，T0P2A擴增患者在使用CEF化療方案治療時能降低65%的復發(fā)風險和67%的死亡風險，而對T0P2A基因無變異患者，CEF和CMF的療效無明顯差別。(Kirsten Vmg Nielsen,Sven MulIer，Susanne Moller,et al. Aberrations of ERBB2 and TOP2A genes in breast cancer. Molecular oncology 4(2010) 161-168. Bouchalova, K.，Trojanec， R.，Kolar, Ζ.，Cwiertka，K.，Cernakova，I.，Mihal，V.，Hajduch，Μ. , 2006. Analysis of ERBB2 and T0P2A gene status using fluorescence in situ hybridization versus immunohistochemistry in localized breast cancer. Neoplasma 53 (5)，393-401. Ja .. rvinen，T. A.，Tanner，M.，Rantanen, V.，Barlund，Μ.，Borg，Α.，Grenman, S.，Isola， J.,2000. Amplification and deletion of topoisomerase IIa associate with ErbB—2 amplification and affect sensitivity to topoisomerase II inhibitor doxorubicin in breast cancer. Am. J. Pathol 156 (3)，839—847.)、③ AGTRl。 AGTRl ■因(angiotensin II receptor, type 1，AGTR1)血管緊張素II受體1型，早期研究主要集中在與高血壓相關方面，2009年發(fā)現(xiàn)它也是一種與乳腺癌關聯(lián)的基因。當前研究表明，AGTRl在約五分之一的乳腺癌患者中有過度表達，與癌細胞的侵入行為相關。治療高血壓的藥物氯沙坦(Iosarten)對AGTRl過度表達的腫瘤有抑制效果，能夠減少腫瘤細胞。(Ateeq B， Tomlins SA, Chinnaiyan AM. AGTRl as a therapeutic target in ER-positive and ERBB2~negative breast cancer cases. Cell Cycle. 2009Dec ；8 (23) :3794-5. Rhodes DR, Ateeq B，Cao Q，et al. AGTRl overexpression defines a subset of breast cancer and confers sensitivity to losartan,an AGTRl antagonist. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Jun 23 ；106 (25) :10284-9. Gonzalez-Zuloeta Ladd AMiArias Vasquez AiSiemes C，et al. Differential roles of Angiotensinogen and Angiotensin Receptor type 1 polymorphisms in breast cancer risk. Breast Cancer Res Treat. 2007 Mar ； 101 (3) 299-304. Koh WP, Yuan JM, Van Den Berg D，et al. Polymorphisms in angiotensin IItype 1 receptor and angiotensin I-converting enzyme genes and breast cancer risk among Chinese women in Singapore. Carcinogenesis. 2005 Feb ；26 (2) :459-64.) 和④17號染色體。最新臨床研究表明，當使用蒽環(huán)類藥物治療，17號染色體多倍體患者復發(fā)風險下降了 35% -40%，而無17號染色體單體的患者并無從蒽環(huán)類藥物獲益，更傾向于其它治療選擇，如紫杉醇類等。(Bai YF, Ren GP, Wang B, Teng LS, Liu X. Comparison between analysis of HER2 gene and chromosome 17 in breast cancer by dual-probe chromogenic in situ hybridization and fluorescence in situ hybridization. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 2010Mar ；39 (3) :161-5.)。利用探針對上述四種標志物進行檢測，可以大大提高了乳腺癌的檢出率，更加準確的進行乳腺癌分型，指導個體化治療方案制定，選擇合適治療藥物，從而降低死亡率，減少復發(fā)風險，達到優(yōu)化診療效果的目的。本發(fā)明提供了四種乳腺癌分子標志物相關探針的制備方法，并在此基礎上利用這些探針自主研制了乳腺癌熒光原位雜交檢測試劑盒，填補了國內該檢測領域的空白，具有十分重大的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供HER2、T0P2A、AGTR1基因探針、人17號染色體計數(shù)探針四種探針的制備方法。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，HER2、T0P2A、AGTRl基因探針的制備步驟包括(1)克隆篩選通過NCBI Mapview數(shù)據(jù)庫檢索所有含有HER2基因、T0P2A基因、 AGTRl基因的克隆，并對這些克隆進行篩選，選擇最優(yōu)的克隆。(2)克降培養(yǎng)和鑒定按照篩選確定的克隆編號購買相應的克隆anvitrogen RPCI11. C)，取10 μ 1克隆菌液添加到5ml TB培養(yǎng)液(氯霉素抗性)中，37°C搖床中搖菌活化培養(yǎng)8 12小時；再將菌液全部加入至500ml的TB培養(yǎng)液(氯霉素抗性)中，37°C搖床中搖菌培養(yǎng)8 12小時；針對HER2、T0P2A、AGTRl基因探針使用相應的STS引物進行PCR 擴增，并通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物片段進行分析，從而完成待選克隆的鑒定。(3)基因探針制備對鑒定陽性的菌液，進行質粒DNA的提?。煌ㄟ^OD值的測定對質粒DNA進行定量；然后，通過缺口平移方法對質粒DNA進行熒光標記；對標記產物進行乙醇沉淀和濃縮；獲得探針，避光、-20 士 5 °C儲存。(4)基因探針驗證使用人類正常分裂中期淋巴細胞滴片進行探針驗證。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，克隆篩選步驟中含有HER2基因最優(yōu)選的克隆， 編號為 RP11-909L6。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，克隆篩選步驟中含有T0P2A基因最優(yōu)選的克隆，編號為 RP11-1029L16。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，克隆篩選步驟中含有AGTRl基因最優(yōu)選的克隆，編號為RP11-366P9。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，克隆培養(yǎng)和鑒定步驟中使用的STS引物對序列分別為HER2基因探針上游引物5，-AGGGGAGAATAAATAAAATCTGTGG-3，(SE Q ID NO 1)和下游弓丨物 5，-CAGGAGTGAGACACTCTCCATG-3，(SEQ ID NO 2) ；T0P2A 基因探針上游引物5，-ATTCAAAGCTGGATCCCTTT-3，(SEQ ID NO 3)和下游弓丨物5，-AGCTGTGACAAATGCCTGTA-3，(SEQ ID NO 4) ；AGTRl 基因探針上游引物 5，-TTGCATTATT TTCAAAGCCCTT-3，(SEQ ID NO 5)和下游引物 5，-TCCTACCAGCTTAGGCCAGA-3，(SEQ ID NO: 6) ；PCR 擴增條件為:95°C 5 分鐘；(940C 30 秒，56°C 30 秒，72°C 45 秒)X 40 循環(huán)；72°C 10分鐘。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，基因探針制備步驟中質粒DNA提取可使用市售的質粒提取試劑盒，優(yōu)選Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，基因探針制備步驟中質粒DNA的定量是將質粒 DNA稀釋后分別測定^Onm和^Onm下的吸光度，計算產物濃度。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，基因探針制備步驟中質粒DNA進行熒光標記可以使用切口平移方法標記，利用DNaseI和DNA聚合酶I實現(xiàn)基因探針的熒光標記。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，50 μ 1切口平移體系中DNA聚合酶I的使用量在 IOU 20U間，DNase I使用量在0. OOlU 0. OlU間，標記條件為16°C 2小時。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，基因探針標記的熒光素為熒光素標記的dUTP， 并優(yōu)選 Spectrum dUTP。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，基因探針濃縮方法為乙醇沉淀濃縮，最后使用 3 5 μ 1滅菌純化水或Human Cot-I DNA (1 μ g/μ 1)溶解沉淀。17號染色體計數(shù)探針的制備可以參照專利“一種人17號染色體計數(shù)探針的制備方法及其應用”(申請?zhí)枮?00910039410. 6)中17號染色體計數(shù)探針的制備方法。本發(fā)明的另一個目的是利用HER2、T0P2A、AGTR1基因探針及人17號染色體計數(shù)探針制備一種乳腺癌熒光原位雜交檢測試劑盒。為了實現(xiàn)本發(fā)明，我們采用了以下技術方案(1)樣本處理和制片按照原位雜交方法對各類型樣本進行處理。(2)雜交配制雜交液，主要包括熒光標記探針混合物和雜交緩沖液。合適溫度下進行8 16小時的雜交，然后以合適的洗液洗去未結合上的和非特異結合的探針；DAPI復染劑復染。(3)通過熒光顯微鏡相應濾塊觀察熒光信號，對不同信號進行觀察計數(shù)。基于以上技術方案發(fā)明的試劑盒包括1)雜交緩沖液、熒光標記探針混合物、未標記的競爭性DNA、DAPI復染劑，和2、分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，雜交緩沖液的組分包括去離子甲酰胺，SSCjt 酸葡聚糖，其中去離子甲酰胺濃度為50% 70%，硫酸葡聚糖濃度為0. lg/ml。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，熒光標記探針混合物包括HER2基因探針、 T0P2A基因探針、AGTRl基因探針及人17號染色體計數(shù)探針，每人份熒光標記探針混合物中 HER2基因探針、T0P2A基因探針、AGTRl基因探針的使用量均為0. 5 μ 1，17號染色體計數(shù)探針的使用量為5 10ng。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，由雜交緩沖液、熒光標記探針混合物和未標記的競爭性DNA配制雜交液，其中未標記的競爭性DNA選擇Human C0T-1 DNA。每人份雜交液中加入7 μ 1雜交緩沖液，1.6μ 1熒光標記探針混合物，Human C0T-1 DNA使用量為1 μ g， 并用H2O補至10 μ 1。。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中DAPI復染劑配制方法為50 250ng DAPI溶于Iml抗褪色液(10mg/ml對苯二胺/PBS，甘油混合液)。利用本發(fā)明的試劑盒，依照常規(guī)的熒光原位雜交方法對人的中期和間期細胞進行信號計數(shù)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有下列優(yōu)點(1)實現(xiàn)了對同一樣本進行四種乳腺癌分子標志物的同時檢測，大大提高了乳腺癌的檢出率，更加準確的進行乳腺癌分型。(2)進行準確、快速的信號計數(shù)、且結果重復性好；(3)無需進行細胞培養(yǎng)和制備高質量的中期染色體片，可用于中期或間期細胞信號計數(shù)，操作相對簡單；(4)通過制備成試劑盒，可以實現(xiàn)在腫瘤生物學、細胞遺傳學等領域的應用，有助綜合評價各分子標志物，了解其與腫瘤發(fā)生等的聯(lián)系。


圖1顯示克隆鑒定的電泳結果。目的產物13m3ps。其中1道為marker，2道為樣本；箭頭標示從上至下依次代表150bp、100bp。圖2顯示克隆鑒定的電泳結果。目的產物l(^bpS。其中1道為marker，2道為樣本；箭頭標示代表IOObp。圖3顯示克隆鑒定的電泳結果。目的產物25^ps。其中1道為marker，2道為樣本；箭頭標示從上至下依次代表300bp、200bp。圖4顯示人類外周血淋巴細胞中17號染色體(青色)和HER-2基因探針(紅色) 計數(shù)結果。圖5顯示人類外周血淋巴細胞中T0P2A基因(綠色)檢測結果。圖6顯示人類外周血淋巴細胞中AGTRl基因(金色)檢測結果。
具體實施例方式下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。實施例1 :HER2基因探針的制備(1)引物設計克隆篩選HER2基因位于人染色體17ql2區(qū)段，NCBI Mapview數(shù)據(jù)庫檢索所有含有HER2基因的克隆，篩選出包含有該基因的克隆，編號為RP11-909L6。(2)克隆培養(yǎng)和鑒定購買克隆RP11-909L6，取ΙΟμ 1克隆菌液添加到5mlTB培養(yǎng)液(氯霉素抗性)中，37°C搖床中搖菌活化培養(yǎng)8 12小時；再將菌液全部加入至500ml 的TB培養(yǎng)液(氯霉素抗性)中，37°C搖床中搖菌培養(yǎng)8 12小時；菌液使用上游引物5，-AGGGGAGAATAAATAAAATCTGTGG-3，和下游引物5，-CAGGAGTGAGACACTCTCCATG-3，進行 PCR 擴增，擴增條件為95 °C 5 分鐘； (940C 30秒，56°C 30秒，72°C 45秒)X40循環(huán)；72°C 10分鐘。對擴增產物進行電泳驗證， 結果分別在138bps具有明亮的條帶(參見附圖1)。(3)基因探針制備鑒定陽性的菌液，使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit，按照說明書要求的操作方法進行超低拷貝質粒DNA提取，通過測定260nm和280nm處的吸光度對質粒DNA定量；按照公式雙鏈DNA濃度(ng/ μ 1) = 0D260 X 50 (ng/ μ 1)計算質粒DNA濃度。采用高壓滅菌的純化水稀釋為lOOng/μ 1，采用1. 5ml的離心管分裝，_20°C密封保存。通過切口平移方法對質粒DNA進行熒光標記，探針標記的熒光素為Spectrum dUTP，選擇orange-dUTP標記HER2基因。按如下方案，嚴格避光條件下在冰上配制PCR反應體系。組分加入量10 X DNA 聚合酶 I buffer 5μ 10. 5mM dTTP1 μ 1ImM d3TP1 μ 1DNA 聚合酶 I IOU/ μ 11 μ 1DNase I 0. OOlU/μ 15μ 10. 2mM orange-dUTP2. 5 μ 1模板1 μ g水補足 50 μ 1配完后震蕩混勻，16°C標記2小時，再80°C孵育10分鐘滅活酶。取5 μ 1使用2% 瓊脂糖凝膠做電泳，要求在100-500bp之間存在彌散的帶。對標記產物進行乙醇沉淀和濃縮，按如下方案在1. 5ml離心管中依次加入醋酸鈉和無水乙醇，避光、冰上配制標記產物45 μ 1Human Cot-I DNA5 μ 1醋酸鈉(3mol/L)5μ 1無水乙醇125 μ 1混勻后置于_70°C冰箱中至少2小時，4°C 13000rpm離心30分鐘，小心去上清，勿攪動沉淀，加入Iml的70%乙醇，4°C 13000轉/分鐘離心15分鐘，小心去上清，勿攪動沉淀，避光干燥。使用3μ 1滅菌純化水溶解沉淀，獲得HER2基因探針，避光、-20°C儲存。(4)HER2基因探針驗證使用人類正常分裂中期淋巴細胞滴片進行探針驗證。包含中期或間期染色體DNA，熒光原位雜交后，間期細胞或中期染色體(17號染色體)上均可見熒光信號。實施例2 :T0P2A基因探針的制備(1)引物設計克隆篩選T0P2A基因位于人染色體17q21區(qū)段，NCBI Mapview數(shù)據(jù)庫檢索所有含有T0P2A基因的克隆，篩選出包含有該基因的克隆，編號為RP11-1029L16。(2)克隆培養(yǎng)和鑒定購買克隆RP11-1029L16，取10μ 1克隆菌液添加到5mlTB 培養(yǎng)液(氯霉素抗性)中，37°C搖床中搖菌活化培養(yǎng)8 12小時；再將菌液全部加入至 500ml的TB培養(yǎng)液(氯霉素抗性)中，37°C搖床中搖菌培養(yǎng)8 12小時；菌液使用上游引物 5，-ATTCAAAGCTGGATCCCTTT-3，和下游引物 5，-AGCTGTGACAAATGCCTGTA-3，進行 PCR 擴增，擴增條件為95°C 5分鐘；(940C 30秒，56°C 30秒，72°C 45秒)X40循環(huán)；72°C 10分鐘。 對擴增產物進行電泳驗證，結果分別在108bps具有明亮的條帶(參見附圖2)。(3)基因探針制備鑒定陽性的菌液，使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit,按照說明書要求的操作方法進行超低拷貝質粒DNA提取，通過測定260nm和280nm處的吸光度對質粒DNA定量；按照公式雙鏈DNA濃度(ng/ μ 1) = 0D260 X 50 (ng/ μ 1)計算質粒DNA 濃度。采用高壓滅菌的純化水稀釋為lOOng/μ 1，采用1. 5ml的離心管分裝，_20°C密封保存。 通過切口平移方法對質粒DNA進行熒光標記，探針標記的熒光素為Spectrum dUTP，選擇green-dUTP標記T0P2A基因。按如下方案，嚴格避光條件下在冰上配制PCR反
應體系。組分加入量10 X DNA 聚合酶 Ibuffer5μ 10. 5mM dTTP1 μ 1ImM d3TP1 μ 1DNA 聚合酶 I IOU/ μ 11 μ 1DNase I 0. OOlU/μ 15μ 10. 2mM green-dUTP2. 5 μ 1模板1 μ g水補足 50 μ 1配完后震蕩混勻，16°C標記2小時，再80°C孵育10分鐘滅活酶。取5 μ 1使用2% 瓊脂糖凝膠做電泳，要求在100-500bp之間存在彌散的帶。對標記產物進行乙醇沉淀和濃縮，按如下方案在1. 5ml離心管中依次加入醋酸鈉和無水乙醇，避光、冰上配制標記產物45 μ 1Human Cot-I DNA5 μ 1醋酸鈉(3mol/L)5μ 1無水乙醇125 μ 1混勻后置于-70°C冰箱中至少2小時，4°C 13000rpm離心30分鐘，小心去上清，勿攪動沉淀，加入Iml的70%乙醇，4°C 13000轉/分鐘離心15分鐘，小心去上清，勿攪動沉淀，避光干燥。使用3μ 1滅菌純化水溶解沉淀，獲得Τ0Ρ2Α基因探針，避光、-20°C儲存。G)T0P2A基因探針驗證使用人類正常分裂中期淋巴細胞滴片進行探針驗證。包含中期或間期染色體DNA，熒光原位雜交后，間期細胞或中期染色體(17號染色體)上均可見熒光信號。實施例3 =AGTRl基因探針的制備(1)引物設計克隆篩選AGTR1基因位于人染色體3qM區(qū)段，NCBI Mapview數(shù)據(jù)庫檢索所有含有AGTRl基因的克隆，篩選出包含有該基因的克隆，編號為RP11-366P9。(2)克隆培養(yǎng)和鑒定購買克隆RP11-366P9，取10μ 1克隆菌液添加到5mlTB培養(yǎng)液(氯霉素抗性)中，37°C搖床中搖菌活化培養(yǎng)8 12小時；再將菌液全部加入至500ml 的TB培養(yǎng)液(氯霉素抗性)中，37°C搖床中搖菌培養(yǎng)8 12小時；菌液使用上游引物 5，-TTGCATTATTTTCAAAGCCCTT-3，和下游引物 5，-TCCTACCAGCTTAGGCCAGA-3，進行 PCR 擴增，擴增條件為95°C 5分鐘；(940C 30秒，56°C 30秒，72°C 45秒)X40循環(huán)；72°C 10分鐘。 對擴增產物進行電泳驗證，結果分別在252bps具有明亮的條帶(參見附圖3)。(3)基因探針制備鑒定陽性的菌液，使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit,按照
9說明書要求的操作方法進行超低拷貝質粒DNA提取，通過測定260nm和280nm處的吸光度對質粒DNA定量；按照公式雙鏈DNA濃度(ng/ μ 1) = 0D260 X 50 (ng/ μ 1)計算質粒DNA 濃度。采用高壓滅菌的純化水稀釋為lOOng/μ 1，采用1. 5ml的離心管分裝，_20°C密封保存。 通過切口平移方法對質粒DNA進行熒光標記，探針標記的熒光素為Spectrum dUTP，選擇gold-dUTP標記AGTRl基因。按如下方案，嚴格避光條件下在冰上配制PCR反應體系。組分加入量10 X DNA 聚合酶 I buffer5μ 10. 5mM dTTP1 μ 1ImM d3TP1 μ 1DNA 聚合酶 I lOU/μΙ1 μ 1DNase I 0. OOlU/μ 15μ 10· 2mM gold-dUTP2. 5 μ 1模板Iyg水補足 50 μ 1配完后震蕩混勻，16°C標記2小時，再80°C孵育10分鐘滅活酶。取5μ1使用2% 瓊脂糖凝膠做電泳，要求在100-500bp之間存在彌散的帶。對標記產物進行乙醇沉淀和濃縮，按如下方案在1. 5ml離心管中依次加入醋酸鈉和無水乙醇，避光、冰上配制標記產物45 μ 1Human Cot-I DNA5μ 1醋酸鈉(3mol/L)5μ 1無水乙醇125 μ 1混勻后置于-70°C冰箱中至少2小時，4°C 13000rpm離心30分鐘，小心去上清，勿攪動沉淀，加入Iml的70%乙醇，4°C 13000轉/分鐘離心15分鐘，小心去上清，勿攪動沉淀，避光干燥。使用3μ 1滅菌純化水溶解沉淀，獲得AGTRl基因探針，避光、_20°C儲存。(4) AGTRl基因探針驗證使用人類正常分裂中期淋巴細胞滴片進行探針驗證。包含中期或間期染色體DNA，熒光原位雜交后，間期細胞或中期染色體(3號染色體)上均可見熒光信號。實施例4 乳腺癌熒光原位雜交檢測試劑盒制備以10人份/盒為例。(1)雜交液配制將標記好的探針依次放好，首先溶解探針。使用1滅菌純化水溶解按實施例1 方法制備的HER2基因探針干粉中，充分混勻。然后另取1 μ 1滅菌純化水溶解實施例2方法制備的Τ0Ρ2Α基因探針干粉中，充分混勻。然后另取1 μ 1滅菌純化水溶解實施例3方法制備的AGTRl基因探針干粉中，充分混勻。17號染色體計數(shù)探針稀釋至lOOng/μΙ。按下表方案配制熒光標記探針混合物
權利要求
1.一種HER2、T0P2A、AGTRl基因探針的制備方法，其特征在于3種基因探針的制備步驟包括(1)克隆篩選通過NCBIMapview數(shù)據(jù)庫檢索所有含有HER2基因、T0P2A基因、AGTRl 基因的克隆，并對這些克隆進行篩選，選擇最優(yōu)的克隆。(2)克隆培養(yǎng)和鑒定按照篩選確定的克隆編號購買克隆^witrogenRPCI11.C，取 10 μ 1克隆菌液添加到5ml含氯霉素抗性的TB培養(yǎng)液中，37°C搖床中搖菌活化培養(yǎng)8 12 小時；再將菌液全部加入至500ml含氯霉素抗性的TB培養(yǎng)液中，37°C搖床中搖菌培養(yǎng)8 12小時；針對HER2、T0P2A、AGTRl基因探針使用相應的STS引物進行PCR擴增，并通過2% 瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物片段進行分析，從而完成待選克隆的鑒定。(3)基因探針制備對鑒定陽性的菌液，進行質粒DNA的提??；通過OD值的測定對質粒 DNA進行定量；然后，通過缺口平移方法對質粒DNA進行熒光標記；對標記產物進行乙醇沉淀和濃縮；獲得探針，避光、-20 士 5 °C儲存。(4)基因探針驗證使用人類正常分裂中期淋巴細胞滴片進行探針驗證。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其特征還在于克隆篩選步驟中含有HER2基因最優(yōu)的克隆， 編號為RP11-909L6，含有T0P2A基因最優(yōu)選的克隆，編號為RP11-1029L16，含有AGTRl基因最優(yōu)選的克隆，編號為RP11-366P9。
3.根據(jù)權利要求1的方法，其特征還在于克隆培養(yǎng)和鑒定步驟中使用的STS引物對序列分別為HER2基因探針上游引物5，-AGGGGAGAATAAATAAAATCTGTGG-3，和下游弓丨物 5’ -CAGGAGTGAGACACTCTCCATG-3’ ；T0P2A基因探針上游引物5，-ATTCAAAGCTGGATCCCTTT-3，和下游弓丨物 5’ -AGCTGTGACAAATGCCTGTA-3’ ；AGTRl基因探針上游引物5，-TTGCATTATTTTCAAAGCCCTT-3，禾Π下游弓丨物 5’ -TCCTACCAGCTTAGGCCAGA-3’。
4.根據(jù)權利要求1的方法，其特征還在于基因探針制備過程中50μ 1切口平移體系中 DNA聚合酶I的使用量在IOU 20U間，DNase I使用量在0. OOlU 0. OlU間。
5.一種乳腺癌熒光原位雜交檢測試劑盒，包括1)雜交緩沖液、熒光標記探針混合物、 未標記的競爭性DNA、DAPI復染劑，和2、分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，熒光標記探針混合物包含17號染色體計數(shù)探針以及按權利要求1的方法制備的HER2基因探針、 T0P2A基因探針、AGTRl基因探針，其特征在于每人份熒光標記探針混合物中HER2基因探針、T0P2A基因探針、AGTRl基因探針的使用量均為0. 5 μ 1，17號染色體計數(shù)探針的使用量為5 IOng0
6.根據(jù)權利要求5的試劑盒，其特征還在于未標記的競爭性DNA為HumanC0T-1 DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及乳腺癌分子標志物相關探針的制備方法，還涉及利用這些探針制備乳腺癌熒光原位雜交檢測試劑盒。利用本發(fā)明提供的方法制備的HER2、TOP2A、AGTR1基因探針，結合人17號染色體計數(shù)探針、雜交緩沖液、未標記的競爭性DNA及DAPI復染劑可以制備一種乳腺癌熒光原位雜交檢測試劑盒，該試劑盒的應用大大提高了乳腺癌的檢出率，更加準確的進行乳腺癌分型，指導個體化治療方案制定，選擇合適治療藥物，從而降低死亡率，減少復發(fā)風險，達到優(yōu)化診療效果的目的。
文檔編號C12Q1/68GK102399772SQ201010284090
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月15日 優(yōu)先權日2010年9月15日
發(fā)明者何瑰, 李明, 陳華云 申請人:中山大學達安基因股份有限公司