專利名稱：一種海洋微藻葉綠體表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微藻基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種海洋微藻葉綠體表達(dá)載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自從1984年首例轉(zhuǎn)基因植物煙草問(wèn)世以來(lái)，向植物細(xì)胞核中轉(zhuǎn)化外源基因一直 是植物基因工程的主要研究方向。但是由于外源基因在植物細(xì)胞核中表達(dá)量低下、在后代 中表達(dá)不穩(wěn)定、以及核基因容易隨花粉擴(kuò)散所帶來(lái)的生態(tài)安全性等問(wèn)題的存在。與傳統(tǒng)的 核轉(zhuǎn)基因相比，葉綠體轉(zhuǎn)化有著諸多優(yōu)點(diǎn)每個(gè)植物細(xì)胞中都存在大量的葉綠體拷貝，使得 外源基因得到核基因轉(zhuǎn)化很難實(shí)現(xiàn)的超量表達(dá)；外源基因通過(guò)同源重組定點(diǎn)整合在葉綠體 基因組后不會(huì)產(chǎn)生位置效應(yīng)和基因沉默現(xiàn)象；葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化具有母性遺傳的特點(diǎn)，有望 解決核基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中因花粉擴(kuò)散帶來(lái)的生物安全性問(wèn)題；大多數(shù)葉綠體基因以操縱子的 形式存在，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)外源基因在葉綠體基因組中同時(shí)轉(zhuǎn)化和表達(dá)；在葉綠體中表達(dá)的蛋 白質(zhì)可以形成二硫鍵，人源蛋白表達(dá)后也可以被正確折疊。海洋微藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，約占海洋生物物種的40. 86%，微藻還具 有生長(zhǎng)周期短，繁殖速度快，可塑性強(qiáng)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要素要求簡(jiǎn)單，葉綠體占微藻細(xì)胞大部分體 積等特點(diǎn)。硅藻是大量存在于海洋生態(tài)系統(tǒng)中單細(xì)胞浮游植物，因?yàn)槠湔嫉厍虺跫?jí)生產(chǎn)力 總量的25%并且和02的生成密切相關(guān)從而被認(rèn)為具體重要的作用。目前已經(jīng)成功進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)化的真核藻類僅有萊茵衣藻，該轉(zhuǎn)化體系中利用葉綠 體來(lái)源的啟動(dòng)子終止子來(lái)調(diào)控外源基因的表達(dá)，通過(guò)基因槍技術(shù)將載體導(dǎo)入葉綠體基因組 中，獲得了成功表達(dá)，但海洋微藻的葉綠體轉(zhuǎn)化體系還未被建立，而且傳統(tǒng)的葉綠體轉(zhuǎn)化載 體導(dǎo)入受體葉綠體基因組中都是通過(guò)基因槍技術(shù)來(lái)完成，操作復(fù)雜且成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處和缺陷，提供一種海洋微藻葉綠 體表達(dá)載體。本發(fā)明的另一目的在于提供所述海洋微藻葉綠體表達(dá)載體的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種海洋微藻葉綠體表達(dá)載體，包含同源 重組序列I、目的基因表達(dá)盒和同源重組序列II ；目的基因表達(dá)盒位于同源重組序列I和同 源重組序列II之間；所述同源重組序列I如下所示，由rns (核糖體RNA小亞基基因，編碼16s核糖體 RNA小亞基)的3’部分和trnl的5’部分組成的，同源重組序列I中的第1 972bp是rns 基因的3，部分，第973 1097bp是trnl的5，部分；1 ACTGGGCGTA MGCGTCTGT AGGTGGTCCA ATAAGTCAAC TGTTMATCT TGAGGCTCM61 CCTCGAMTC GCAGTCGAAA CTATTAGACT AGAGTATAGT AGGGGTAAAG GGAATTTCCA121 GTGGAGCGGT GAAATGCGTA GAGATTGGAA AGAACACCGA TGGCGAAGGC ACTTTACTGGACGAAAGCTAGGGTAGCAAATGGGATTAGATACCCCAGTA
1CGGGGGTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCACCCCTGATAAGGGTGAGGTCTCTGGTTCM
61ATCCAGMTGGCCCAACGGGGGTATAGCTCAGTTGGTAGAGCACCGCCTTTGCACGGCGG
121TTGTCAGCGGTTCGAATCCGCTTACCTCCACATGMAAATTTTAACATTTTTTMTCATA
181AGATTAMTAAGTCTTMATTCAAGGAATTAAGAGTTTATGGGGGATACCTTGGCATTCA
241GMGCGATGAAGGACGTGGTTACCGACGAAACGCTTCGGGGAGCTGGAAACAAGCTATGA
301TCCGGAGATCTCCGAATGAGGAAACTCTAATACTACTTATTGAATACATAAATMGAAAG
361AGCGAACCTAGGGAACTGAAACATCTTAGTACCTAGAGGAAAAGMAGTAAAAACGATTC
421CCTTAGTAGCGGCGAGCGAAATGGGMCAGCCTAMCTTAATTTTAAGGGTAGCGGGACA
481ATTATTMTGATTAAATGTGACAATTAGACGAACTTAGATGGAATGCTAAACCAAAGAGA
541GTGATAGTCTCGTAGTCGAAMTTGMACAATCAMTTGTATCCCAAGTAGCATGGAGCA
601CGTGAAATTCCGTGTGMTCAGCGAGGACCACCTCGTAAGGCTAMTATTCCTGAATGAC
661CGATAGTGAAATAGTACCGTGAGGGMAGGTGAAMGAACCCCGGGAGGGGAGTGAAAAG
721AACATGMACCATAAACTTACAACCAGTAGGAGGACGACTAAAACGTCTGACTGCGTGCC
781TGTTGAAGAATGAGCCGGCGACTTATAAGTAGTGGCAGGTTAAGGTAGAGAATACCGGAG
841CCATAGTGAAAGCGAGCCTGMTAGGGCGTTTGTCACTGGTTATAGACCCGAACCCGGAT
901GATCTAACCATGGCCAGGTTGAAGCTTAGGTAATACTAAGTGGAGGACCGAACCGACTGA
961TGTTGAMAATCAGCGGATGAGTTGTGGTTAGGGGTGAAATGCCMTCGAATTCGGAGCT
1021AGCTGGTTCTCCCCGAMTGCGTTTAGGCGCAGCGATGAATGTTATAGCTTAGGGGTAM
1081GCACTGTTACGTATGCGGGCTGGTAATTCGGTACCAAATCGTTGCAAACTAAGMTACTA
1141AGTGTACAGTTCATCAGTGAGACTGTGGGGGATAAGCTCCATTGTCAAGA GGGMACAGC
4
1201 CCAGAGCACC AGTTAAGGCC CCTAAATAAT TGCTMGTGA TAAAGGAGGT GGGAGTGCAT1261 AGACAATCAG GAGGTTTGCT TAGAAGCAGC AATCCTTTAA AGAGTGCGTA ATAGCTCACT1321 GATCGAGTAA ACCTGCGCCG MAATGTACG GGACTAAGTA ATTTGCCGAA ACTGTGCGAT1381 ATATAAMTA TATCGGTAGG GGAGCGTTCT GTTGTAGGTT GAAGTATTAG CGGMGCGGA1441 TATGGACGAA GCAGAAGTGA GAATGTCGGC TTGAGTAACG AAA所述海洋微藻葉綠體表達(dá)載體還包含抗性篩選表達(dá)盒或熒光蛋白表達(dá)盒；所述的表達(dá)盒是指含有啟動(dòng)子、基因和終止子、且其中的基因能正常進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和 翻譯的序列；所述的目的基因表達(dá)盒由啟動(dòng)子、目的基因和終止子組成；所述目的基因表達(dá)盒的啟動(dòng)子優(yōu)選為CaMV 35S啟動(dòng)子；所述目的基因表達(dá)盒的終止子優(yōu)選為NOS終止子；所述的抗性篩選表達(dá)盒由啟動(dòng)子、抗性篩選標(biāo)記基因和終止子組成；所述抗性篩選表達(dá)盒的抗性篩選標(biāo)記基因優(yōu)選為氯霉素抗性基因；所述的熒光蛋白表達(dá)盒由啟動(dòng)子、熒光蛋白基因和終止子組成；所述熒光蛋白基因優(yōu)選為綠色熒光蛋白基因；所述海洋微藻葉綠體表達(dá)載體應(yīng)用于在海洋微藻中表達(dá)外源蛋白；所述的應(yīng)用，包含以下步驟通過(guò)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將海洋微藻葉綠體表達(dá)載體轉(zhuǎn)入 海洋微藻中，然后篩選得到目的基因表達(dá)的海洋微藻；所述的海洋微藻優(yōu)選為三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)；所述基因轉(zhuǎn)移技術(shù)優(yōu)選為電擊法(或稱為電穿孔法)；所述電擊法包含以下步驟(1)用培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)基(無(wú)Si)培養(yǎng)三角褐指藻，溫度為21 士 1°C，光照強(qiáng)度 為40001x，光暗比為12h 12h ；(2)離心收集1.0X IO7 IO8個(gè)三角褐指藻細(xì)胞，3000rpm離心IOmin ；(3)加150 μ 1 1. Omol/L NaCl懸浮三角褐指藻細(xì)胞；(4)加150ul 0. lmol/L甘露醇，混勻，冰上放置30min ；(5)將步驟(4)制備的藻細(xì)胞液轉(zhuǎn)移到0. 4cm電激杯內(nèi)，電激杯內(nèi)藻液以不超過(guò) 400 μ 1為宜，同時(shí)加質(zhì)粒pPtc-GFP (0. 4 μ g)混勻；(6)將電激杯放置好，調(diào)電穿孔儀(美國(guó)BIO-RAD公司MicroPulser 電穿孔儀) 電容至10F，電阻為400，電壓為1. 5kv，進(jìn)行電擊；(7)將電擊后的藻液轉(zhuǎn)移到50ml三角瓶中，加新鮮的f/2培養(yǎng)基10ml，暗處理2h， 再正常培養(yǎng)24h(12L 12D)；所述篩選的方式優(yōu)選為通過(guò)抗性篩選或通過(guò)熒光蛋白篩選。本發(fā)明的原理本發(fā)明采用海洋微藻的葉綠體基因組中的反向重復(fù)區(qū)(IR)內(nèi)的 trnl序列及trnA序列作為同源重組片段，兩段序列位于葉綠體基因組反向重復(fù)區(qū)，具有2 個(gè)拷貝，可以增加外源基因的整合效率，提高外源基因的表達(dá)水平。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果(1)本發(fā)明的同源重組序列使得通過(guò)電擊法即可將表達(dá)載體導(dǎo)入海洋微藻葉綠體 基因組中，方便了載體導(dǎo)入葉綠體基因組的途徑并大大降低了轉(zhuǎn)化成本，為實(shí)現(xiàn)利用海洋微藻葉綠體為生物反應(yīng)器生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品提供了技術(shù)支撐。(2)本發(fā)明首次采用非葉綠體來(lái)源的原核生物的啟動(dòng)子和終止子來(lái)調(diào)控外源基因 的表達(dá)，使外源基因在海洋微藻葉綠體中獲得高效表達(dá)。(3)本發(fā)明能成功得到葉綠體轉(zhuǎn)基因微藻，葉綠體轉(zhuǎn)基因微藻作為生物反應(yīng)器能 夠生產(chǎn)重組疫苗、哺乳動(dòng)物抗體、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的復(fù)合物及工業(yè)原料如胡蘿卜素、多不飽 和脂肪酸、氫氣或生物燃料等，這預(yù)示著本發(fā)明將為生產(chǎn)以上高附加值產(chǎn)品提供了有效保障。


圖1是重組質(zhì)粒ptrnl的結(jié)構(gòu)圖。圖2是重組質(zhì)粒ptrnl-trnA的結(jié)構(gòu)圖。圖3是重組質(zhì)粒ptrnl-trnA-cat的結(jié)構(gòu)圖。圖4是重組質(zhì)粒pPtc-GFP的結(jié)構(gòu)圖。圖5是觀察成功轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pPtc-GFP的三角褐指藻葉的熒光圖，其中A是陽(yáng)性三角褐指藻細(xì)胞經(jīng)488nm激發(fā)光激發(fā)后觀察到的GFP綠色熒光圖；B是陽(yáng)性三角褐指藻細(xì)胞經(jīng)543nm激發(fā)光激發(fā)后觀察到的葉綠體自發(fā)的紅色熒光 圖；C是激光共聚焦顯微鏡明場(chǎng)下觀察到的陽(yáng)性三角褐指藻細(xì)胞圖；D是A、B、C、三幅圖的疊加效果圖。圖6是對(duì)圖5的GFP熒光進(jìn)行的平均熒光強(qiáng)度分析圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。實(shí)施例1(1)設(shè)計(jì)引物同源重組序列I的上游和下游引物分別是Pl和P2Pl :5’ -CGAGCTCACTGGGCGTAAAGCGTCTGT-3’SacIP2 :5’ -GGGGTACCTTGGGCCATTCTGGATTTG-3’KpnI同源重組序列II的上游和下游引物分別是P3和P4P3 :5，-ACGCGTCGACAACTGCAGCGGGGGTATAGCTCAGTTGG-3’SalIP4 :5，-AACTGCAGACATGCATGCTTTCGTTACTCAAGCCGACATT-3’PstI(2) PCR擴(kuò)增以三角褐指藻基因組DNA為模板，其中三角褐指藻(Phaeodactylum
6tricornutum)購(gòu)自武漢水生所，三角褐指藻基因組DNA的提取過(guò)程按照大連寶生物公司的 Universal GenomicDNA Extraction Kit Ver. 3· O 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
同源重組序列I的反應(yīng)體系如下
0108]基因組DNA2ul
0109]dNTP Mixture3. 2 μ 1
0110]IOXPCR Buffer (含 Mg2+) 4μ 1
0111]trnl 上游引物 Pl0. 8 μ 1
0112]trnl 下游引物 Ρ20. 8 μ 1
0113]Takara LA Taq0. 4 μ 1
0114]ddH2028. 8 μ 1
0115]_
0116]Total40 μ 1
0117]_
0118]同源重組序列II的反應(yīng)體系如下
0119]基因組DNA2. 0μ 1
0120]dNTP Mixture3. 2 μ 1
0121]10XPCR Buffer(含 Mg2+) 4· 0μ 1
0122]trnA 上游引物 Ρ30. 8 μ 1
0123]trnA 下游引物 Ρ40. 8 μ 1
0124]Takara LA Taq0. 4 μ 1
0125]ddH2028. 8 μ 1
0126]_
0127]Total40 μ 1同源重組序列I和同源重組序列II PCR反應(yīng)條件為反應(yīng)條件為94°C 4min ； 94°C 50s, 55°C lmin，72°C 2min，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0(3)克隆Α、將步驟⑵得到的同源重組序列I PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收IlOObp 片段，進(jìn)行TA克隆，使用大連寶生物公司Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0試 劑盒進(jìn)行回收，回收片段與PMD19-T進(jìn)行連接，連接體系根據(jù)大連寶生物公司的PMD19-T載 體使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，其中使用DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自廣州鼎國(guó)生物有限公司)，整個(gè)TA克 隆過(guò)程根據(jù)DH5ci感受態(tài)細(xì)胞使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)；挑選陽(yáng)性克隆，得到TA-trnI重組質(zhì)粒。 再用SacI和KpnI同時(shí)雙酶切TA_trnI重組質(zhì)粒和環(huán)狀載體pMD19_T(T購(gòu)自大連寶生物 公司)，所有限制性內(nèi)切酶及所需的酶切Buffer均購(gòu)自大連寶生物公司，TA-trnI重組質(zhì) 粒酶切體系TA-trnI 10 μ 1，SacI 7 μ 1，KpnI 7 μ 1，1 XL Buffer 2. 5 μ 1, ddH20 Ιμ ，共 25 μ 1 ；載體 pMD19-T 的酶切體系49μ 1，SacI 2. 5 μ 1，KpnI 2. 5μ 1, IXM Buffer 6μ 1， 共60 μ 1 ；酶切時(shí)間為11. 5h ；回收trnl片段和線性的pMD19-T載體，通過(guò)T4DNA連接酶(T4 DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物公司，其中連接體系和時(shí)間根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)；將trnl連入載體 PMD19-T中，得到含有trnl的重組質(zhì)粒ptrnl (如圖1所示)。B、將步驟⑵得到的同源重組序列II PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收1500bp的片段，進(jìn)行TA克隆，使用大連寶生物公司Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0 試劑盒進(jìn)行回收，回收片段與PMD19-T進(jìn)行連接的體系根據(jù)大連寶生物公司的PMD19-T載 體使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，其中使用DH5ci感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自廣州鼎國(guó)生物有限公司)，整個(gè)TA 克隆過(guò)程根據(jù)DH5ci感受態(tài)細(xì)胞使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)；挑選陽(yáng)性克隆，得到TA-trnA重組質(zhì) 粒。再用SalI和PstI進(jìn)行雙酶切，所有限制性內(nèi)切酶及所需的酶切Buffer均購(gòu)自大連 寶生物公司；TA-trnA 重組質(zhì)粒酶切體系TA-trnA 19μ 1, Sail 4.0 μ 1, PstI 4.0μ 1, IXH Buffer 3. 0μ 1, ddH20 4. 0 μ 1，共 30 μ 1 ；重組質(zhì)粒 ptrnl 的酶切體系22 μ 1，Sail 7. 0μ 1, PstI 7.0μ Ι,ΙΧΗ Buffer 4· 0 μ 1，共 40 μ 1 ；酶切時(shí)間為 11. 5h ；同時(shí)雙酶切 TA-trnA重組質(zhì)粒和步驟A制備的重組質(zhì)粒ptrnl，回收trnA片段和線性的ptrnl載體，通 過(guò)T4DNA連接酶(購(gòu)自大連寶生物公司)，其中連接體系和時(shí)間根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)將trnA 連入載體PtrnI中，得到重組質(zhì)粒ptrnl-trnA(如圖2所示)。C、以質(zhì)粒pLysS (含有質(zhì)粒pLysS的BL21(DE3)菌株購(gòu)自上海今邁生物科技有限 公司，使用廣州東盛公司的DsbioDWOl-I質(zhì)粒小量提試劑盒提取質(zhì)粒pLysS，提取過(guò)程根據(jù) 說(shuō)明進(jìn)行)為模板PCR擴(kuò)增氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因以及該基因前面約260bp長(zhǎng)度的 啟動(dòng)子和后面約150bp長(zhǎng)度的終止子，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因表達(dá)盒的上游和下游 引物分別是P5和P6 P5 :5’ -CGGGATCCCGGGATCCAGCATCACCCGACGCACT-3’BamHIP6 :5， -GCTCTAGAGCTCTAGATAACGACCCTGCCCTGAAC-3’
0136]XbaI
0137]PCR反應(yīng)體系如下
0138]質(zhì)粒 pLysS2μ 1
0139]dNTP Mixture3. 2 μ 1
0140]10XPCR Buffer (含 Mg2+)4μ 1
0141]CAT表達(dá)盒上游引物Ρ50. 8μ 1
0142]CAT表達(dá)盒下游引物Ρ60. 8μ 1
0143]Takara LA Taq0. 4 μ 1
0144]ddH2028. 8 μ 1
0145]_
0146]Total40 μ 1反應(yīng)條件為94°C4min ；94°C 50s，58°C lmin，72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、回收后進(jìn)行TA克隆，使用大連寶生物公司Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0試劑盒進(jìn)行回收，回收片段與pMD19_T進(jìn)行連接的體系根據(jù) 大連寶生物公司的PMD19-T載體使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，其中使用DH5ci感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自廣 州鼎國(guó)生物有限公司)，整個(gè)TA克隆過(guò)程根據(jù)DH5ci感受態(tài)細(xì)胞使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，挑選 陽(yáng)性克隆，得到TA-CAT重組質(zhì)粒；用BamHI和XbaI同時(shí)雙酶切TA-CAT重組質(zhì)粒和載體 ptrnl-trnA，回收CAT片段和線性的ptrnl-trnA載體，通過(guò)T4DNA連接酶將trnA連入載體 ptrnl-trnA中，得到重組質(zhì)粒ptrnI-trnA_CAT(如圖3所示)。D、以質(zhì)粒pBI121-GFP，質(zhì)粒pBI121為模板PCR擴(kuò)增GFP基因以及該基因前面830bp長(zhǎng)度的CaMV 35S啟動(dòng)子和該基因后面帶有的250bp長(zhǎng)度的NOS終止子，其中質(zhì)粒 PBI121-GFP通過(guò)如下步驟得到含有GFP基因的質(zhì)粒pGEM(購(gòu)自廣州瑞真生物技術(shù)有限公 司)，以質(zhì)粒pGEM為模板，設(shè)計(jì)了 PCR引物上游和下游引物分別為P7和P8 P7 :5’ -GCTCTAGAGGATCCCTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT-3’P8 :5’ -AGTGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATTGAGCTCC-3’
0152]PCR的反應(yīng)體系如下
0153]質(zhì)粒pGEM2μ 1
0154]dNTP Mixture3. 2 μ 1
0155]10XPCR Buffer (含 Mg2+) 4μ 1
0156]GFP 上游引物 Ρ90. 8 μ 1
0157]GFP 下游引物 PlO0. 8 μ 1
0158]Takara LA Taq0. 4 μ 1
0159]ddH2028. 8 μ 1
0160]_
0161]Total40 μ 1反應(yīng)條件為94°C4min ；94°C 50s，58°C lmin，72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0PCR出來(lái)GFP，以XbaI和SacI雙酶切PCR產(chǎn)物和pBI 121質(zhì)粒(購(gòu)自金維克(中 國(guó))生物技術(shù)中心)，再將GFP片段和pBI121載體連接，這樣就把⑶S替換成了 GFP，得到 了質(zhì)粒 PBI121-GFP。
0164]GFP表達(dá)盒的上游和下游引物分別為P9和PlO 0165]P9 :5，0166]-GGACTAGT GCGGCCGC CTCGAGCAGGTCCCCAGATTAGCC-3 ‘0167]SpeI NotIXhoI0168]PlO :5’ -ACGCGTCGACCAGGGTTTTCCCAGTCAC-3，0169]SalI0170]PCR的反應(yīng)體系如下0171]質(zhì)粒 pBI 121-GFP2μ 10172]dNTP Mixture3. 2μ 10173]10XPCR Buffer (含 Mg2+)4μ 10174]GFP表達(dá)盒上游引物P90. 8μ 10175]GFP表達(dá)盒下游引物PlO0. 8μ 10176]Takara LA Taq0. 4μ 10177]ddH2028. 8μ 10178]0179]Total40 μ 10180]反應(yīng)條件為94°C 4min ；94°C 50s, 60°C lmin，72°C 2min，35 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin。0181]PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、回收后進(jìn)行TA克隆，同上，挑選陽(yáng)性克隆，得到含有GFP表達(dá)
盒的TA-GFP重組質(zhì)粒。用SalI和SpeI雙酶切TA-GFP重組質(zhì)粒，回收GFP表達(dá)盒片段， 用SalI和XbaI雙酶切載體ptrnI-trnA_cat，通過(guò)T4DNA連接酶將GFP表達(dá)盒連入載體ptrnl-trnA-cat 中，得到重組質(zhì)粒 pPtc-GFP。(4)轉(zhuǎn)化利用電擊法將轉(zhuǎn)化載體pPtc-GFP導(dǎo)入三角褐指藻葉綠體基因組中，具 體實(shí)施方式如下用培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)基(無(wú)Si)培養(yǎng)三角褐指藻，溫度為21 士 1°C，光照 強(qiáng)度為40001x，光暗比為12h 12h的人工智能氣候培養(yǎng)箱中；①離心收集1. OXlO7 IO8個(gè)三角褐指藻細(xì)胞，3000rpm離心lOmin。②加150 μ 1 1. Omol/LNaCl懸浮三角褐指藻細(xì)胞。③加150 μ 1 0. lmol/L甘露醇，混勻，冰上放置30min。④將步驟③制備的藻細(xì)胞液轉(zhuǎn)移到0.4cm電激杯內(nèi)，電激杯內(nèi)藻液以不超過(guò) 400 μ 1為宜，同時(shí)加質(zhì)粒PPtc-GFP (0. 4 μ g)混勻。⑤將電激杯放置好，調(diào)電穿孔儀(美國(guó)BIO-RAD公司MicroPulser 電穿孔儀)電 容至10F，電阻為400，電壓為1. 5kv，進(jìn)行電擊。⑥將電擊后的藻液轉(zhuǎn)移到50ml三角瓶中，加新鮮的f/2培養(yǎng)基10ml，暗處理2h， 再正常培養(yǎng)24h(12L 12D)。(5)篩選電擊法將載體pPtc-GFP導(dǎo)入三角褐指藻葉綠體基因組后，在平板上進(jìn) 行氯霉素抗性篩選，
具體實(shí)施例方式設(shè)置氯霉素篩選濃度為400 μ g/ml，固體培養(yǎng)基中除氯 霉素外，還加了氨芐和卡那抗生素以純化藻株，氨芐和卡那抗生素的最終濃度為IOOyg/ ml，將電擊后培養(yǎng)24h的全部藻液IOOOrpm離心5min，用f/2培養(yǎng)基懸浮藻細(xì)胞，涂板培養(yǎng)， 設(shè)一個(gè)對(duì)照和兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組。經(jīng)過(guò)7 10天的抗性篩選后，在固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的藻苔，挑取藻苔置 于液體的f/2培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基中也加入相同濃度的氯霉素、氨芐和卡那，經(jīng) 過(guò)10 15天的擴(kuò)大培養(yǎng)后，取20 μ 1左右藻液制成玻片，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察是 否有熒光發(fā)出。經(jīng)過(guò)氯霉素抗性篩選后長(zhǎng)出藻苔，圖5為葉綠體基因轉(zhuǎn)化GFP報(bào)告基因的 confocal圖(共聚焦圖)，報(bào)告基因的表達(dá)水平很高(如圖5a所示)，且定位于葉綠體內(nèi)表 達(dá)，與葉綠體的紅色自發(fā)熒光(如圖5b所示)完全共定位(如圖5d所示)，圖5c是激光共 聚焦顯微鏡明場(chǎng)下觀察到的陽(yáng)性三角褐指藻細(xì)胞，圖5說(shuō)明報(bào)告基因成功表達(dá)，利用三角 褐指藻葉綠體作為生物反應(yīng)器的方法被成功建立。圖6是對(duì)圖5上的GFP熒光進(jìn)行的平均熒光強(qiáng)度(Meanfluorescence intensity) 分析，利用AxioVision Rel. 4. 7 (Zeiss, Germany)軟件進(jìn)行，從圖中可以看出成功轉(zhuǎn)化 了 GFP的藻細(xì)胞的Meanfluorescence intensity都很高，平均每個(gè)轉(zhuǎn)基因藻細(xì)胞的值為 100. 41，沒(méi)有轉(zhuǎn)GFP的三角褐指藻的值僅為20. 37，從圖中可以看出成功轉(zhuǎn)化了 GFP的藻細(xì) 胞的Mean fluorescence intensity都很高，說(shuō)明外源基因在海洋微藻葉綠體中獲得高效 表達(dá)(Grey是指熒光轉(zhuǎn)成黑白時(shí)的灰度，也就是熒光強(qiáng)度)。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
10
權(quán)利要求
一種海洋微藻葉綠體表達(dá)載體，其特征在于該海洋微藻葉綠體表達(dá)載體包含同源重組序列I、目的基因表達(dá)盒和同源重組序列II；目的基因表達(dá)盒位于同源重組序列I和同源重組序列II之間；所述同源重組序列I如SEQ ID No.1所示，其中第1～972bp是編碼16s核糖體RNA小亞基基因的3’部分，第973～1097bp是trnI的5’部分；所述同源重組序列II如SEQ ID No.2所示，其中第1～196bp是trnA基因的3’部分，第197～1483bp是編碼23s核糖體RNA大亞基基因的5’部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述所述海洋微藻葉綠體表達(dá)載體，其特征在于該海洋微藻葉綠 體表達(dá)載體還包含抗性篩選表達(dá)盒或熒光蛋白表達(dá)盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述海洋微藻葉綠體表達(dá)載體，其特征在于所述的目的基因 表達(dá)盒由啟動(dòng)子、目的基因和終止子組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述海洋微藻葉綠體表達(dá)載體，其特征在于所述目的基因表達(dá)盒 的啟動(dòng)子為CaMV 35S啟動(dòng)子；所述目的基因表達(dá)盒的終止子為NOS終止子。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述海洋微藻葉綠體表達(dá)載體，其特征在于所述的抗性篩選表達(dá) 盒由啟動(dòng)子、抗性篩選標(biāo)記基因和終止子組成；所述的熒光蛋白表達(dá)盒由啟動(dòng)子、熒光蛋白 基因和終止子組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述海洋微藻葉綠體表達(dá)載體，其特征在于所述抗性篩選表達(dá)盒 的抗性篩選標(biāo)記基因?yàn)槁让顾乜剐曰?；所述熒光蛋白基因?yàn)榫G色熒光蛋白基因。
7.權(quán)利要求1或2所述海洋微藻葉綠體表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于所述海洋微藻 葉綠體表達(dá)載體應(yīng)用于在海洋微藻中表達(dá)外源蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于包含以下步驟通過(guò)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將海洋 微藻葉綠體表達(dá)載體轉(zhuǎn)入海洋微藻中，然后篩選得到目的基因表達(dá)的海洋微藻。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述基因轉(zhuǎn)移技術(shù)為電擊法；所述篩選的方式為通過(guò)抗性篩選或通過(guò)熒光蛋白篩選。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的海洋微藻為三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum)0
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種海洋微藻葉綠體表達(dá)載體及其應(yīng)用。該海洋微藻葉綠體表達(dá)載體包含同源重組序列I、目的基因表達(dá)盒和同源重組序列II；目的基因表達(dá)盒位于同源重組序列I和同源重組序列II之間；同源重組序列I的第1～972bp是rns的3’部分，第973～1097bp是trnI的5’部分；同源序列II的第1～196bp是trnA基因的3’部分，第197～1483bp是rnl的5’部分。該同源重組序列使得通過(guò)電擊法即可將表達(dá)載體導(dǎo)入海洋微藻葉綠體基因組中，方便了載體導(dǎo)入葉綠體基因組的途徑并大大降低了轉(zhuǎn)化成本，為實(shí)現(xiàn)利用海洋微藻葉綠體為生物反應(yīng)器生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品提供了技術(shù)支撐。
文檔編號(hào)C12N1/13GK101948871SQ20101028519
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者劉潔生, 朱聰聰, 李宏業(yè), 楊維東 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)