專利名稱：一種酶法合成Gal-sorbitol的方法
一種酶法合成Ga卜sorbitol的方法技術(shù)路線本發(fā)明涉及一種Gal-Sorbitol的酶法制備方法，具體地說(shuō)是一種利用β -D-半乳 糖苷酶催化乳糖和山梨糖醇合成Gal-Sorbitol的方法。
背景技術(shù)：
低聚糖(Oligosaccharides)是指由2 10個(gè)單糖組成的糖類，廣泛存在于各種 天然食物中。其中，功能性低聚糖具有某些獨(dú)特的生理活性，包括低甜度、低熱量，難以被 人體消化吸收，食用后基本不增加血糖、血脂并能防止齲齒發(fā)生。糖醇是一種多元醇，一般 具有與功能性低聚糖類似的生理功能和物理特性。一般來(lái)說(shuō)糖醇含有兩個(gè)以上的羥基，可 以由來(lái)源廣泛的、相應(yīng)的糖來(lái)制取，即將糖分子上的醛基或酮基還原成羥基而成糖醇。國(guó)外 把糖醇作為食糖替代品，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，添加糖醇的甜食品稱為無(wú)糖食品。糖醇因不 被口腔中微生物利用，又不使口腔PH降低，反而會(huì)上升，所以不腐蝕牙齒，是防齲齒的好材 料，糖醇對(duì)人體血糖值上升無(wú)影響且能為糖尿病人提供一定熱量，所以可作為糖尿病人提 供熱量的營(yíng)養(yǎng)性甜味劑。對(duì)于糖醇的合成，工業(yè)上采用的是傳統(tǒng)的化學(xué)方法?；瘜W(xué)法合成需要在高溫、高壓 的環(huán)境下進(jìn)行，造成其在基本建設(shè)投資及操作費(fèi)用上花費(fèi)較高，同時(shí)高壓氫氣易燃易爆容 易造成安全隱患，再加上用鎳作為催化劑在產(chǎn)品安全性方面也存在一定的問(wèn)題，并且還會(huì) 造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，總體來(lái)說(shuō)化學(xué)方法的工業(yè)化生產(chǎn)糖醇存在諸多的不足之處。近年來(lái)，一些科學(xué)們嘗試采用酶法合成一些雙糖醇。Klewicki (2000年)利用 脆壁克魯維酵母的0-0-半乳糖苷酶的水解和轉(zhuǎn)糖苷基作用合成了631-吐7讓1~^01、 Gal-xylitol 等。乳糖醇是一種雙糖醇，具有比乳糖穩(wěn)定，味覺(jué)和特性接近于砂糖等性質(zhì)，其代謝與 胰島素?zé)o關(guān)，不增加血糖濃度，可供糖尿病人食用；同時(shí)，乳糖醇能促進(jìn)人體腸道有益菌增 殖，具有低能量、低致齲齒性等特點(diǎn)。目前，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。作為 乳糖醇的同分異構(gòu)體Gal-Sorbitol也應(yīng)該存在潛在的生理功能和應(yīng)用，但國(guó)際上對(duì)其相 關(guān)研究很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是采用利用β-D-半乳糖苷酶催化乳糖和山梨糖醇合成 Gal-Sorbitol ο本發(fā)明的技術(shù)方案包括利用β -D-半乳糖苷酶來(lái)催化合成反應(yīng)，通過(guò)HPLC法檢測(cè) 各種反應(yīng)產(chǎn)物。HPLC法無(wú)法確定的產(chǎn)物通過(guò)進(jìn)一步的分離純化后，進(jìn)行1H-NMK13C-NMR和 ESI-TOF-MS分析確定其結(jié)構(gòu)組成。本發(fā)明專利以乳糖和山梨糖醇作為底物，由β-D-半乳糖苷酶來(lái)催化合成反應(yīng)， 得到乳糖醇的同分異構(gòu)體——Gal-β-(1 — 3) sorbitol。


圖1為β -D-半乳糖苷酶催化合成Gal-Sorbitol的酶反應(yīng)液中糖類組成的典型 HPLC圖譜圖2 為 Gal-Sorbitol 的質(zhì)譜 3 為 Gal-Sorbitol 的 1H-NMR 圖譜圖 4 為 Gal-Sorbitol 的 13C-NMR 圖譜
具體實(shí)施例方式1、酶法合成反應(yīng)稱取0. 4g乳糖和0. 2g山梨糖醇置于螺口瓶中，再加入一定量蒸餾水后進(jìn)行高壓 處理(12rC，20min)，使其完全溶解得到過(guò)飽和溶液，自然冷卻至反應(yīng)溫度40°C。然后加入 適量的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(PH6.0)和蒸餾水調(diào)整溶液濃度至40% (w/v) 0稱取一定量 的半乳糖苷酶(3U/mL)加入上述體系并置于40°C水浴中開始反應(yīng)，然后每隔一定時(shí)間 取樣，沸水浴IOmin使酶滅活。用純凈水稀釋一定倍數(shù)以后，進(jìn)行HPLC分析。2、反應(yīng)產(chǎn)物的測(cè)定方法采用HPLC外標(biāo)法測(cè)定產(chǎn)物的含量。(1)糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。準(zhǔn)確稱取Gal-Sorbitol (經(jīng)純化得到)的標(biāo)準(zhǔn)樣品，用 水溶解后，加入等量的乙腈，配制成一系列不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0. 45 μ m濾膜過(guò)濾 后，按濃度從低到高的順序進(jìn)HPLC檢測(cè)，記錄各個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的峰面積，以各個(gè)濃度及其對(duì) 應(yīng)峰面積作圖，得到各個(gè)糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)色譜條件。色譜柱Sugar-D (4. 6X 250mm，5 μ m，Nacalai Tesque Inc.，日本)； 柱溫:40°C ；流動(dòng)相乙腈水=75 25 (ν/ν)；流速1. OmL/min ；進(jìn)樣量:20μ L。(3)根據(jù)糖標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各種糖含量。3、反應(yīng)產(chǎn)物Gal-sorbitol的純化與結(jié)構(gòu)鑒定經(jīng)HPLC分析，Gal-Sorbitol是合成反應(yīng)的主要產(chǎn)物，由于這是一種新型合成的 物質(zhì)，無(wú)法確定其結(jié)構(gòu)組成。因此對(duì)Gal-Sorbitol進(jìn)行分離純化，純化得到的樣品進(jìn)行 1H-NMR, 13C-NMR和ESI-TOF-MS分析確定其結(jié)構(gòu)組成。反應(yīng)進(jìn)行到4h以后，沸水浴IOmin中止反應(yīng)。反應(yīng)液加適量的去離子水稀釋后， 經(jīng)0.45 μ m濾膜過(guò)濾，濾液過(guò)活性炭-硅藻土(1 1, w/w)中壓層析柱。層析柱用一系列 線性濃度梯度(0% 40%)的乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液經(jīng)苯酚硫酸法初步檢測(cè)后，收集其中 含糖的洗脫液，進(jìn)一步通過(guò)HPLC檢測(cè)各峰洗脫液中的糖組分。收集Gal-Sorbitol組分，合 并、濃縮、干燥。純化得到的Gal-Sorbitol樣品進(jìn)行1H-NMRj3C-NMR和ESI-TOF-MS分析， 1H-NMK13C-NMR分析時(shí)以D2O為溶劑，四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)。
權(quán)利要求
一種新型的合成Gal Sorbitol的方法，其特征是利用乳糖和山梨糖醇為底物，在β D 半乳糖苷酶的催化下合成Gal Sorbitol，并分離純化產(chǎn)物Gal Sorbitol。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成Gal-Sorbitol的方法，其特征在于底物的濃度為40%， 而且底物乳糖和山梨糖醇的起始濃度比為1 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成Gal-Sorbitol的方法，其特征在于利用β-D-半乳糖苷 酶制備Gal-Sorbitol時(shí)，適宜的反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度40°C，ρΗ為6. 0，酶量為3U/mL，反應(yīng) 時(shí)間為4小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成Gal-Sorbitol的方法，其特征在于產(chǎn)物Gal-Sorbitol 的分離純化方法為反應(yīng)液經(jīng)沸水浴滅活I(lǐng)Omin后，加適量的去離子水稀釋，經(jīng)0. 45 μ m 濾膜過(guò)濾，濾液過(guò)活性炭-硅藻土(1 l，w/V)中壓層析柱。層析柱用一系列線性濃 度梯度(0% 40%)的乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液經(jīng)苯酚硫酸法與HPLC法檢測(cè)后，收集含 Gal-Sorbitol的洗脫液，并濃縮、干燥，得到白色粉末狀的Gal-Sorbitol。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成Gal-Sorbitol的方法，其特征在于產(chǎn)物Gal-Sorbitol 的結(jié)構(gòu)鑒定方法為純化得到的Gal-Sorbitol樣品進(jìn)行1H-NMRj3C-NMR和ESI-TOF-MS分 析。
全文摘要
本發(fā)明專利是一種酶法制備Gal-Sorbitol的方法。對(duì)于糖醇的合成，工業(yè)上采用的是傳統(tǒng)的化學(xué)方法。需要在高溫、高壓的環(huán)境下進(jìn)行，造成其在基本建設(shè)投資及操作費(fèi)用上花費(fèi)較高，同時(shí)高壓氫氣易燃易爆容易造成安全隱患，其催化劑在產(chǎn)品安全性方面也存在一定的問(wèn)題，并且還會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。本發(fā)明以乳糖和山梨糖醇作為底物，由來(lái)源于環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或青霉(Penicillium chrysogenum)等的β-D-半乳糖苷酶作為催化劑，通過(guò)催化合成、柱層析制備得到乳糖醇的同分異構(gòu)體——Gal-β-(1→3)Sorbitol。體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明Gal-Sorbitol具有益生作用。
文檔編號(hào)C12P19/14GK101979637SQ201010286820
公開日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月20日
發(fā)明者葉紅, 唐淑芬, 孫怡, 曾曉雄, 李偉 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)