專利名稱：擬南芥基因AtSDH在調控植物抗脅迫方面的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種擬南芥基因AtSDH的應用，尤其涉及該基因在調控植物抗逆境脅 迫方面的應用，以及該基因在培育抗逆境脅迫轉基因植物品種方面的應用，屬于基因工程 領域。
背景技術：
植物生長發(fā)育過程中，不正常的生長條件，如干旱、溫度過低或過高、土壤鹽離子 濃度過高等都會引起植物體內的離子失衡和高滲脅迫，導致植物發(fā)育不良、生長緩慢特別 是降低農作物產量、甚至導致植物死亡。因此，隨著環(huán)境的逐步惡化和耕地面積的減少，通 過提高作物的抗逆性以提高糧食的產量越來越受到人們的重視。在逆境條件下，植物通過產生滲透調節(jié)物質來減輕脅迫造成的傷害。在蘋果等植 物中，水分脅迫下更多的葡萄糖轉化為山梨醇，且水分脅迫抑制了山梨醇向淀粉的轉化，表 明山梨醇可能是一種重要的滲透調節(jié)物質，但山梨醇參與植物抗逆的機理目前還不清楚。 推測山梨醇可能通過保護膜脂過氧化而降低對細胞的傷害作用。已知，山梨醇脫氫酶催化 以下可逆反應
果糖+NAD+ 4 山梨醇+NADH+ H+在逆境脅迫條件下，植物體內會積累超氧陰離子自由基，山梨醇脫氫酶催化山梨 醇合成的同時生成H+，H+可以在超氧化物歧化酶的作用下接收超氧陰離子自由基中的高能 電子，緩解超氧陰離子自由基對細胞的傷害；另外，山梨醇脫氫酶催化山梨醇合成或分解的 同時還涉及NAD+和NADH的轉化，NAD+和NADH的數量和濃度在植物的糖酵解和三羧酸循環(huán) 中起重要作用，山梨醇脫氫酶可能起到調節(jié)NAD+和NADH平衡的作用。ABA是植物體內一種重要的激素，參與干旱等多種脅迫反應，目前我們已經對ABA 參與的脅迫反應中的信號轉導途徑有所了解。并且，ABA還能通過調控糖代謝中如酸性轉 化酶等多種酶的含量和活性而調控糖代謝。但對于ABA是否能夠通過調控山梨醇代謝而提 高植物抗逆境脅迫的能力，目前還不清楚。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種擬南芥基因AtSDH在調控植物抗逆境脅迫方面的應用。進一步的，本發(fā)明的目的還在于提供一種擬南芥基因AtSDH在培育抗逆轉基因植 物方面的應用。為了實現上述目的，本發(fā)明的技術方案采用了 一種擬南芥基因AtSDH在調控植物 抗逆境脅迫方面的應用。所述的基因AtSDH在GenBank中的編號為AYl33848 (At5g51970)，該基因的CDS長 度為1095bp，編碼364個氨基酸的蛋白。
本發(fā)明通過采用⑶S組織定位和GFP融合蛋白的細胞定位方法，分析AtSDH基因 的組織和細胞表達特性。所述的基因AtSDH表達產物定位于細胞質胞漿內，該基因主要在 葉片和根中表達。所述的基因AtSDH參與干旱、NaCl等逆境脅迫。從擬南芥資源中心(ABRC)獲得 的 AtSDH/ 基因 T-DNA 插入的缺失突變體 SALK 035903 (sdh-1)、SALK 020855 (sdh-2)的純 合體比對干旱、NaCl等脅迫的敏感性增強。所述的基因AtSDH參與激素ABA調控的逆境脅迫反應。本發(fā)明利用從ABRC獲得 的AtSDH基因T-DNA插入的缺失突變體，研究發(fā)現缺失突變體sdh_l和sdh_2對ABA的敏 感性提高。同時，本發(fā)明的技術方案還采用了一種擬南芥基因AtSDH在培育抗脅迫轉基因植 物方面的應用。所述的基因AtSDH在GenBank中的編號為AYl33848 (At5g51970)，該基因的CDS長 度為1095bp，編碼364個氨基酸的蛋白。將AtSDH基因編碼區(qū)序列連接到表達載體上，通 過農桿菌介導的轉化方法獲得轉基因植物。超表達AtSDH基因的擬南芥對ABA的敏感性下 降，抵抗干旱、NaCl等逆境脅迫的能力提高。本發(fā)明編號為At5g51970 的 AtSDH(Sorbitol Dehydrogenase)基因編碼一個山 梨醇脫氫酶，定位于細胞漿內，通過逆境信號分子ABA在植物抵抗逆境脅迫中具有重要作 用。缺失該基因降低植物抗逆境脅迫能力，超表達該基因可以提高植物對逆境脅迫的抵抗 能力。本發(fā)明通過對AtSDH基因的缺失和超表達分析，確立了 AtSDH在調控植物抗逆境脅 迫中的作用。在農業(yè)生產上利用此基因可以使植物的生長更耐受干旱、高鹽等不利的環(huán)境 因素，為培育轉基因作物新品種奠定基礎。


圖1是AtSDH基因在擬南芥根細胞㈧和葉片表皮細胞⑶中的亞細胞定位；圖2為超表達AtSDH基因和缺失突變體sdh的擬南芥在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)、生長(A B)和在培養(yǎng)基質上開花、結實(C)情況；圖3超表達AtSDH基因和缺失突變體sdh擬南芥在含有0. 7 μ MABA的MS培養(yǎng)基 上萌發(fā)；圖4缺失突變體sdh擬南芥種子在含150mM NaCl的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)㈧和超表 達AtSDH基因及缺失突變體sdh擬南芥在150mM NaCl MS培養(yǎng)基上生長(B)以及在澆灌 150mMNaCl的培養(yǎng)基質上生長1_4周的情況(C-F)；圖5超表達AtSDH基因和缺失突變體sdh擬南芥在含375mM甘露醇的MS培養(yǎng)基 上萌發(fā)(A)、生長(B)和培養(yǎng)基質上停止?jié)菜?周后植株的生長情況(C)；圖1-5中WT為野生型擬南芥；35S :SDH_2，35S :SDH_8為兩個超表達AtSDH基因 的擬南芥株系；sdh-1，sdh-2分別為AtSDH基因在啟動子區(qū)域和編碼區(qū)區(qū)域插入的T-DNA 缺失突變體純合體。具體發(fā)明實施方式實施例1缺失突變體純合體的篩選，表型和遺傳學分析
從擬南芥資源中心(Arabidopsis Biological Resource Center)購買的 AtSDH 基因啟動子區(qū)域和編碼區(qū)區(qū)域插入的T-DNA缺失突變體SALK 035903 (sdh-Ι)和SALK 020855 (sdh-2)，利用PCR法篩選純合突變體，引物分別為SALK_035903LP 5' -CGAATTGGGTTTTAAAAATTCG-3‘RP 5' -TGGATGGCTTATCGAGTTTTG-3‘SALK_020855 LP 5' -TGAAAGCTGTTGGTATTTGTGG-3‘RP 5' -CTACCTCCCTGTCTCCAAACC-3‘T-DNA (BP)引物5 ‘ -TCAAACAGGATTTTCGCCTGCT-3 ‘對T-DNA插入純合突變體sdh-Ι，sdh-2的進行RT-PCR分析，結果表明在突變體中 該基因在轉錄水平不表達。對缺失純合突變體植株在正常和脅迫條件下的生長發(fā)育進行分 析。實施例2AtSDH基因的克隆，載體的構建，轉基因植株的篩選從擬南芥基因組中利用PCR方法擴增分離得到AtSDH的啟動子序列，連接到 PCAMBIA1391的⑶S報告載體；從擬南芥中提取RNA，反轉錄成cDNA，從cDNA中擴增AtSDH 的⑶S序列，分別連接到pBI121的超表達載體和PBI121-GFP亞細胞定位載體；農桿菌介導 轉化獲得轉基因陽性植株。從擬南芥信息資源 tair(The Arabidopsis Information Resource)上查找 AtSDH整個基因組序列，然后從起始密碼子ATG之前取包括TATAbox等序列在內的1551bp， 并且包括ATG之后第一個外顯子和第一個內含子序列，共計1779bp，然后設計引物，根 據pCAMBIA1391-GUS載體的多克隆位點，選擇Sal I/BamHI酶切位點，設計引物時引入 酶切位點序列。以野生型擬南芥基因組DNA為模板，PCR擴增AtSDH啟動子序列，連接 到pCAMBIAl391-GUS載體，構建重組載體pCAMBIA1391_AtSDHp_GUS。并同時根據擬南芥 AtSDHCDS序列設計引物，并在引物兩端分別加入酶切位點Xbal/SacI和Xbal/Kpnl以引入 表達載體PBI121，分別構建重組質粒pBI121-AtSDH和pBI121-AtSDH-GFP，并由PCR、測序和 酶切鑒定。將構建好的載體轉入農桿菌GV3101，篩選陽性克隆。常規(guī)方法轉化擬南芥花蕾。 將攜帶有 pCAMBIA1391-AtSDHp-⑶S、pBI121_AtSDH 和 pBI121_AtSDH_GFP 重組載體的農桿 菌分別轉化野生型擬南芥。對得到的種子進行篩選鑒定。載體pCAMBIA1391和pBI121分別帶有潮霉素抗性 基因和卡那霉素抗性基因，將收獲的種子用含潮霉素和卡那霉素的MS培養(yǎng)基分別篩選，對 得到的抗性苗進行PCR鑒定，收獲陽性植株的種子。對攜帶有AtSDHp-GUS的轉基因植株進行⑶S組織化學染色，用于分析AtSDH的時 空表達情況；對攜帶AtSDH-GFP的轉基因植株進行亞細胞定位分析；AtSDH超表達植株進行 正常和脅迫條件下的表型分析。實施例3AtSDH基因的表達分析
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對攜帶有AtSDHP-GUS的轉基因植株進行⑶S組織化學染色，結果表明AtSDH主要 在植物的根部和幼葉表達。利用激光共聚焦顯微鏡對攜帶AtSDH-GFP的轉基因擬南芥進行 GFP融合蛋白定位分析，表明該基因編碼的蛋白定位在細胞質中(圖1)。分別利用葉綠體 的自發(fā)熒光、線粒體、過氧化酶體、高爾基體和內質網熒光標記探針檢測排除該蛋白在以上 細胞器的定位，確定該基因編碼的蛋白定位在細胞質的胞質溶膠中。實施例4超表達AtSDH因和缺失突變體sdh擬南芥對ABA的敏感性分析對ABA的敏感性上，超表達和缺失突變體擬南芥與野生型擬南芥相比都發(fā)生變 化，說明AtSDH基因參與ABA的調控過程。將擬南芥種子消毒后播種于含0. 7 μ MABA的 MS固體培養(yǎng)基上，4°C暗處放置24小時，在22°C，16小時光照(lOOymol/n^/s)下垂直培 養(yǎng)1周后，超表達AtSDH因擬南芥對ABA的敏感性降低，2個超表達AtSDH因的擬南芥株系 (35S :SDH-8，35S :SDH_8)的種子都能生根并能長出綠色子葉，野生型擬南芥有60%的子葉 為黃色，僅有下胚軸而不能生根(圖2，A)。缺失突變體的擬南芥對ABA的敏感性提高，在 含0. 7 μ M ABA的MS培養(yǎng)基上，相同條件水平培養(yǎng)1周后，突變體基本不能生根，子葉較小 且呈黃色(圖2，B)。實施例5正常和脅迫條件下超表達AtSDH因和缺失突變體sdh擬南芥的生長分析正常條件下(溫度22°C，光照強度100 μ mol/m2/s, 16小時光照)，超表達AtSDH因 和缺失突變體sdh擬南芥在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)(圖3，A)、生長(圖2，B)和在培養(yǎng)基質上開 花、結實等發(fā)育過程與野生型擬南芥無明顯差異(圖3，C)。超表達AtSDH因的擬南芥抵抗NaCl脅迫的能力增強，缺失突變體擬南芥的萌發(fā)和 生長都受到顯著抑制。將野生型和缺失突變體擬南芥種子消毒后播種于含150mM NaCl的 MS固體培養(yǎng)基上，4°C暗處放置24小時，在常規(guī)條件下(溫度22°C，光照強度100 μ mol/m2/ s, 16小時光照)生長1周后，缺失突變體種子萌發(fā)和幼苗生長受到顯著抑制(圖4，A)。將 MS培養(yǎng)基上常規(guī)條件下生長1周的擬南芥移到含有150mM NaCl的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)， 1周后超表達AtSDH因擬南芥幼苗長出兩片較大的真葉，野生型擬南芥長出的真葉較小，而 缺失突變體sdh幼苗無真葉長出，且超表達擬南芥幼苗的根較野生型擬南芥長，缺失突變 體的根比野生型擬南芥短(圖4，B)。將以上3種擬南芥種子播于培養(yǎng)基質中，常規(guī)條件下 培養(yǎng)4周后，開始澆灌150mM NaCl。澆灌1_4周后觀察到植株生長情況如圖4C-F所示。澆 灌1周后，缺失突變體、超表達和野生型擬南芥無明顯差異(圖4，C)。2周后缺失突變體 sdh和野生型擬南芥部分葉片開始干枯變黃，超表達植株葉片仍呈綠色、部分葉片變成褐色 (圖4，D)。澆灌3周后超表達AtSDH因的擬南芥株系8(35S :SDH_8)部分葉片開始發(fā)黃干 枯，株系2(35S :SDH-2)葉片仍呈綠色或褐色，而缺失突變體和野生型擬南芥大部分植株已 經干枯死亡(圖4，E)。澆灌4周后缺失突變體基本全部死亡，野生型擬南芥絕大部分植株 干枯死亡，而超表達擬南芥株系8約一半植株死亡，株系2僅有少數植株干枯死亡(圖4， F)。在干旱和滲透脅迫條件下，超表達AtSDH因的擬南芥幼苗和植株的抵抗和忍耐能 力提高，缺失突變體sdh擬南芥的抵抗能力降低。將種子播于含有375mM的MS培養(yǎng)基上， 4°C暗處放置24小時后，常規(guī)條件下培養(yǎng)10天后，突變體sdh-Ι和sdh-2的子葉呈黃色，僅有下胚軸無根長出。野生型擬南芥有40%種子能生根并長出綠色子葉。超表達AtSDH因 的擬南芥兩個株系分別有為86%和72%的種子能生根和長出綠色子葉(圖5，A)。將相同 條件下于MS培養(yǎng)基上生長1周的幼苗移到含375mM甘露醇的MS培養(yǎng)基上垂直培養(yǎng)，1周后 超表達的擬南芥幼苗與野生型和突變體相比，根系較長，且有真葉長出(圖5，B)。將以上 3種類型的擬南芥種子播于培養(yǎng)基質中，常規(guī)條件下培養(yǎng)3周后，以不澆水作為干旱脅迫處 理。處理3周后，超表達植株仍能生長正常，野生型擬南芥葉片開始輕度萎焉，而缺失突變 體植株葉片已經嚴重萎焉(圖5，C)。
權利要求
擬南芥基因AtSDH在調控植物抵抗逆境脅迫中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述的基因AtSDH(Arabidopsis sorbitol dehydrogenase)在 GenBank 中的編號為 At5g51970，該基因的 CDS 全長為 1095bp，編碼364個氨基酸的蛋白。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述的基因AtSDH參與逆境脅迫激素ABA 調控的植物生長發(fā)育觀察。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述的基因AtSDH編碼一種定位于細胞 質溶膠的山梨醇脫氫酶。
5.一種擬南芥基因AtSDH在培育抗脅迫轉基因植物方面的應用。
6.根據權利要求5所述的擬南芥基因AtSDH在培育抗逆境脅迫轉基因植物方面的應 用，其特征在于將AtSDH基因或其中部分片段連接到不同種類的載體上，通過不同的表達 載體轉化獲得抗逆相關的轉基因植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種擬南芥基因AtSDH的應用，涉及該基因在調控植物抗逆境脅迫方面的應用，以及該基因在培育抗逆境脅迫轉基因植物品種方面的應用。本發(fā)明通過對超表達轉基因植株和缺失突變體對ABA的敏感性和逆境條件下生長分析，確立了AtSDH在擬南芥逆境脅迫中的作用與植物激素ABA有關，為理解植物山梨醇代謝在植物抗逆境脅迫中的作用提供了重要依據。在農業(yè)生產上利用該基因可以使幼苗和植株的生長更耐受逆境脅迫，為培育轉基因作物新品種奠定理論基礎。與野生型擬南芥相比，AtSDH基因超表達的轉基因擬南芥對ABA的敏感性下降，幼苗和植株耐受干旱、高鹽等逆境脅迫的能力提高。
文檔編號C12N15/53GK101955955SQ20101028798
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月17日 優(yōu)先權日2010年9月17日
發(fā)明者王秀玲, 高新起 申請人:山東農業(yè)大學