專(zhuān)利名稱：酶法提取植物黃酮化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種酶法提取植物黃酮化合物的方法。
背景技術(shù)：
植物是人類(lèi)可以利用的最豐富自然資源，植物中所含有的黃酮類(lèi)生物活性物質(zhì)是 食品、化工和醫(yī)藥工業(yè)原料的主要來(lái)源。但是，在植物體內(nèi)這些黃酮類(lèi)物質(zhì)以不同的糖苷形 式，分布于植物體內(nèi)不同的部位，如銀杏、柿子、核桃、山楂、香椿等的果實(shí)、葉片、根莖等。這 些功效物質(zhì)一般在植物果實(shí)中苷元型黃酮類(lèi)含量更多一些，但是在植物莖葉中以低活性的 黃酮糖苷類(lèi)物質(zhì)所占的比例更高，但是含量卻比果實(shí)高。因此，富集植物莖葉中的黃酮類(lèi)生 物活性物質(zhì)，利用化學(xué)或生物技術(shù)加以修飾改性，提高其生物活性和生物可利用率，具有重 要的理論與實(shí)際意義。黃酮類(lèi)化合物廣泛存在于植物的各個(gè)部位，尤其是花、葉部位，主要存在于蕓香 科、唇形科、豆科、傘形科、銀杏科與菊科中，如苦蕎、山楂、桑葉、銀杏葉、竹葉、可可、葛根 等。有文獻(xiàn)估計(jì)約有20%的中草藥中含有黃酮類(lèi)化合物，可見(jiàn)其資源之豐富。自1814年發(fā) 現(xiàn)的第一個(gè)黃酮類(lèi)化合物——白楊素以來(lái)，到1980年以分離出黃酮類(lèi)化合物約2700種。黃酮類(lèi)物質(zhì)是色原酮或色原烷的衍生物，以C6-C3-C6結(jié)構(gòu)為基本母核的天然產(chǎn) 物，即兩個(gè)苯環(huán)通過(guò)3個(gè)碳原子結(jié)合而成。其中C3部分可以是脂鏈，或與C6部分形成六元 或五元氧雜環(huán)。黃酮類(lèi)物質(zhì)主要由花色素、黃酮醇、黃酮、兒茶酚和黃烷酮組成，其中以黃酮 醇類(lèi)最為常見(jiàn)，其次是黃酮類(lèi)，其余則較少見(jiàn)，多具有顏色。這些黃酮糖甙類(lèi)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)又 包括甙和甙元兩類(lèi)，植物界中的黃酮類(lèi)化合物大部分以糖甙的形式存在，一部分以游離甙 元形式存在。這些物質(zhì)對(duì)減少器質(zhì)性病變，諸如癌癥、動(dòng)脈硬化的發(fā)病率起到了重要作用。作為藥理因子，黃酮類(lèi)化合物具有降血壓、降血脂、防止血栓形成、防治心腦血管 疾病、增強(qiáng)免疫、降低血管脆性、改善心腦血管血液循環(huán)等作用。黃酮類(lèi)化合物在體內(nèi)代謝 快，與維生素C相似，過(guò)多時(shí)通過(guò)尿液排出體外。黃酮類(lèi)化合物由于代謝快，在體內(nèi)不蓄積， 需要經(jīng)常補(bǔ)充。人體自身不能合成類(lèi)黃酮，必須從食物中得到，食物來(lái)源是谷物、蔬菜、水 果、果汁、茶葉等。在國(guó)外，苷元型黃酮是黃酮類(lèi)產(chǎn)品生產(chǎn)和研究的熱點(diǎn)。目前在日本已經(jīng)有多種苷 元型黃酮的生產(chǎn)，其最有代表性的苷元型黃酮產(chǎn)品即為大豆異黃酮苷元的生產(chǎn)。技術(shù)上采 用化學(xué)法或生物轉(zhuǎn)化方法。化學(xué)法產(chǎn)品質(zhì)量差，副產(chǎn)物多。在國(guó)內(nèi)，糖苷型黃酮的生物轉(zhuǎn)化 和苷元型黃酮的研究和生產(chǎn)的報(bào)道很少。為了充分提取不同極性的黃酮化合物，在實(shí)際生 產(chǎn)中通常采用極性低的有機(jī)溶劑或水提等方法。由于對(duì)醫(yī)藥產(chǎn)品和保健品的安全要求，醇 水多成為常用提取溶劑，提取效率往往偏低。為了解決這些問(wèn)題，需要確立高效清潔的植物 提取技術(shù)。近年，酶法提取藥用植物已成為中藥提取研究的重要方法。由于植物莖葉中的 總黃酮幾乎都被以纖維素為主體的細(xì)胞壁所包圍，這些細(xì)胞間尚有原果膠粘結(jié)，因此，應(yīng)用 以纖維素酶和果膠酶為主的復(fù)合酶液對(duì)植物葉進(jìn)行酶解，然后提取，可以大大提高總黃酮 得率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種酶法提取植物黃酮化合物的方法，本方法成本低廉，總黃酮得率高，適于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種酶法提取植物黃酮化合物的方法，步驟如下(1)浸提將植物葉片粉碎成葉粉，將該葉粉裝入萃取罐，加入溶劑進(jìn)行提取。其 中酶解水提一遍，醇提二遍，具體為第一遍酶解水提加入為原料六倍量體積的水，以及為原料重量0. 1-0. 5%的復(fù) 合酶，保持溫度50°C，提取2h，過(guò)濾；第二遍加入為原料五倍量體積的70% -80%的乙醇溶劑，提取溫度70°C -80°C, 提取2h，過(guò)濾；第三遍加入為原料五倍量體積的70% -80%的乙醇溶劑，提取溫度70°C -80°C, 提取lh，過(guò)濾；合并第一遍和第二遍提取液，用脫味鍋進(jìn)行濃縮脫除乙醇溶劑，濃縮成為水溶液， 放置沉淀3小時(shí)后進(jìn)行離心分離，得到上清液；第三遍提取液直接沉淀即可，合并上清液；(2)上柱純化取分離后的上清液以lBV/h流速上柱，然后用水沖洗，沖洗流速為2BV/h，棄去流 出液，用70%乙醇溶劑0. 8-1倍流速解析，換上80%乙醇溶劑后當(dāng)流出液流出后開(kāi)始接收 解析液；(3)處理解析液將得到的解析液減壓濃縮以除去乙醇，然后將濃縮液再加去離子水調(diào)整固形物含 量，進(jìn)行噴霧干燥，得到植物黃酮化合物產(chǎn)品。而且，所述復(fù)合酶中果膠酶纖維素酶=6-7 3-4，為質(zhì)量比。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1、本發(fā)明利用微生物復(fù)合酶對(duì)黃酮配糖體分子結(jié)構(gòu)中的活性點(diǎn)、基本活性結(jié)構(gòu)及 可能的作用基團(tuán)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，再通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行吸附生產(chǎn)出療效好、附加值高的 銀杏黃酮甙元生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。2、本發(fā)明應(yīng)用以纖維素酶和果膠酶為主的復(fù)合酶液對(duì)植物葉進(jìn)行酶解，然后用水 提取，可以大大提高總黃酮得率。另外，由于植物黃酮化合物在植物細(xì)胞中以甙元和糖甙兩 種形式存在，在醇水體系中甙元由于其極性低不易被提取，黃酮甙元以90-95%高濃度乙醇 提取，黃酮糖甙以60%左右乙醇才能進(jìn)行提取。因此利用轉(zhuǎn)苷酶和糖等糖基供體將極性低 的黃酮甙元、黃酮苷轉(zhuǎn)為更高極性的黃酮苷，從而提高總黃酮在醇水中的提取率。同時(shí)，由 于被提取的物質(zhì)極性的增加，可望在低濃度的純水體系中進(jìn)行提取，從而可以減少乙醇用 量，降低成本。3、本發(fā)明以生物技術(shù)理論、天然產(chǎn)物化學(xué)理論和技術(shù)、國(guó)際藥物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為指導(dǎo)， 制定生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)方案，確定適宜的酶法提取工藝和黃酮糖苷生物轉(zhuǎn)化工藝，獲得高生物效價(jià) 的產(chǎn)物。確定復(fù)合多種酶制劑，優(yōu)化最佳轉(zhuǎn)化條件，提高黃酮的生物轉(zhuǎn)化效率。制定大孔吸 附樹(shù)脂的吸附技術(shù)方案，用于工業(yè)化生產(chǎn)，提高產(chǎn)品中苷元型黃酮的含量。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限 定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1，以銀杏葉為例。一種酶法提取植物黃酮化合物的方法，步驟如下(1)浸提將銀杏葉粉碎成20目銀杏葉粉，稱取450kg銀杏葉粉裝入萃取罐，加入溶劑進(jìn)行 提取。酶解水提一遍，醇提二遍。其中銀杏葉采自天津薊縣的干銀杏葉。第一遍酶解水提加入2700L的水，0. 1 %的復(fù)合酶，該復(fù)合酶中果膠酶纖維素 酶=7 3(質(zhì)量比)，其中保持溫度50°C，提取2h，過(guò)濾；本實(shí)施例所用的果膠酶及纖維素 酶為天津市諾奧科技有限公司的市售產(chǎn)品。第二遍加入2250L 80%的乙醇溶劑，提取溫度70°C，提取2h，過(guò)濾；第三遍加入2250L 80%的乙醇溶劑，提取溫度70°C，提取lh，過(guò)濾；合并第一遍和第二遍提取液，用脫味鍋進(jìn)行濃縮脫除乙醇溶劑。濃縮到溶液2000L 左右，成為水溶液，放置沉淀3小時(shí)后進(jìn)行離心分離，得到上清液。第三遍提取液，不用濃 縮，直接用于第二輪的提取。(2)上柱純化取分離后的上清液以lBV/h流速上柱，然后用1200L水沖洗，沖洗流速為2BV/h，棄 去流出液。用70%乙醇溶劑0.8倍流速解析，換上80%乙醇溶劑后當(dāng)流出液流出IOL后開(kāi) 始接收，最后解析溶劑用量為900L。本工步中，所用大孔吸附樹(shù)脂包括HPD600 (滄州寶恩化 工有限公司)；YWD01G3、YWD01F、07C (滄州遠(yuǎn)威化工有限公司)；ABS_17、AB_8 (天津南開(kāi)大 學(xué)化工廠)，均為市售產(chǎn)品。(3)處理解析液將得到的解析液減壓濃縮到大約還剩80L，除去乙醇，然后將濃縮液再加去離子水 調(diào)整固形物含量，進(jìn)行噴霧干燥，得到銀杏葉黃酮化合物產(chǎn)品。(4)產(chǎn)品檢測(cè)檢測(cè)產(chǎn)品黃酮含量、得率、銀杏酸含量、銀杏內(nèi)酯含量等。(5)結(jié)論乙醇為溶劑提取銀杏葉總黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取率明顯高于水提取法。添加復(fù)合酶水 解后，再用80%乙醇溶液提取黃酮類(lèi)物質(zhì)的效果明顯，得率提高16%，而且粗提物的量減 少，黃酮物質(zhì)的純度提高了 18.9%，這不但提高了黃酮物質(zhì)的收得率，也為后續(xù)的上柱分離 純化減輕了負(fù)擔(dān)，提高了產(chǎn)品中黃酮的含量。通過(guò)初步計(jì)算，1噸銀杏葉原料使用復(fù)合酶增加成本為120元，按照總黃酮提取率 提高了 7%計(jì)算，可增加提取物的產(chǎn)量大約1千克，增加收入1020元。實(shí)施例2，以沙棘杏葉為例。(1)浸提將試驗(yàn)需要的沙棘杏葉粉碎成20目沙棘葉粉，稱取450kg該沙棘葉粉裝入萃取 罐，加入溶劑進(jìn)行提取。提取三遍第一遍酶解水提加入2700L的水，0. 2%的復(fù)合酶，該復(fù)合酶中果膠酶纖維素酶=6 4(質(zhì)量比)，提取溫度501，提取211，過(guò)濾；第二遍加入2700L 70%的乙醇溶劑，提取溫度75°C，提取2h，過(guò)濾；第三遍加入2700L 70%的乙醇溶劑，提取溫度75°C，提取lh，過(guò)濾；合并第一遍和第二遍提取液，濃縮到溶液2000L左右，放置沉淀，3小時(shí)后進(jìn)行離 心分離，得到上清液。第三遍提取液，不用濃縮，直接用于第二輪的提取。(2)上柱純化取分離后的溶液以lBV/h流速上柱，然后用1200L水沖洗，沖洗流速為2BV/h，棄去 流出液。用70%乙醇溶劑lBV/h流速解析，換上80%乙醇溶劑，出液流出IOL后開(kāi)始接收， 最后解析溶劑用量為900L。(3)處理解析液將得到的解析液減壓濃縮到大約還剩100L，除去乙醇，然后將濃縮液再加去離子 水調(diào)整固形物含量，大約為30%左右，進(jìn)行噴霧干燥，得到產(chǎn)品，進(jìn)行稱量及檢測(cè)。(4)檢測(cè)產(chǎn)品黃酮含量、得率等。(5)結(jié)論酶解條件復(fù)合酶酶解法提取沙棘葉黃酮的效果更好，加入復(fù)合酶時(shí)提取率明顯 升高，尤其是在果膠酶與纖維素酶之比為6 4時(shí)，得率最高，為4. 82%，比未采用酶解工藝 單純乙醇溶液提取的方法提高17%左右。
權(quán)利要求
一種酶法提取植物黃酮化合物的方法，其特征在于步驟如下(1)浸提將植物葉片粉碎成葉粉原料，將該葉粉原料裝入萃取罐，加入溶劑進(jìn)行提取。其中酶解水提一遍，醇提二遍，具體為第一遍酶解水提加入為原料六倍量體積的水，以及為原料重量0.1 0.5％的復(fù)合酶，保持溫度50℃，提取2h，過(guò)濾；第二遍加入為原料五倍量體積的70％ 80％的乙醇溶劑，提取溫度70℃ 80℃，提取2h，過(guò)濾；第三遍加入為原料五倍量體積的70％ 80％的乙醇溶劑，提取溫度70℃ 80℃，提取1h，過(guò)濾；合并第一遍和第二遍提取液，用脫味鍋進(jìn)行濃縮脫除乙醇溶劑，濃縮成為水溶液，放置沉淀3小時(shí)后進(jìn)行離心分離，得到上清液；第三遍提取液直接沉淀即可，合并上清液；(2)上柱純化取分離后的上清液以1BV/h流速上柱，然后用水沖洗，沖洗流速為2BV/h，棄去流出液，用70％乙醇溶劑0.8 1倍流速解析，換上80％乙醇溶劑后當(dāng)流出液流出后開(kāi)始接收解析液；(3)處理解析液將得到的解析液減壓濃縮以除去乙醇，然后將濃縮液再加去離子水調(diào)整固形物含量，進(jìn)行噴霧干燥，得到植物黃酮化合物產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法提取植物黃酮化合物的方法，其特征在于所述復(fù)合酶 中果膠酶纖維素酶=6-7 3-4，為質(zhì)量比。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酶法提取植物黃酮化合物的方法，步驟如下(1)浸提，其中酶解水提一遍，醇提二遍；(2)上柱純化；(3)處理解析液，得到植物黃酮化合物產(chǎn)品。本發(fā)明以生物技術(shù)理論、天然產(chǎn)物化學(xué)理論和技術(shù)、國(guó)際藥物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為指導(dǎo)，制定生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)方案，確定適宜的酶法提取工藝和黃酮糖苷生物轉(zhuǎn)化工藝，獲得高生物效價(jià)的產(chǎn)物。確定復(fù)合多種酶制劑，優(yōu)化最佳轉(zhuǎn)化條件，提高黃酮的生物轉(zhuǎn)化效率。制定大孔吸附樹(shù)脂的吸附技術(shù)方案，用于工業(yè)化生產(chǎn)，提高產(chǎn)品中苷元型黃酮的含量。
文檔編號(hào)C12P17/06GK101967137SQ20101028933
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2010年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者周慶禮, 王維君, 陳文東 申請(qǐng)人:天津市食品加工工程中心