專利名稱：一種水稻根圍伯克氏菌及其在防治水稻紋枯病中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種細菌菌株，尤其涉一種水稻根圍伯克氏菌及其在防治水稻紋枯病 中的應用。
背景技術：
水稻作為一種重要的糧食作物，許多病害都能導致其嚴重減產(chǎn)。其中，由立枯絲核 菌引起的水稻紋枯病是一種毀滅性病害，在世界上水稻產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，與稻瘟病、白葉枯病 和細條病構成水稻四大病害。水稻紋枯病又稱“云紋病”，多在高溫高濕條件下發(fā)生。據(jù)統(tǒng) 計，目前全國水稻紋枯病發(fā)病面積達1333. 33萬hm2以上，占水稻總栽種面積的40%。發(fā)病 水稻植株莖稈、葉鞘干枯至腐爛，不能抽穗，或抽穗的秕谷較多，結(jié)實率下降，粒重下降，甚 至植株倒伏。發(fā)病田塊一般導致24% -50%的經(jīng)濟損失。長期大量使用農(nóng)藥造成自然生態(tài)環(huán)境污染及稻米農(nóng)藥殘留的問題已引起人們的 高度重視，迫切需要尋求一條安全防治水稻紋枯病的新途徑。生物防治以其無污染、無殘 留、無生態(tài)毒性和安全性好等優(yōu)點在植物病害的防治中發(fā)揮著越來越重要的作用。目前，包 括洋蔥伯克氏菌在內(nèi)的許多根圍細菌已被報道能抑制水稻紋枯病菌的生長。洋蔥伯克氏菌廣泛分布于自然環(huán)境中，是一組表型相近、基因型不同的細菌群，稱 為洋蔥伯克氏菌群，簡稱Bcc。它是一種廣泛存在于土壤、水和植物表面，與醫(yī)院感染病密切 相關的革蘭氏陰性細菌，20世紀50年代作為植物病原菌被認識。Bcc菌具有多種生物學功 能，它既能作為生防菌有效防治多種植物土傳病害，如腐霉病害；同時也是一些植物的致病 菌，如可引起洋蔥鱗莖腐爛；此外Bcc中有些菌還是人體條件致病菌，如洋蔥伯克氏菌在醫(yī) 院可引起多種感染病。因此，利用洋蔥伯克氏菌菌株防治水稻紋枯病具有一定的潛在風險， 有必要尋找一種更安全、高效的伯克氏菌應用于防治水稻紋枯病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株防治水稻紋枯病的伯克氏菌R456，該菌株在離體試驗中對水稻 紋枯病菌生長有較強的抑制作用，在溫室和大田試驗中，對水稻紋枯病也表現(xiàn)出較好的防 治效果。一株防治水稻紋枯病的伯克氏菌菌株，經(jīng)鑒定命名為伯克氏菌(Burkholderia SeminaliS)R456，保藏于位于武漢市珞珈山武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)， 保藏日期為2010年8月20日，保藏號為CCTCC NO =M 2010207。伯克氏菌R456主要表型及生物學特征如下在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)條件 下，菌落圓形、黃色、光滑、凸起、全緣。菌體革蘭氏染色陰性，嚴格需氧型，過氧化氫酶和氧 化酶都為陽性。用該菌株的細胞懸浮液接種煙葉，24h內(nèi)能夠?qū)е碌湫偷倪^敏性反應，但接 種水稻幼苗則不表現(xiàn)出明顯的病害癥狀。本發(fā)明還提供了一種含有上述伯克氏菌R456的菌懸液，制備該菌懸液可以選用 常用細菌培養(yǎng)基，優(yōu)選采用LB(即普通培養(yǎng)基，含酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15 20g，水1000ml，PH 7. 4 7. 6)培養(yǎng)基，伯克氏菌R456含量優(yōu)選為IO7 108CFU/ml， 可以直接應用于防治水稻紋枯病。本發(fā)明伯克氏菌R456菌株在離體、溫室及田間試驗中對水稻紋枯病菌的生長有 較強的抑制作用，能有效防治水稻紋枯病。相對于其它洋蔥伯克氏菌，本發(fā)明伯克氏菌R456對水稻紋枯病菌生長表現(xiàn)出更 好的抑制效果。此外，本發(fā)明伯克氏菌R456具有較低的蛋白酶活性，對離體洋蔥和水稻幼 苗無明顯致病性，適宜用作防治水稻紋枯病的生防菌，使用安全性較高。


圖1為依據(jù)本發(fā)明伯克氏菌R456和Bcc組成種的相關菌株的recA基因建立的分 子系統(tǒng)發(fā)育樹。圖2為本發(fā)明伯克氏菌R456和菌株B. cepacia LMG 1222τ接種到腦心浸液牛奶 培養(yǎng)基24h和48h后蛋白酶活性變化情況；圖3為本發(fā)明伯克氏菌R456不同接種時間對水稻紋枯病菌菌絲生長的影響；圖4為本發(fā)明伯克氏菌R456對接種水稻紋枯病菌的水稻幼苗病害發(fā)生率的影 響；圖5為本發(fā)明伯克氏菌R456對接種水稻紋枯病菌的水稻幼苗病斑直徑的影響；
具體實施例方式菌株B. cepacia LMG 1222τ由比利時根特大學世界菌種保藏中心提供。伯克氏 菌R456和B. c印acia LMG 1222τ在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(即NA培養(yǎng)基，含牛肉浸膏l(xiāng)g，蛋白 胨5g，酵母膏2g，氯化鈉5g，蔗糖10g，瓊脂20g，水1000ml)上培養(yǎng)，最適培養(yǎng)生長溫度為 300C。水稻紋枯病菌分離自中國浙江省感病的水稻，該菌株為試驗材料，無特異性要求，于 28 V下在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。實施例1分離純化菌株從浙江省杭州市一塊水稻田采集水稻根際周圍10-20cm的表層土壤，裝入無菌聚 乙烯塑料袋中，封口。稱取土壤10g，加入裝有90ml無菌水的三角瓶中制得懸液，180r/min 震蕩30min，然后從所得懸液中吸取5ml加入有45ml無菌水的三角瓶中，依次梯度稀釋到第 5個三角瓶為止，得到IO-1UO-2UO-3UO-4和ΙΟ"5的稀釋液。分別取100 μ 1 10_4和ΙΟ"5的稀 釋液涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，每個稀釋度重復3次，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后， 挑取培養(yǎng)特征相異的單個菌落，經(jīng)培養(yǎng)純化后作為供試菌株。通過供試菌株對水稻紋枯病 菌的抑菌圖實驗，篩選出抑菌效果最好的一株菌株。該菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)條件下，菌落圓形、黃色、光滑、凸起、全緣。 菌體革蘭氏染色陰性，嚴格需氧型，過氧化氫酶和氧化酶都為陽性。用該菌株的細胞懸浮 液接種煙葉，24h內(nèi)能夠?qū)е碌湫偷倪^敏性反應，但接種水稻幼苗則不表現(xiàn)出明顯的病害癥 狀，如下對該菌株進行鑒定。實施例2脂肪酸鑒定具體試驗方法如下1、將菌株置于28°C下，在胰化酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基(含胰酪化蛋白胨15g，大
4豆蛋白胨5g，氯化鈉5g，瓊脂15g，水1000ml)上培養(yǎng)24h ；2、使用脂肪酸鑒定系統(tǒng)MIDI測定上述菌株的脂肪酸組成；3、根據(jù)測定的菌株脂肪酸組成與MIDI鑒定數(shù)據(jù)庫TSBA50 5. 00版本的對比來鑒
定菌株。根據(jù)微生物脂肪酸鑒定系統(tǒng)的指導手冊，相似值達到0. 6以上的說明匹配度好， 而相似值在0. 4-0. 6的說明二者并非同一個種。與微生物脂肪酸鑒定系統(tǒng)中需氧細菌數(shù)據(jù) 庫中的種對比，發(fā)現(xiàn)該菌株與Burkholderiagladioli的相似值為0. 72，與洋蔥伯克氏菌的 相似值為0. 56。實施例3 Biolog碳源利用鑒定利用Biolog法檢測了菌株對碳源的利用率，具體方法如下將菌株置于胰化酪蛋 白大豆瓊脂培養(yǎng)液中，在28°C條件下培養(yǎng)24h，利用Biolog革蘭氏陰性板檢測了該菌株對 碳源的利用率，并將結(jié)果與Biolog鑒定數(shù)據(jù)庫GN 4. 01進行對比。結(jié)果表明該菌株可以利用乳糖和蜜二糖，鑒定該菌株為洋蔥伯克氏菌，相似指數(shù) 達到0. 65。實施例4 recA基因系統(tǒng)分析對該菌株和已發(fā)表的38個Bcc種的recA基因進行了系統(tǒng)性分析，用MEGA軟件4. O 版本中的臨位連接法建立分子系統(tǒng)發(fā)育樹并進行分子進化分析，銅綠假單胞用做外群。通過對recA全基因序列分析，我們將該菌株與GenBank中已收錄的Bcc其他已知 種進行了對比。系統(tǒng)發(fā)育分析表明該菌株和B. seminalis聚集在同一組群內(nèi)而與Bcc的其 他種相互分離(見圖1)，上述分析都表明該菌株是B. seminalis的成員之一，名為伯克氏菌 (B. Seminalis) R456。保藏于位于武漢市珞珈山武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，保藏日期為2010年8月20日，保藏號為CCTCC NO M 2010207。實施例5伯克氏菌R456和B. c印acia LMG 1222τ對離體洋蔥和水稻幼苗的致病 性本試驗檢測了伯克氏菌R456和B. c印acia LMG 1222τ對離體洋蔥和水稻幼苗的 致病性，具體試驗方法如下1、將洋蔥片放置在培養(yǎng)皿中，用滅菌的吸管尖端在洋蔥鱗片內(nèi)側(cè)刺成傷口，并接 種上5μ 1經(jīng)營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)的菌株懸浮液(107CFU/ml)；2、將接種過的洋蔥片置于30°C下培養(yǎng)5d ；3、用牙簽針刺檢測洋蔥片的腐爛程度，并記錄；4、伯克氏菌R456和B. cepacia LMG 1222τ的接種試驗各重復3次，對照試驗用等
量營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基進行接種。同樣，用針刺接種的方法檢測了伯克氏菌R456和B. cepacia LMG1222T對水稻幼 苗的潛在致病性。試驗結(jié)果表明菌株B. c印acia LMG 1222τ能夠?qū)е码x體洋蔥鱗莖腐爛，而伯克 氏菌R456對離體洋蔥的致病性較弱，這與前人研究結(jié)果一致，在中國引起洋蔥球莖內(nèi)部細 菌性腐爛病的病原菌為洋蔥伯克氏菌。然而在接種水稻幼苗的試驗中，伯克氏菌R456和 B. cepacia LMG 1222τ都不能導致水稻幼苗產(chǎn)生明顯的病害癥狀。
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實施例6伯克氏菌R456和B. c印acia LMG 12221蛋白酶活性檢測許多研究已發(fā)現(xiàn)，蛋白酶活性高低與洋蔥伯克氏菌的致病能力有關。蛋白酶活性 高，則潛在致病能力強，對植物具有一定的風險；蛋白酶活性低，則潛在致病能力弱，對植物 的風險低或不具有風險。通過以下方法檢測了伯克氏菌R456和B. cepacia LMG 1222τ的蛋白酶活性用 滅菌牙簽分別將這兩株菌株接種到腦心浸液牛奶瓊脂培養(yǎng)基上，在30°C培養(yǎng)條件下，接種 24h和48h后，通過測量接種位置周圍水解空白區(qū)域的直徑來檢測菌株產(chǎn)蛋白酶的活性，直 徑越大，產(chǎn)蛋白酶活性越高。每個處理重復4次，整個試驗重復2次。腦心浸液牛奶瓊脂培養(yǎng)基根據(jù)以下方法配制1、溶解18. 5g的腦心浸液和7. 5g的瓊脂于400ml的水中；2、備好IOOml 15%濃度的脫脂乳；3、將分開滅過菌的兩種溶液在60°C下混合，每個培養(yǎng)皿中倒入IOml培養(yǎng)基。試驗結(jié)果表明接種24h后，菌株B. cepacia LMG 1222τ在腦心浸液牛奶瓊脂培養(yǎng) 基上圍繞菌落形成的水解區(qū)域直徑為0. 5mm，而伯克氏菌R456則未形成可見的水解區(qū)域； 接種48h后，前者水解區(qū)域直徑為2. 3mm，后者的為0. 8mm(見圖2)。研究結(jié)果表明，洋蔥病 原菌B. cepaciaLMG 1222τ表現(xiàn)出較強的溶解蛋白質(zhì)活性，而伯克氏菌R456表現(xiàn)出較低的 蛋白酶活性。結(jié)合之前離體洋蔥和水稻幼苗的致病性試驗，說明伯克氏菌R456對植物不具 有風險，作為生防菌防治水稻紋枯病的安全性較高。實施例7離體試驗在離體條件下測定了伯克氏菌R456對水稻紋枯病菌生長的拮抗作用，具體方法 如下1、于28°C下在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)水稻紋枯病菌；2、ld后，用滅菌打孔器打取直徑0.5cm的菌落，浸于濃度108CFU/ml的伯克氏菌 R456懸浮液中；3,30s后轉(zhuǎn)移至新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，于28°C下培養(yǎng)；4、分別于培養(yǎng)后10h、20h和30h測量菌落直徑；5、用滅菌蒸餾水處理做對照試驗，每個處理重復5次，整個試驗重復3次。試驗結(jié)果表明在沒有伯克氏菌R456懸浮液處理的情況下，水稻紋枯病菌在接種 IOh后菌落平均直徑為0. 86cm，接種20h禾口 30h后分別為4. 37cm和7. 63cm(見圖3)。水稻 紋枯病菌菌落直徑隨著培養(yǎng)時間的增加而增長。整體上而言，伯克氏菌R456懸浮液處理嚴 重抑制了水稻紋枯病菌菌絲的生長。經(jīng)伯克氏菌R456懸浮液處理后，水稻紋枯病菌在接種 IOh后，菌絲的生長完全被R456所抑制；在接種20h和30h后，菌落平均直徑分別為2. 07cm 和4. 36cm,與對照相比差異顯著，菌絲相對于對照菌絲分別被抑制52. 63%和42. 86% (見 圖3)。實施例8溫室試驗在溫室條件下測定了伯克氏菌R456對水稻紋枯病的發(fā)生率和嚴重程度的抑制作 用。具體方法如下1、將水稻種子播種于盛有稻田土壤的塑料盆內(nèi)，每盆10粒種子，每處理重復4 次；
2、伯克氏菌R456在營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并調(diào)節(jié)濃度至108CFU/ml ；3、3個星期后，用伯克氏菌R456懸浮液噴灑接種水稻幼苗，用等量滅菌蒸餾水噴 灑做對照試驗；4、風干后，用滅菌打孔器打取培養(yǎng)了 2d，直徑為0. 5cm的水稻紋枯病菌菌落接種 到每株水稻幼苗從上向下數(shù)的第2片葉的基部；5、用塑料袋覆蓋所有接種過的幼苗24h以保持高濕環(huán)境，在生長箱中培養(yǎng)，溫度 設置為28°C，相對濕度90%，每天光照黑暗交替，光照16h，黑暗8h ；6、接種后2d，觀察和記錄病害發(fā)生率和病斑的平均直徑大小，整個試驗重復2次。試驗結(jié)果表明在未接種伯克氏菌R456的對照處理中，水稻幼苗在接種紋枯病菌 2d后表現(xiàn)出病害癥狀，經(jīng)伯克氏菌R456處理后，病害癥狀出現(xiàn)推遲了 Id。在對照處理時，水 稻幼苗在接種后7d病害發(fā)病率達到100%，接種后7d和IOd分別進行測量，其平均病斑直 徑分別為13. 64cm和16. 96cm，分別占葉長的79. 47%和96. 84% (見圖4和圖5)；然而，經(jīng) 伯克氏菌R456處理后，水稻幼苗接種7d和IOd后病害發(fā)生率分別減少57. 50%和57. 21%， 病斑直徑分別減少76. 47%和76. 33% (見圖4和圖5)，與對照相比差異顯著。并且經(jīng)伯克 氏菌R456處理后，水稻紋枯病的發(fā)生率和病斑直徑在接種IOd后保持穩(wěn)定。未經(jīng)接種紋枯 病病菌的水稻幼苗則不表現(xiàn)病害癥狀。實施例9 田間試驗設計田間小區(qū)試驗檢測伯克氏菌R456對水稻紋枯病的田間防治效果。試驗在浙 江臨安市水稻田進行，供試水稻田為歷年發(fā)病田塊，試驗地肥力中等，水利排灌設施一般。 根據(jù)歷年來該田塊水稻紋枯病的發(fā)生情況，在水稻紋枯病發(fā)生初期，飽和噴霧接種已培養(yǎng) 48h、濃度約為108CFU/ml的伯克氏菌R456的菌懸液，著重噴水稻莖基部，以均勻噴濕為度， 清水噴霧作為對照。接種后14d和28d各調(diào)查病情1次，取兩次調(diào)查的平均值。試驗重復 3次，取平均值。以株為單位，5點取樣，每點調(diào)查相連的5叢，共25叢，記錄調(diào)查總株數(shù)、病株率和 病級數(shù)。根據(jù)水稻葉鞘及葉片發(fā)病癥狀進行病情分級，病情分級標準如下0級全株無病，植株健康；1級第4葉片及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病(以劍葉為第1片葉)；3級第3葉片及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病；5級第2葉片及其以下各葉鞘或葉片發(fā)病；7級劍葉葉片及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病；9級全株發(fā)病、提早枯死。病情指數(shù)=Σ (各級病葉數(shù)X相對病級數(shù))X 100/總調(diào)查的植株數(shù)X9防治效果(%) = (CK-PT) X 100/CK式中，CK和PT分別為對照區(qū)及菌懸液處理區(qū)的病情指數(shù)，防治效果的計算采用的 是處理前未調(diào)查病情基數(shù)的公式。試驗結(jié)果表明對照區(qū)紋枯病發(fā)生率平均為68. 7%，病情指數(shù)平均為6. 25 ；而經(jīng) 伯克氏菌R456懸浮液處理的試驗區(qū)，病情指數(shù)平均為1.96，平均防治效果為68. 64%。伯 克氏菌R456在田間環(huán)境中對水稻紋枯病菌仍具有較好的抑制作用，能夠在水稻實際生產(chǎn) 中應用于防治水稻紋枯病。
離體試驗、溫室試驗及田間試驗的結(jié)果基本一致，顯示伯克氏菌R456對水稻紋枯 病菌生長有較強的抑制作用，這表明，直接拮抗作用或許是伯克氏菌R456生物防治水稻紋 枯病的主要機制。
權利要求
一株伯克氏菌菌株，其特征在于命名為伯克氏菌(Burkholderiaseminalis)R456，保藏號為CCTCC NOM 2010207。
2.一種含有權利要求1所述的伯克氏菌R456的菌懸液。
3.根據(jù)權利要求1所述的菌懸液，其特征在于所述的菌懸液中伯克氏菌R456含量為 IO7 108CFU/ml。
4.根據(jù)權利要求1所述的菌懸液，其特征在于制備菌懸液所用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng) 基。
5.權利要求1所述的伯克氏菌R456在防治水稻紋枯病中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株防治水稻紋枯病的伯克氏菌，經(jīng)鑒定命名為伯克氏菌R456，保藏于位于武漢市珞珈山武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期為2010年8月20日，保藏號為CCTCC NOM2010207。本發(fā)明伯克氏菌R456可在離體、溫室及田間條件下對水稻紋枯病菌的生長產(chǎn)生較強烈的抑制作用，對水稻紋枯病表現(xiàn)出較好的防治效果。與洋蔥伯克氏菌相比，伯克氏菌R456對植物不具有風險，作為生防菌防治水稻紋枯病安全性較高，表明該根圍細菌能夠作為生防菌防治水稻紋枯病。
文檔編號C12R1/01GK101985606SQ20101029058
公開日2011年3月16日 申請日期2010年9月25日 優(yōu)先權日2010年9月25日
發(fā)明者劉寶平, 吳志毅, 李斌, 石雨, 謝關林, 陶中云 申請人:浙江大學